Ce protocole permet l’expansion et la manipulation génétique de cellules souches hématopoïétiques fonctionnelles de souris, permettant une compréhension plus approfondie de la biologie des cellules souches hématopoïétiques et de l’hématopoïèse. L’avantage de cette technique est qu’elle peut soutenir les cellules souches hématopoïétiques en culture ex vivo à long terme et permettre la manipulation génétique pour interroger la génétique de l’hématopoïèse. Ce système de culture fournit une technologie de plate-forme pour diverses études sur la biologie des cellules souches hématopoïétiques et l’hématopoïèse, y compris les études génétiques, moléculaires et biochimiques.
Le tableau de dépannage répertorie les causes et les solutions aux difficultés courantes rencontrées avec cette technique. Il est beaucoup plus facile et plus efficace de montrer comment extraire correctement les cellules de la moelle osseuse et effectuer des changements de médias complets plutôt que de lire à ce sujet. Pour commencer l’extraction de cellules souches hématopoïétiques, ou CSH, utilisez des lingettes délicates non pelucheuses pour nettoyer les os fraîchement isolés de souris correctement euthanasiées.
Retirez les muscles et la moelle épinière des os avant de les ajouter à un mortier contenant environ trois millilitres de PBS. À l’aide d’un pilon, écrasez les os sans les broyer pour minimiser les forces de cisaillement. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de calibre 19 fixée à une seringue de 5 millilitres, briser les gros fragments de moelle osseuse libérés dans le PBS et transférer la suspension à travers un filtre de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres.
Une fois la suspension transférée, répétez le processus avec du PBS frais jusqu’à ce que les os soient blanchis. Visez un volume final d’environ 30 millilitres par souris et 50 millilitres pour deux souris pour blanchir les os jusqu’à ce que plus aucune moelle ne soit visible. Préparez-vous à l’enrichissement de la colonne en plaçant une colonne de filtration magnétique dans l’aimant d’un séparateur de colonne magnétique avec un filtre de 50 microns sur le dessus et un tube conique de 15 millilitres en dessous.
Ensuite, après avoir traité les cellules avec un anticorps anti-c-Kit allophycocyanine et des microbilles magnétiques allophycocyanines, faites passer trois millilitres de PBS stérile à travers le filtre de 50 microns et la colonne de filtration. Une fois que le PBS a traversé, passez la suspension cellulaire à travers la colonne, suivie de trois lavages de trois millilitres de PBS froid à chaque fois. Après chaque lavage, attendez que la colonne cesse de couler avant d’ajouter du PBS pour le prochain lavage.
Ensuite, retirez la colonne de l’aimant et placez-la sur un nouveau tube de 15 millilitres et ajoutez cinq millilitres de PBS froid dans la colonne avant d’y installer le piston de colonne et d’éluer les cellules en poussant le piston. Suivez le protocole décrit dans le texte pour préparer suffisamment de milieu HSC pour le nombre souhaité de cellules ou de puits afin d’ensemencer 0,5 à 1 million de cellules par millilitre. Ensuite, faites tourner les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices enrichies en c-Kit, ou HSPC, et remettez la pastille en suspension dans le milieu HSC fraîchement préparé à la densité cellulaire souhaitée.
Transférer les cellules sur des plaques recouvertes de fibronectine ou chargées en surface négative, en maintenant un volume approprié. Placez les cellules dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après avoir retiré délicatement la plaque de l’incubateur de culture tissulaire sans perturber les cultures cellulaires, utilisez une pipette ou une pompe à vide pour aspirer lentement environ 90 à 95% du milieu du ménisque liquide de chaque puits.
Évitez d’aspirer le milieu à partir de la base du puits. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu frais préchauffé à 37 degrés Celsius dans le puits. Remettez la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire et changez de milieu tous les deux ou trois jours jusqu’à ce que l’expérience le nécessite.
Après avoir remis les cellules en suspension dans un tampon de nucléofection, transférer immédiatement la suspension cellulaire dans le tube de PCR contenant la ribonucléoprotéine complexée, et mélanger doucement en pipetant lentement de haut en bas. Maintenant, transférer le mélange dans une cuvette d’électroporation de volume approprié très lentement, en maintenant un mouvement fluide continu pour éviter de former des bulles d’air à l’intérieur de la cuvette. Ensuite, sur l’électroporateur, sélectionnez la position des puits en cours d’électroporage.
À l’aide de l’écran tactile, sélectionnez le programme de type de cellule comme humain CD34 positif ou tapez le code d’impulsion EO100, puis appuyez sur le bouton OK. Transférez la cuvette dans l’électroporateur et appuyez sur le bouton Start de l’écran tactile pour lancer l’électroporation. Immédiatement après l’électroporation, ajouter cinq fois le volume de réaction du milieu de culture à la cuvette.
Maintenant, transférez doucement les cellules dans la plaque préparée et replacez la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire. Après avoir effectué un changement de milieu comme démontré précédemment, prélever 10 microlitres de cellules et les compter en utilisant la solution de Turk à une dilution de 1:2 avec un hémocytomètre. Replaquer la dose requise de cellules dans des plaques recouvertes de fibronectine pour la transduction, et séparément, plaquer les cellules témoins négatives non transduites.
Ajoutez ensuite le vecteur lentiviral à chaque cellule contenant du puits, en maintenant une dose de 20 unités de transduction par cellule pour atteindre une efficacité de transduction d’environ 30%. Cependant, déterminer empiriquement la dose de vecteur lentiviral en fonction des exigences expérimentales. Enfin, remettez les cellules dans l’incubateur de culture tissulaire pendant six heures.
Effectuez une modification de support comme décrit précédemment. Le tri cellulaire activé par fluorescence des CSH enrichies en kit c a produit environ 0,2 % des cellules qui étaient CD150-positives, CD34-négatives, c-kit-positives, Sca1-positives et lignées négatives. Après quatre semaines de culture HSPC, les fractions CD201-positive, CD150-positive, c-Kit-positive, Sca1-positive et lignée négative se sont avérées être d’environ 10% Après la transduction avec un vecteur lentiviral exprimant la GFP, les cellules GFP-positives étaient d’environ 30%Lorsqu’elles étaient confluentes, la densité attendue des cultures était d’environ 2 millions de cellules par millilitre.
Environ 50 % de la mort cellulaire a été observée dans les 24 à 48 heures précédant le premier changement de milieu. Après une semaine, cependant, le nombre de cellules est revenu à 80 à 100% du nombre de cellules ensemencées. Des changements de milieux précis utilisant des milieux frais et préchauffés sont essentiels pour la stabilité à long terme de cette méthode de culture HSC.
Depuis la publication de la méthode originale en 2019, le domaine a commencé à l’utiliser de différentes manières pour étudier la biologie des CSH.
