Il s’agit d’une méthode hydroponique non invasive pour mesurer l’architecture du système racinaire à l’aide d’équipements de laboratoire de routine. Ce protocole permet la visualisation complète de l’ensemble du système racinaire de la plante en l’étalant manuellement. L’un des principaux avantages de l’analyse RSA est qu’elle permet d’étudier le système racinaire des plantes sans qu’il soit nécessaire d’introduire une contamination élémentaire indésirable.
Cette méthode peut enregistrer l’interaction environnementale directe, y compris les conditions hormonales, nutritionnelles et climatiques avec le RSA des systèmes végétaux. Commencez la stérilisation en surface des graines d’Arabidopsis en trempant une petite cuillère d’environ 100 graines dans de l’eau distillée à température ambiante. Après 30 minutes, centrifuger brièvement les graines à 500 G pendant cinq secondes à l’aide d’une centrifugeuse de table.
Ensuite, décantez l’eau et ajoutez 700 microlitres d’éthanol à 70% avant de faire tourbillonner le tube pendant quelques secondes. Centrifuger à nouveau les graines. Si nécessaire, répéter le tourbillon et la centrifugation, en veillant à ce que le traitement à l’éthanol à 70% ne dépasse pas trois minutes.
Après trois minutes, rincez immédiatement les graines à l’eau stérile. Ensuite, traitez les graines à l’aide d’eau de Javel commerciale diluée contenant une goutte de TWEEN 20 pendant sept minutes. Mélanger les graines avec une solution d’eau de Javel en retournant rapidement les tubes huit à 12 fois.
Après une brève centrifugation, décanter le surnageant à l’aide d’une pipette d’un millilitre et rincer les graines au moins cinq fois avec de l’eau stérile, en suivant la même procédure de vortex. Laissez les graines stérilisées à la surface dans l’eau et incuberez-les pendant deux à trois jours à quatre degrés Celsius pour la stratification. Autoclave la boîte standard en magenta à moitié remplie d’eau distillée.
Couper la feuille de polycarbonate autoclavée en quatre rectangles sur huit centimètres avec un point médian entaillé à plus de la moitié du rectangle de sorte que deux rectangles puissent s’emboîter ensemble pour former une forme en X. Utilisez cette configuration pour contenir le filet de polypropylène de 250 micromètres coupé en carrés de six centimètres sur six. Dans l’armoire à flux d’air laminaire, ajoutez un milieu stérile demi-MS basal avec des vitamines et 1,5% de saccharose à chaque boîte pour atteindre le bord inférieur du filet de polypropylène.
Semez les graines stérilisées en surface sur la maille hydroponique et cultivez-les pendant trois jours. Après trois jours, transférez les plantules sur un maillage de pores de 500 micromètres et laissez-les pousser pendant deux jours. Ensuite, transférez les plantules sur le milieu témoin et dans le milieu expérimental, et laissez les graines pousser pendant sept jours.
Ajouter 10 à 20 millilitres d’eau du robinet filtrée autoclavée à la plaque de Petri. Retirez doucement les plants de la maille de 500 micromètres. À l’aide d’un pinceau d’art rond, étalez des racines végétales dans l’assiette remplie d’eau et immergez-les dans l’eau.
Inclinez légèrement la plaque pour éliminer l’eau. Scannez ou photographiez ces plaques de Petri de manière appropriée. Mesurez l’architecture du système racine, ou traits RSA, à l’aide du logiciel ImageJ disponible gratuitement, puis ouvrez le fichier à analyser.
Après avoir défini l’échelle, utilisez l’outil Ligne droite pour créer une sélection de ligne qui délimite la barre d’échelle. Terminez le contour en cliquant avec le bouton droit de la souris, en double-cliquant ou en cliquant dans la case au début. Pour mesurer la longueur de la barre d’échelle connue en pixels, cliquez sur analyser, puis sur mesure dans la barre d’outils.
Notez la longueur des pixels. Ouvrez la boîte de dialogue Définir l’échelle en cliquant sur l’onglet Définir l’échelle dans l’onglet Analyser. Vérifiez la longueur des pixels dans le champ distance en pixels.
Ensuite, entrez la valeur de la barre d’échelle dans le champ de distance connue et définissez l’unité de longueur en millimètres. Verrouillez l’échelle de cette image particulière en cliquant sur OK. Utilisez l’outil Ligne segmentée pour une sélection de ligne qui définit la longueur de la racine.
Une fois le contour terminé, ajustez la sélection de ligne en cliquant et en faisant glisser les petites poignées noires et blanches le long du contour. Sous l’onglet d’analyse de ImageJ, sélectionnez la commande de mesure et quantifiez la longueur de la racine. Transférez les données mesurées vers une feuille de calcul en cliquant avec le bouton droit de la souris sur la fenêtre de résultats, en sélectionnant tout copier dans le menu contextuel, en passant à la feuille de calcul et en collant les données.
Pour la mesure et le calcul des traits RSA, mesurez la longueur de la racine primaire entre la jonction hypocotyle et l’extrémité des racines. Ensuite, mesurez les racines latérales du premier ordre, ou une longueur LR d’un degré, et les racines latérales du second ordre, ou la longueur LR de deux degrés. Une fois cela fait, copiez et collez toutes les mesures dans la feuille de calcul.
Mesurez et enregistrez la zone de ramification de la racine primaire, ou BZPR, qui s’étend du premier point d’émergence de la racine latérale au dernier point d’émergence de la racine latérale. De même, notez le nombre de racines latérales provenant de la limite de la BZPR. Ensuite, mesurez la longueur moyenne des racines latérales du premier ordre et du rang supérieur.
Dérivez la longueur moyenne des racines latérales primaires en divisant la longueur totale des racines latérales primaires par le nombre total de racines latérales primaires. Ensuite, pour mesurer la longueur moyenne des racines latérales du second ordre, calculez la longueur moyenne des racines latérales secondaires en divisant la longueur totale des racines latérales secondaires par le nombre total de racines latérales secondaires. Mesurer la densité des racines latérales primaires en divisant le nombre de racines latérales primaires par la longueur de la BZPR.
Ensuite, mesurez la zone de ramification des racines latérales individuelles et calculez la densité des racines latérales secondaires en divisant le nombre de racines latérales secondaires par la longueur des zones de ramification des longueurs de racines latérales de second ordre. Une fois cela fait, mesurez la longueur totale de la racine, ou TRL. Il s’agit de l’agrégat des racines primaires et des longueurs des racines latérales primaires et secondaires.
Le système hydroponique utilisé dans cette expérience a bien fonctionné, reflétant le phénotype contrasté apparent dans des conditions insuffisantes et insuffisantes en phosphate inorganique. Divers traits RSA ont été analysés sous des régimes de phosphate inorganique contrastés dans des conditions hydroponiques. Le traitement inorganique déficient en phosphate a invoqué un phénotype racinaire présentant un RSA plus court, moins profond et moins ramifié, par rapport à l’état suffisant en phosphate inorganique.
La longueur des racines primaires a été considérablement atténuée dans les conditions de carence en phosphate inorganique. Un gain significatif et rapide de la longueur de la racine primaire en présence de phosphate inorganique millimolaire ou de milieux témoins a indiqué l’efficacité du système hydroponique et reflétait adéquatement les changements physiomorphologiques. La zone de ramification a été considérablement réduite dans un état de carence en phosphate inorganique.
La longueur moyenne de la racine latérale primaire a été significativement réduite dans l’état de carence en pi. La longueur moyenne des racines latérales secondaires a également été réduite en raison de l’état déficient en phosphate, mais elle était inférieure en quantité à la longueur moyenne des racines latérales primaires. Le nombre de racines latérales primaires et secondaires a fortement diminué dans l’état de carence en phosphate, par rapport à l’état témoin de phosphate inorganique de 1,25 millimolaire.
La densité racinaire latérale primaire n’a pas été modifiée dans l’état de carence en phosphate, par rapport à l’état témoin de phosphate inorganique de 1,25 millimolaire. La densité racinaire latérale secondaire n’a montré aucun changement significatif, ce qui indique l’importance de la densité racinaire latérale pour mieux comprendre la plasticité du RSA. J’ai doucement retiré les semis de la maille à l’aide d’une pince à épiler.
J’étale les racines dans une plaque remplie d’eau à l’aide d’un pinceau rond, toutes les racines primaires, et je l’étale droit, j’étale les racines latérales symétriquement, j’étale les racines latérales de second ordre liées aux racines latérales de premier ordre. Une méthode similaire peut être utilisée pour calculer la surface de suie des pointes des plantes d’Arabidopsis. Les feuilles d’Arabidopsis peuvent être étalées sur l’autre plaque, suivies d’une capture et d’une analyse d’images à l’aide du logiciel ImageJ disponible gratuitement pour déterminer la zone de suie.
Ce protocole peut être utilisé pour répondre à toutes les questions sur l’influence de l’environnement sur la plasticité du système racinaire.
