Le modèle murin utilisé dans cette étude simule efficacement l’effet de l’ingestion chronique de nicotine et de l’exposition répétée à la silice sur les fibroses pulmonaires par la transition mésenchymateuse épithéliale chez l’être humain. Le modèle de la portion de jury a été réalisé par injection sous-cutanée de nicotine et goutte à goutte nasale de silice d’une manière simple et fiable. Suspendez de la silice cristalline stérile dans une solution saline pour préparer une suspension de 20 milligrammes par litre.
Faites-le osciller dans un bain-marie à agitation ultrasonique pendant 25 minutes. Placez la suspension de silice à l’aide d’un oscillateur vortex pendant trois minutes. Aspirez la suspension pour la mélanger, puis utilisez 50 microlitres pour l’écoulement nasal.
Pour commencer l’exposition à la silice, placez d’abord la souris anesthésiée sur la paume d’une main et exposez la cavité nasale de la souris. Injectez 50 microlitres de suspension de silice à partir d’une narine en quatre à huit secondes. Pour permettre une pénétration pulmonaire rapide de la suspension, appuyez doucement sur la poitrine de la souris avec l’index pendant trois à cinq secondes, en répétant la pression trois à cinq fois par seconde pour maintenir sa fréquence respiratoire.
Une fois que la souris présente une respiration uniforme, placez-la en observation dans une cage pendant trois minutes. Préparez les seringues à la nicotine en aspirant de l’air jusqu’à ce que la marque de 0,2 millilitre soit dans une seringue d’un millilitre. Ensuite, prélevez 125 microlitres de nicotine.
Tapotez la seringue pour remplir l’aiguille et l’extrémité avant de nicotine, puis placez-la dans un plateau à l’abri de la lumière. Avec la main droite, saisissez la queue de la souris. Lorsque la souris s’est détendue, utilisez le pouce et l’index gauches pour appliquer une pression modérée sur la peau, de la queue au bord de l’oreille.
Maintenant, relâchez la main droite et utilisez l’auriculaire gauche, le petit et l’annulaire pour pincer la queue et les membres postérieurs afin d’immobiliser la souris. Tenez la seringue d’injection dans la main droite et percez la peau à l’arrière du cou dans le sens de la tête à la queue. Injectez la nicotine à un débit uniforme.
Fixez la souris anesthésiée sur une plaque de test en mousse et vaporisez la fourrure avec de l’alcool à 75%. Faites une incision le long de la ligne médiane de l’abdomen exposant la cavité thoracique. Faites une petite incision à l’apex du côté droit du cœur.
Injectez 20 millilitres de PBS pré-refroidi lentement et uniformément à partir de l’apex du cœur gauche, ce qui fait sortir le sang de l’ouverture créée à l’apex du cœur droit. Retirez tout le lobe pulmonaire et réfrigérez-le à moins 80 degrés Celsius. Perfusez les souris restantes avec 10 millilitres de para-formaldéhyde à 4%.
Après la perfusion PBS, conservez les poumons dans 30 millilitres de solution de para-formaldéhyde. Après 72 heures, plongez les poumons dans le fixateur préparé et placez-les dans un bain-marie à ultrasons. Tempéré à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Ensuite, effectuez la déshydratation en plaçant le tissu dans de l’éthanol à 75 %, puis dans de l’éthanol à 95 %, puis dans de l’éthanol anhydre pendant 50 minutes chacun. Plongez le tissu pulmonaire dans du xylène pendant 50 minutes deux fois pour laver le tissu. Placez le tissu dans de la cire de paraffine fondue pendant deux à trois heures à 55 à 60 degrés Celsius.
Une fois la cire durcie, utilisez une tronçonneuse pour obtenir les tranches de poumon de quatre à cinq micromètres d’épaisseur. Chauffez les sections à 45 degrés Celsius dans de l’eau ultra-pure. Placez les sections de poumons sur une lame de microscope adhérente une fois que la cire a fondu.
Des études de coloration à l’hématoxyline et à l’éosine ont montré que les souris exposées à la nicotine combinée à de la silice présentaient des lésions pulmonaires significativement plus graves que celles exposées à la nicotine ou à la silice seule. La coloration de Masson a révélé une augmentation du dépôt de fibres de collagène dans les poumons exposés à la combinaison de nicotine et de silice par rapport aux autres groupes. Les structures alvéolaires ont été détruites chez les souris exposées à la silice.
Des études immunohistochimiques ont révélé une augmentation des macrophages positifs CD deux zéro six et du facteur pro-fibrotique, TGF bêta un positif chez les souris exposées à la combinaison de nicotine et de silice. L’expression de Vimentin était plus élevée chez les souris soumises à la double expression par rapport aux autres groupes. Les études immunohistochimiques et la quantification des protéines suggèrent une transformation mésenchymateuse épithéliale sévère.
Pour assurer une injection de nicotine réussie, l’opérateur doit se familiariser avec la préhension des souris, car saisir la peau à l’arrière du cou pourrait être douloureux pour elles.
