Ce protocole décrit la génération de souris du système immunitaire humain, ou HIS pour les études immuno-oncologiques précliniques. Les modèles de cancer de la souris sont limités dans leur diversité et se traduisent mal à la clinique. Cette technique sert de modèle préclinique pour les études d’immunothérapie en évaluant le traitement des tumeurs humaines chez une souris dotée d’un système immunitaire humain.
Le modèle murin humanisé peut être utilisé pour étudier de multiples aspects de l’immunologie humaine, y compris les réponses à de nombreuses infections ou cancers du système immunitaire humain. L’acquisition d’une source fiable et robuste de sang de cordon ombilical et le maintien de la santé de la colonie de souris immunodéficientes peuvent être difficiles. Une expertise en cytométrie de flux et en analyse immunologique est essentielle.
Kristina Larsen, une professionnelle des services de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, remettez en suspension la pastille de cellules CD34-positive isolée du sang de cordon dans 300 microlitres de tampon séparateur de cellules magnétiques par une fois 10 à huit cellules. Ajouter 100 microlitres de réactif bloquant le FCR par une fois 10 aux cellules huitièmes, suivies de 100 microlitres de billes magnétiques CD34-positives par une fois 10 aux cellules huitièmes, et incuber à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.
Ensuite, ajoutez cinq millilitres de tampon séparateur de cellules magnétiques par une fois 10 aux huitièmes cellules, et faites tourner à 360 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Répétez l’étape de lavage et remettez en suspension la pastille dans 500 microlitres par 100 millions de cellules de tampon séparateur de cellules magnétiques dans un tube conique de 15 millilitres étiqueté non fractionné. Étiquetez deux autres tubes de 15 millilitres CD34-négatif et CD34-positif Placez les trois tubes sur une grille de refroidissement.
Séparer les cellules à l’aide du programme de sélection positive à deux colonnes sur un séparateur automatique de cellules magnétiques dans une enceinte de biosécurité. Ensuite, pour l’expansion et la congélation des cellules souches humaines CD34 positives, préparez du sang de cordon ombilical ou un milieu CB comme décrit dans le manuscrit et passez à travers un filtre de 0,22 micron. Resuspendre les cellules CD34-positives à 100 000 par millilitre de milieu CB et incuber à 37 degrés Celsius.
Le troisième jour, ajouter un volume égal de milieu CB sans cytokines dans la fiole. Le cinquième jour, récoltez les cellules CD34 positives expansées. Pipeter la suspension cellulaire de haut en bas et recueillir dans un tube conique de 50 millilitres.
Ajouter suffisamment de milieu CB pour couvrir le fond de la fiole. À l’aide d’un grattoir à cellules, gratter tout le fond de la fiole. Rassemblez tous les médias dans le même tube de 50 millilitres et centrifugez.
Remettez les cellules en suspension dans deux millilitres de milieu CB et centrifugez. Aspirer le milieu jusqu’au granulé et remettre le granulé en suspension dans un milieu de congélation. Ensuite, commencez la préparation des cellules CD34 positives trois heures après l’irradiation des petits.
Réchauffez 10 millilitres de média CB dans un tube de 50 millilitres. Récupérer un flacon de cellules CD34 positives expansées et congelées in vitro pour quatre à six petits à injecter. Dégeler rapidement à 50 à 55 degrés Celsius jusqu’à ce qu’une petite quantité de glace soit visible, et ajouter les cellules au milieu CB réchauffé.
Utilisez un millilitre de milieu pour rincer chaque flacon et faites tourner les cellules à 360 g pendant 12 minutes à quatre degrés Celsius. Aspirer le milieu avec précaution. Remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu CB et comptez les cellules.
Encore une fois, centrifugez les cellules, aspirez le milieu et remettez la pastille en suspension dans 100 microlitres de PBS stérile par n plus un chiot à injecter, ce qui donne 250 000 à 450 000 cellules CD34-positives par souris. Pour l’isolement PBMC du sang de souris, mélanger l’héparine sanguine en pipetant doucement de haut en bas, et superposer lentement sur 500 microlitres de 1,077 gramme par millilitre de gradient de densité en prenant soin de ne pas perturber l’interface. Centrifuger le tube à 1 220 g pendant 20 minutes à température ambiante sans interruption.
Retirez autant de cellules que possible de la couche leucocytaire avec une pipette de 200 microlitres et ajoutez-les au nouveau tube de 1,5 millilitre contenant 750 microlitres de milieu de récolte. Centrifuger à 360 g pendant 11 minutes. Aspirer le milieu à 50 microlitres et remettre en suspension le granulé dans 750 microlitres de milieu de récolte.
Acquérir les données pour 100 microlitres de chaque échantillon sur un cytomètre en flux. Importez ensuite le fichier fcs dans le logiciel d’édition des données de flux et appliquez une porte polygonale à un tracé FSC-A par rapport à SSC-A. Changez les axes en FSC-A par rapport à FSC-H et grillez les cellules sur la diagonale linéaire, à l’exclusion des doublets qui dépassent de la ligne.
Sélectionnez ces cellules et changez les axes en hCD45 par rapport à mCD45. Appliquez une porte polygonale à la population hCD45-positive et appliquez le nom humain. Appliquez une porte polygonale à la population mCD45-positive et appliquez le nom souris.
Créez une statistique de comptage pour les populations humaines et de souris. Ensuite, sélectionnez la population humaine et changez les axes en CD19 par rapport à CD3. Appliquez une porte polygonale aux cellules CD19 positives et nommez-les cellules B.
Appliquez une porte polygonale à la population CD3-positive et nommez-la lymphocytes T. Ensuite, appliquez une porte polygonale à la population doublement négative et nommez-la non-TB. Sélectionnez la population de lymphocytes T et changez les axes en CD4 par rapport à CD3.
Appliquez une porte polygonale à la population CD4-positive et nommez-la CD4-positif. Appliquez une porte polygonale à la population CD4 négative et nommez-la CD8. Sélectionnez la population non tuberculeuse et changez les axes en CD56 par rapport à myéloïde.
Appliquez une porte polygonale à la population totale CD56-positive et nommez-la cellules NK. Ensuite, appliquez une porte polygonale à la population CD56-négatif et myéloïde-positif, et nommez-la myéloïde. Créez un tableau pour les statistiques de pourcentage et de comptage de toutes les populations et exportez-le dans une feuille de calcul.
Calculer le pourcentage de chimérisme hCD45 en utilisant la formule indiquée. Après avoir développé des cellules tumorales chez la souris et administré des traitements médicamenteux, récoltez les tissus. Placez la souris sur un panneau de dissection en mousse avec des broches pour les maintenir en place et les bras et les jambes étendus à 45 degrés.
Faites une incision au milieu du torse en commençant près du bassin et en s’étendant jusqu’au menton. Tirez la peau sur le bord et maintenez-la en place avec des épingles. Extraire les ganglions lymphatiques à l’aide de pinces fines dans l’ordre axillaire, cervical, mésentérique, inguinal et hiatal.
Placez les ganglions lymphatiques d’un côté de la lame de verre dépoli dans une boîte de Petri dans huit millilitres de milieu de récolte. En tenant les lames à des angles perpendiculaires avec les bords givrés vers l’intérieur, appuyez doucement sur les tissus jusqu’à ce que le contenu cellulaire soit libéré. Rincez la lame plusieurs fois en les écartant et en les assemblant pour libérer le maximum de cellules.
Rassemblez les cellules avec une pipette en verre de cinq pouces et filtrez-les à travers une pipette de neuf pouces bouchée en coton dans un tube conique étiqueté de 15 millilitres. Ensuite, extrayez la tumeur du flanc ouvert en tenant la tumeur avec une pince tout en coupant lentement les bords de la tumeur avec des ciseaux de dissection. Peser la tumeur et retirer 1/4 de la tumeur pour le traitement de l’ARN et de l’immunohistochimie.
Placez les 3/4 restants de la tumeur dans un plat de six centimètres et hachez-le en morceaux d’un millimètre à l’aide d’une lame de scalpel. Transférer les morceaux tumoraux dans un tube de dissociation. Rincez ensuite le plat avec un milieu TIL incomplet et ajoutez-le au tube.
Ajouter la préparation de collagénase et dissocier le tissu en utilisant une dissociation mécanique à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à une heure. Passez la suspension sur un filtre de 100 microns dans un tube conique de 50 millilitres et rincez le filtre avec 10 millilitres de média complet TIL. Centrifuger et remettre en suspension la pastille dans juste assez de milieu de récolte avec DNase, afin que la suspension de cellules puisse facilement passer à travers une pointe de pipette P1000 et enregistrer le volume pour l’analyse en aval.
Dans PDX CRC 307P, le traitement combiné a ralenti la croissance de la tumeur, déterminée par les volumes de croissance tumorale au fil du temps, le poids de la tumeur et le taux de croissance spécifique. PDX CRC 307M testé dans une cohorte différente de souris a été moins affecté par le même traitement combiné chez les souris HIS BRGS. Sur la base du chimérisme global hCD45-positif humain et hCD3-positif des cellules T humaines dans le sang avant l’implantation tumorale, les deux paramètres ont augmenté dans le système immunitaire périphérique et le TIL en combinaison avec des souris CRC 307P traitées, mais pas le modèle CRC 307M.
L’étude des lymphocytes T humains a révélé plus de lymphocytes T activés dans les tumeurs CRC 307P, mais pas dans la lymphe de souris traitées en combinaison. En outre, il y avait plus de lymphocytes T CD8 positifs à mémoire effectrice et moins de lymphocytes T TIM-3-positifs dans la combinaison de tumeurs CRC 307P traitées. En revanche, cette différence n’a pas été notée dans le modèle CRC 307M.
De plus, aucun changement dans la fréquence des populations de lymphocytes T cytotoxiques n’a été observé chez les souris traitées en association, bien que des lymphocytes T cytotoxiques plus élevés aient été observés chez les souris non traitées. Le traitement combiné n’a pas affecté la fréquence des Tregs dans les organes lymphatiques du CRC 307P ou les tumeurs, bien que les données du CRC 307M aient montré une tendance à la réduction des Tregs. Les changements liés au système immunitaire dans les cellules tumorales ont été élevés à l’aide de la cytométrie en flux.
Une augmentation de l’expression du CMH de classe I et de classe II a été observée sur les cellules tumorales CRC 307P excisées de souris HIS BRGS traitées en association. Dans le modèle CRC 307M, le même traitement médicamenteux induisait l’expression HLA de classe II sur les cellules tumorales. De même, le traitement combiné a entraîné une augmentation de l’expression de-L1 sur les cellules tumorales CRC 307P positives à EpCAM.
Enfin, les corrélations des réponses immunitaires avec la croissance tumorale ont été étudiées. L’augmentation des lymphocytes T CD4-positifs a montré une corrélation significative avec une croissance tumorale plus faible, et plus particulièrement les lymphocytes T activés HLA-DR-positifs dans la combinaison de souris HIS traitées. Technique stérile tout en isolant les cellules CD34-positives, car les souris sont extrêmement immunodéficientes.
Le chimérisme qui en résulte est variable à l’intérieur et entre les donneurs de sang de cordon, et les lymphocytes T ont la plus grande variation. Des combinaisons d’immunothérapie illimitées peuvent être effectuées, ainsi que des études cinétiques mécanistiques et de dosage de médicaments, par exemple, la délétion des lymphocytes T CD8 pour confirmer leur rôle. Il est important de noter que les toxicités liées aux médicaments peuvent également être étudiées.
Il a fourni un modèle préclinique plus pertinent et accessible pour tester les immunothérapies humaines en vue de leur traduction en clinique. Plusieurs essais cliniques sont actuellement en cours sur la base de ces données.
