Le protocole décrit ici est dérivé de l’article publié par Jiang et al. (2020). Ce travail a été soutenu par des subventions du MOST (973 programmes n° 2011CB812502 et 2014CB849902) et par le soutien financier du gouvernement municipal de Beijing.

Toutes les fournitures utilisées dans cette expérience sont énumérées dans le tableau des matériaux. Le flux de travail pas à pas du protocole actuel est illustré à la figure 1.
1. Culture cellulaire sur disques de saphir
<ol><li>Transvaser des disques de saphir de 3 mm x 0,16 mm dans un tube centrifuge de 2 mL contenant 1 mL d’éthanol et sonifier dans un nettoyeur à ultrasons pendant 10 min.</li>
	<li>Brûlez chaque disque de saphir dans une flamme de lampe à alcool jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de dépôts visibles à la surface. REMARQUE: Grâce à la méthode ci-dessus, les disques saphir peuvent être recyclés plusieurs fois.</li>
	<li>Étiquetez un côté de chaque disque de saphir avec un numéro à l’aide d’un stylo résistant aux solvants (Figure 1A). REMARQUE : Le marqueur utilisé doit être testé à l’avance pour déterminer s’il est résistant aux solvants d’acétone et de méthanol afin d’éviter la perte de marques.</li>
	<li>Placez les disques de saphir étiquetés au fond d’un plat de culture de 35 mm avec le côté étiqueté vers le haut.</li>
	<li>Stériliser la boîte de culture cellulaire avec des disques de saphir sous lumière UV pendant 30 min.</li>
	<li>Retournez les disques de saphir avec une pince à épiler (le côté étiqueté vers le bas) et stérilisez sous la lumière UV pendant 30 minutes supplémentaires. Maintenant, la boîte de culture contenant les disques de saphir est prête pour la culture cellulaire. REMARQUE: Les disques de saphir peuvent également être stérilisés par autoclavage.</li>
	<li>Ensemencer les cellules sur les disques de saphir préparés ci-dessus et atteindre une confluence de 80 % à 90 % dans un incubateur cellulaire à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO2 (Figure 1B). REMARQUE : Des lignées cellulaires HeLa stables exprimant des marqueurs MTn ont été générées comme décrit dans Jiang et coll.26.</li>
</ol>2. Congélation à haute pression (HPF)
ATTENTION : L’azote liquide est utilisé dans cette expérience. Lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide, utilisez des procédures de sécurité appropriées et de l’équipement de protection individuelle pour prévenir les engelures et l’asphyxie.
<ol><li>Préparez la machine de congélation à haute pression au moins 2 h avant l’expérience conformément aux instructions du fabricant.</li>
	<li>Transférer les supports en aluminium HPF de type A (encastrement : 0,025/0,275 mm) dans un tube centrifuge de 2 mL contenant 1 mL d’éthanol et sonifier dans un nettoyeur à ultrasons pendant 10 min.</li>
	<li>Sécher les supports dans une boîte de Petri recouverte de papier filtre qualitatif (vitesse moyenne).</li>
	<li>Faire tremper les supports prénettoyés dans du 1-hexadécène. REMARQUE: Le BSA n’est pas recommandé comme cryoprotecteur dans l’expérience actuelle car il interférera avec la synthèse ultérieure de nanoparticules d’or.</li>
	<li>Utilisez une pince à épiler fine pour ramasser un disque de saphir avec des cellules du plat de culture; Touchez la surface étiquetée avec du papier filtre qualitatif (vitesse moyenne) pour enlever l’excès de milieu. REMARQUE: La conductivité thermique de l’eau est très faible et trop d’eau résiduelle affectera l’effet de congélation. Retenez un minimum d’eau pour empêcher les cellules de se dessécher.</li>
	<li>Montez le disque de saphir dans le porte-échantillon HPF et coiffez rapidement le disque d’un support en aluminium de 0,025 mm de profondeur contenant du 1-hexadécène (Figure 1C).</li>
	<li>Aspirer l’excès de solution avec du papier filtre qualitatif (vitesse moyenne).</li>
	<li>Chargez le porte-échantillon pour la congélation à haute pression (figure 1D). NOTE: Le processus de chargement de l’échantillon doit être aussi rapide que possible (dans les 1 min) pour minimiser les altérations physiologiques dues aux changements de température, d’humidité, de pH et de teneur en oxygène.</li>
	<li>Décharger l’ensemble disque de saphir sous azote liquide dans une cryoboîte en mousse et stocker l’ensemble dans un cryovial dans de l’azote liquide avant utilisation. REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les échantillons dans des cryovials peuvent être stockés dans un dewar d’azote liquide pendant des années.</li>
</ol>3. Fixation par substitution au gel (FSF) et réhydratation (Figure 1E)
<ol><li>Remplissez la machine de remplacement automatique de la congélation (AFS) avec de l’azote liquide et refroidissez la chambre à −90 °C. ATTENTION : L’azote liquide est utilisé dans cette expérience. Lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide, utilisez des procédures de sécurité appropriées et de l’équipement de protection individuelle pour prévenir les engelures et l’asphyxie.</li>
	<li>Préparer 2 mL d’acide tannique à 0,01 % (p/v) dans de l’acétone (solution FSF 1) dans un contenant rond en polypropylène de 20 mm (figure 1E) dans une hotte et le congeler dans de l’azote liquide.</li>
	<li>Charger les échantillons (les assemblages disque-support saphir) dans le récipient avec la solution congelée FSF 1 sous LN2 à l’aide d’une paire de pinces à épiler prérefroidies.</li>
	<li>Transférer le récipient dans la chambre AFS prérefroidie pour le traitement FSF à −90 °C.</li>
	<li>Conserver les échantillons à −90 °C pendant 1 h; Ensuite, séparez les disques de saphir des supports avec une pince à épiler prérefroidie et assurez-vous que les côtés marqués des disques de saphir sont orientés vers le bas. NOTE: La pince à épiler doit être suffisamment prérefroidie pour éviter les changements de température. Les disques de saphir doivent être facilement séparés.</li>
	<li>Maintenir à −90 °C pendant encore 8 à 10 h; puis, chauffer à −60 °C en 3 heures.</li>
	<li>Remplacez la solution FSF 1 dans le récipient par de l’acétone prérefroidie et incuber pendant 1 h. Répétez ce lavage à l’acétone 2x.</li>
	<li>Chauffer à −30 °C en 3 h. Pendant cette période, préparer et prérefroidir 2 mL d’acétate d’uranyle à 0,01 % dans de l’acétone (solution 2 de FSF, diluée à partir d’acétate d’uranyle à 10 % dans du méthanol) dans un tube à centrifuger de 2 mL. ATTENTION : L’acétate d’uranyle, utilisé dans la présente expérience, est radioactif et hautement toxique; Ils doivent être manipulés conformément aux procédures de sécurité appropriées et éliminés comme déchets chimiques dangereux.</li>
	<li>Remplacer l’acétone par la solution FSF 2 et incuber à −30 °C pendant 3 h.</li>
	<li>Remplacer la solution FSF 2 dans le récipient par de l’acétone prérefroidie et incuber pendant 30 min à −30 °C. Répétez ce lavage à l’acétone 2x.</li>
	<li>Chauffer de −30 °C à 4 °C en 2 h.</li>
	<li>Remplacer l’acétone par 2 mL de tampon HEPES 0,2 M contenant 1 mM de CaCl2et 1 mM de MgCl2à pH 5,5.</li>
	<li>Changez le tampon une fois et incuber à température ambiante pendant 1 h ou à 4 °C pendant une nuit. REMARQUE : Le protocole peut être interrompu ici pendant une nuit ou poursuivi pendant au moins 6 heures jusqu’à ce que les échantillons soient congelés à nouveau à l’étape 5.</li>
</ol>4. Synthèse AuNP basée sur l’ANSM pour les cellules de mammifères (Figure 1F)
<ol><li>Laver avec un tampon PBS-A 3x pendant 5 minutes à chaque fois.</li>
	<li>Transférer les disques de saphir dans une boîte de culture de 35 mm contenant 1 ml de tampon PBS-A à température ambiante. REMARQUE: Gardez toujours les côtés marqués des disques de saphir vers le bas et évitez de chevaucher les disques de saphir et de frotter les cellules.</li>
	<li>Préparer la solution réductrice en ajoutant 4,28 μL de 2-mercaptoéthanol dans un tube à centrifuger de 2 mL contenant 1 mL de tampon PBS-A et en mélangeant bien dans une hotte. ATTENTION : Le 2-mercaptoéthanol est toxique et dégage une odeur piquante ; Il doit être manipulé conformément aux procédures de sécurité appropriées.</li>
	<li>Remplacer le tampon PBS-A dans la boîte de culture par 1 mL de solution réductrice et incuber pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Préparer le précurseur d’or avant utilisation.<ol><li>Ajouter 80 μL de 10 mM HAuCl4 dans ddH 2 O dans un tube centrifuge de2mL contenant 1 mL de solution réductrice et immédiatement vortex. REMARQUE: La solution peut devenir trouble.</li>
		<li>Ajouter 80 μL de 500 mM de D-pénicillamine dans le ddH2O dans la solution ci-dessus, et immédiatement vortex. Remarque : La solution peut redevenir claire.</li>
	</ol></li>
	<li>Remplacer la solution dans la boîte de culture par la solution de précurseur d’or de 1 mL préparée à l’étape 4.5 et incuber pendant 2 h à 4 °C. NOTE: Un millilitre du précurseur de l’or est suffisant pour réagir avec environ 1 × 106 cellules (confluent sur une boîte de 35 mm). Des volumes plus importants du précurseur sont nécessaires lorsque les AuNP deviennent significativement plus petits.</li>
	<li>Peser 0,0038 g de NaBH 4 dans un tube à centrifuger de 1,5 mL, ajouter 1 mL de ddH2O glacé et vortexpour obtenir du NaBH4 frais de 100 mM juste avant utilisation.</li>
	<li>Ajouter 20-100 μL de NaBH 4 100 mM à la solution à partir de l’étape4.6 , agiter immédiatement pour bien mélanger et incuber pendant 5 min à température ambiante. REMARQUE: Préparer 100 mM NaBH4 fraîchement pour une utilisation immédiate. Après avoir ajouté le NaBH4, la couleur de la solution deviendra progressivement rouge puis s’approfondira. Si aucun changement de couleur n’est observé, cela indique en grande partie que l’expérience a échoué.</li>
	<li>Remplacez la solution par 2 mL de tampon PBS-A pour arrêter la réaction. NOTE: L’arrêt de la réaction dans les 30 minutes est critique, car une réaction prolongée décomposera progressivement les AuNP.</li>
</ol>5. Congélation à haute pression et fixation par substitution de congélation (figure 1C-F)
REMARQUE : Les échantillons sont à nouveau HPF et FSF, et la procédure est presque la même que celle décrite précédemment aux sections 2 et 3 avec quelques modifications.
<ol><li>Préparer 1 % de tétroxyde d’osmium et 0,1 % d’acétate d’uranyle dans de l’acétone (solution 3 de FSF, diluée à partir de 4 % de tétroxyde d’osmium dans de l’acétone et de 10 % d’acétate d’uranyle dans du méthanol). ATTENTION : Le tétroxyde d’osmium et l’acétate d’uranyle sont des produits chimiques hautement toxiques; Ils doivent être manipulés conformément aux procédures de sécurité appropriées et éliminés en tant que déchets chimiques dangereux.</li>
	<li>Charger les échantillons (les assemblages disque-support saphir) dans le récipient avec la solution FSF congelée 3 sous LN2 à l’aide d’une paire de pinces à épiler prérefroidies.</li>
	<li>Transférer le récipient dans la chambre AFS prérefroidie pour le traitement FSF à −90 °C et exécuter le programme FSF comme suit: conserver à −90 °C pendant 8-10 h; puis, chauffer à −60 °C en 3 heures; maintenir à −60 °C pendant 3 h; puis, chauffer à −30 °C en 3 heures; conserver à −30 °C pendant 3 h; puis, chauffer à 4 °C en 2 h.</li>
	<li>Lorsque la température atteint 4 °C, transférer les échantillons dans la hotte et les maintenir à température ambiante pendant 15 min.</li>
	<li>Laver à l’acétone 3x pendant 15 min à chaque fois.</li>
	<li>Maintenir dans l’acétone à température ambiante pendant au moins 2 h.</li>
</ol>6. Infiltration de résine, enrobage et polymérisation
<ol><li>Préparez le mélange de résine époxy conformément aux instructions du fabricant avant utilisation. ATTENTION : La résine époxy utilisée dans l’expérience actuelle est toxique avant polymérisation ; Il doit être manipulé conformément aux procédures de sécurité appropriées. La résine non polymérisée doit être éliminée en tant que déchet chimique dangereux ou polymérisée avant d’être éliminée.</li>
	<li>Transférer les disques de saphir dans des capsules à fond plat et s’infiltrer avec de la résine pendant au moins 30 minutes à température ambiante. REMARQUE: Gardez les côtés marqués des disques saphir vers le bas.</li>
	<li>Polymériser l’échantillon à 60 °C dans une étuve pendant au moins 18 h. REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici après la polymérisation. Les blocs d’échantillons polymérisés peuvent être stockés dans un récipient sec pendant des années.</li>
</ol>7. Sectionnement ultrafin
<ol><li>Coupez soigneusement les blocs d’échantillons polymérisés à l’aide d’un rasoir pour exposer les disques de saphir.</li>
	<li>Trempez les extrémités des blocs avec des disques de saphir dans de l’azote liquide pendant plusieurs secondes et décongelez à température ambiante. Répétez l’action de gel-dégel plusieurs fois pour détacher les disques des blocs. REMARQUE : Évitez la congélation prolongée, car cela pourrait fissurer les blocs d’échantillon. Détachez délicatement les disques de saphir avec une lame, en évitant une force excessive, qui pourrait endommager les échantillons.</li>
	<li>Coupez la face du bloc à une forme trapézoïdale pour une section ultramince (Figure 1G).</li>
	<li>Obtenir des sections ultraminces de 70 à 100 nm avec un ultramicrotome (Figure 1H).</li>
	<li>Choisissez les sections sur des grilles hexagonales en cuivre à 200 mailles. REMARQUE: Le protocole peut être suspendu ici après la section. Les sections sur les ceintures peuvent être stockées dans un conteneur sec pendant des années. Si vous le souhaitez, les sections sur les grilles peuvent être colorées avec 2% d’acétone d’uranyle pour obtenir un meilleur contraste membranaire. La coloration au plomb doit être évitée car elle masquera les signaux de particules de nano-or.</li>
</ol>8. Imagerie TEM (Figure 1I)
<ol><li>Examiner les sections ultraminces sur des grilles de cuivre à l’aide d’un microscope électronique à transmission. En règle générale, une plage de grossissement de 11 kX à 30 kX convient à la visualisation des AuNP dans les cellules, et une valeur de défocalisation appropriée est nécessaire pour s’assurer que les AuNP de 2 à 3 nm sont visibles.</li>
</ol>

Synthèse directe de nanoparticules d’or pour l’analyse de localisation des protéines

<ol>
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L’auteur ne déclare aucun conflit d’intérêts.

L’étude présente ici une technologie robuste de marquage EM clonable pour la visualisation à molécule unique de molécules de protéines dans l’environnement cellulaire avec une résolution ultrastructurale. Les AuNPs directement synthétisés sur des marqueurs riches en cystéine génétiquement codés fournissent une localisation claire et précise des protéines cibles. La technique de congélation à haute pression et de remplacement de la congélation préserve parfaitement l’ultrastructure des échantillo...

À l’ère postgénomique, le développement de la protéine fluorescente verte (GFP) en tant que rapporteur à molécule unique pour la microscopie optique a révolutionné le domaine de la recherche moderne en sciences de la vie 1,2. Pendant des décennies, la microscopie électronique (EM) a été un outil puissant pour observer intuitivement l’ultrastructure cellulaire avec une résolution nanométrique3; Cependant, l’identification et la localisation précises des molécules de protéines restent difficiles.
La technique de marquage EM la plus couramment utilisée est la technique de marquage par microscopie immunoélectronique (IEM), qui est basée sur la réaction antigène-anticorps. Cependant, bien que de nombreuses techniques aient été développées dans le domaine du marquage IEM, y compris le pré-encastrement IEM et le post-enrobage IEM (sur des coupes de résine ou des cryosections hydratées), il souffre encore d’une faible efficacité de marquage (<10%)4,5, qui est liée à la préparation de l’échantillon et à la qualité des anticorps. Pour surmonter ces limitations, le développement de balises génétiquement codées a un grand potentiel d’application.
Deux principaux types d’étiquettes EM ont été explorés en profondeur ces dernières années. Un type est la méthode de coloration DAB, qui utilise des marqueurs tels que APEX2 pour oxyder la 3,3'-diaminobenzidine (DAB) en polymères osmiophiles pour la visualisation EM 6,7,8,9,10,11,12. Il permet le marquage de protéines à forte abondance dans les régions subcellulaires, mais ne convient pas au comptage d’une seule molécule. L’autre type utilise des protéines de liaison aux métaux, telles que la ferritine 13 et la métallothionéine (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, pour générer des dépôts métalliques denses en électrons dans situ pour la visualisation EM. Seul ce dernier a un réel potentiel pour la visualisation et le comptage d’une seule molécule. La taille moléculaire de la ferritine est trop grande (~450 kD) pour qu’elle puisse être utilisée comme étiquette prometteuse, alors que la petite taille (~5 kD) de la MT et sa capacité à lier divers ions à travers ses 20 cystéines ont attiré une grande attention. Plusieurs laboratoires ont essayé de marquer des protéines de fusion MT purifiées ou des cellules exprimant MT en incubant directement avec Au+. Ces tentatives ont initialement prouvé que les marqueurs MT peuvent lier les ions d’or pour former des signaux à contraste élevé, mais aucun n’a vraiment permis l’identification efficace de protéines individuelles dans les cellules, et ils ne sont pas largement applicables 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
La technique de synthèse AuNP basée sur l’ANSM, qui consiste à synthétiser des AuNP de taille 2-6 nm directement sur des marqueurs riches en cystéine (par exemple, MT, les variantes MTn et MTα, AFP) en tant que marqueurs denses en électrons pour la visualisation EM, est la première approche fiable et applicable pour le marquage des protéines et la détection de molécules uniques dans les cellules24,25,26. Il permet la synthèse spécifique d’AuNP sur des protéines de fusion de marqueurs isolées et a atteint une efficacité de marquage sans précédent dans les cellules procaryotes (E. coli) et eucaryotes (S. pombe) non fixées ou chimiquement fixées. Cependant, la mise en œuvre du même protocole dans des systèmes plus avancés tels que les cellules de mammifères ou même les tissus implique des défis supplémentaires, tels que l’homéostasie redox intracellulaire plus complexe et une structure cellulaire plus fragile.
Cette étude présente une technologie de marquage EM clonable, qui combine la nouvelle technique de synthèse AuNP basée sur ANSM pour marquer les marqueurs riches en cystéine (MT) génétiquement codés avec la méthode de préparation d’échantillons HPF / FSF / réhydratation / HPF / FSF, permet l’identification sans ambiguïté d’une seule molécule de protéines marquées dans la membrane ER, la lumière ER et la matrice mitochondriale dans les cellules HeLa. La méthode actuelle combine les caractéristiques d’une efficacité d’étiquetage élevée, d’un rapport signal sur bruit élevé, d’un marquage à molécule unique et d’une forte universalité, et cette méthode a de larges perspectives d’application dans la recherche en sciences de la vie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier</td>
			<td>Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M HEPES buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL MaxyClear snaplock microtube</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL polypropylene screw cap microtubes</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>81-0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mesh hexagonal copper grid</td>
			<td>Tedpella inc</td>
			<td>G200HEX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0482-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm cell culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company</td>
			<td>31025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated freeze substitution machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td>AFS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF</td>
			<td>Beijing Wulundes Biotech Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-penicillamine</td>
			<td>TCI</td>
			<td>P0147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium</td>
			<td>GBICO</td>
			<td>C11965500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>GBICO</td>
			<td>10099-141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom embedding capsule</td>
			<td>Tedpella inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam cryobox</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar 15/95 resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAuCl4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4022-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>sigma&#160;</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPF machine</td>
			<td>Wohlwend&#160;</td>
			<td>HPF compact01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methonal&#160;</td>
			<td>Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company</td>
			<td>12397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>480886-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsO4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-A buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper (medium speed)</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>FFT08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire discs</td>
			<td>Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent resistant pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62053-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI-Pon 812 resin</td>
			<td>SPI Inc</td>
			<td>02659-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2 spirit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>GBICO</td>
			<td>C25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramictotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>FC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct synthesis of em-visible gold nanoparticles in cells for protein localization analysis with well-preserved ultrastructure

L’analyse de la localisation précise des molécules de protéines dans les cellules à résolution ultrastructurale est d’une grande importance pour l’étude de divers processus physiologiques ou pathologiques dans tous les organismes vivants. Par conséquent, le développement de marqueurs clonables pouvant être utilisés comme sondes de microscopie électronique est d’une grande valeur, tout comme les protéines fluorescentes ont joué un rôle crucial dans le domaine de l’imagerie optique. Le mécanisme de suppression de l’autonucléation (ANSM) a récemment été découvert, qui permet la synthèse spécifique de nanoparticules d’or (AuNPs) sur des marqueurs riches en cystéine, tels que la métallothionéine (MT) et la protéine antigel (AFP).
Sur la base de l’ANSM, une technologie de marquage en microscopie électronique a été développée, qui permet la détection spécifique de protéines marquées dans les cellules procaryotes et eucaryotes avec une efficacité de marquage sans précédent. Cette étude illustre un protocole de détection des protéines de fusion MTn (une variante modifiée de la MT dépourvue de résidus réactifs aux aldéhydes) dans des cellules de mammifères à ultrastructure bien préservée. Dans ce protocole, la congélation à haute pression et la fixation par substitution de congélation ont été réalisées à l’aide de fixateurs non aldéhydiques (tels que l’acide tannique, l’acétate d’uranyle) pour préserver l’ultrastructure quasi native et éviter d’endommager l’activité du marqueur causée par la réticulation des aldéhydes.
Une simple réhydratation en une étape a été utilisée avant la synthèse AuNP basée sur l’ANSM. Les résultats ont montré que les protéines marquées ciblaient divers organites, y compris les membranes et la lumière du réticulum endoplasmique (RE), et les matrices mitochondriales ont été détectées avec une efficacité et une spécificité élevées. Cette recherche fournit aux biologistes un protocole robuste pour répondre à une vaste gamme de questions biologiques au niveau d’une seule molécule dans des contextes ultrastructuraux cellulaires.

In the postgenomic era, the development of green fluorescent protein (GFP) as a single-molecule reporter for light microscopy has revolutionized the field of modern life science research1,2. For decades, electron microscopy (EM) has been a powerful tool for intuitively observing the cellular ultrastructure with nanoscale resolution3; however, the precise identification and localization of protein molecules remain challenging.
The most commonly used EM labeling technique is the immunoelectron microscopy (IEM) labeling technique, which is based on the antigen-antibody reaction. However, although many techniques have been developed in the field of IEM labeling, including pre-embedding IEM and post-embedding IEM (on resin sections or hydrated cryosections), it still suffers from low labeling efficiency (&#60;10%)4,5, which is related to the sample preparation and antibody quality. To overcome these limitations, developing genetically encoded tags has great application potential.
Two main types of EM tags have been thoroughly explored in recent years. One type is the DAB staining method, which utilizes tags such as APEX2 to oxidize 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) to osmiophilic polymers for EM visualization6,7,8,9,10,11,12. It enables the labeling of high-abundance proteins in subcellular regions but is not suitable for single-molecule counting. The other type utilizes metal-binding proteins, such as ferritin13 and metallothionein (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, to generate electron-dense metal deposits in situ for EM visualization. Only the latter has real potential for single-molecule visualization and counting. The molecular size of ferritin is too large (~450 kD) for it to be used as a promising tag, whereas the small size (~5 kD) of MT and its ability to bind various ions through its 20 cysteines have attracted great attention. Several labs have tried to label purified MT-fusion proteins or MT-expressing cells by incubating directly with Au+. These attempts have initially proved that MT tags can bind gold ions to form high-contrast signals, but none have really achieved the effective identification of individual proteins in cells, and they are not widely applicable14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
The ANSM-based AuNP synthesis technique, which involves synthesizing 2-6 nm-sized AuNPs directly on cysteine-rich tags (e.g., MT, the MT variants MTn and MT&#945;, AFP) as electron-dense labels for EM visualization, is the first reliable and applicable approach for protein labeling and single molecule detection in cells24,25,26. It allows for the specific synthesis of AuNPs on isolated tag fusion proteins and has achieved an unprecedented labeling efficiency in nonfixed or chemically fixed prokaryotic (E. coli) and eukaryotic (S. pombe) cells. However, implementing the same protocol in more advanced systems such as mammalian cells or even tissues involves additional challenges, such as the more complex intracellular redox homeostasis and more fragile cellular structure.
This study presents a clonable EM labeling technology, which combines the novel ANSM-based AuNP synthesis technique for labeling genetically encoded cysteine-rich tags (MT) with the HPF/FSF-rehydration-HPF/FSF sample preparation method, enables the unambiguous single-molecule identification of tagged proteins in the ER membrane, ER lumen, and mitochondrial matrix in HeLa cells. The current method combines the characteristics of high labeling efficiency, a high signal-to-noise ratio, single-molecule labeling, and strong universality, and this method has broad application prospects in life science research.

Pleins feux sur l’auteur : Synthèse directe de nanoparticules d’or visibles EM dans les cellules pour l’analyse de la localisation des protéines avec une ultrastructure bien préservée  

Synthèse directe de nanoparticules d’or EM-visibles dans des cellules pour l’analyse de localisation des protéines avec une ultrastructure bien préservée

Protein detection and localization are essential in biological research. Our protocol describes a novel EM-labeling technology using genetically-encoded tags which allows single-molecule visualization in situ with well-preserved ultrastructure. It is crucial to avoid over-fixation.The labeling method is based on the activity of cysteines in the tags, which are highly sensitive to aldehyde cross-linking. Our protocol avoids use of aldehyde fixatives and preserves the tag activity and ultrastructure. at the same time.EM labeling has always been challenging, suffering from poor morphology or inefficient labeling. Our protocols synthesizes in situ nanoparticles directly on individual proteins to provide clear and precise localization of the target proteins, with a high signal-to-noise ratio, high efficiency, and specificity. We have so far achieved excellent labeling in isolated proteins, E.coli cells, yeast cells, and HeLa cells.We will explore and optimize the method for application to tissue samples. Combining the prevailing cryo-FIB and cryo-EM technologies will allow us to address important biological questions.

La technique de synthèse AuNP basée sur l’ANSM est un outil extrêmement utile pour marquer et détecter les protéines marquées MT avec TEM26. Pour valider sa robustesse dans les cellules de mammifères, trois lignées cellulaires stables exprimant EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn ou Mito-acGFP-MTn dans les cellules Hela ont été générées. KDEL est une séquence canonique de rétention/récupération du réticulum endoplasmique (ER) C-terminal, qui maintient la protéine de fusion EGFP-MTn-K...

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Le présent protocole décrit une technologie clonable de marquage par microscopie électronique pour détecter les protéines marquées par la métallolothionéine dans les cellules à l’aide d’une nouvelle technique de synthèse de nanoparticules d’or basée sur le mécanisme d’autonucléation.

Analyzing the precise localization of protein molecules in cells with ultrastructural resolution is of great significance for the study of various ...

La détection et la localisation des protéines sont essentielles dans la recherche biologique. Notre protocole décrit une nouvelle technologie de marquage EM utilisant des étiquettes codées génétiquement qui permet la visualisation d’une seule molécule in situ avec une ultrastructure bien préservée. Il est crucial d’éviter la surfixation.La méthode de marquage est basée sur l’activité des cystéines dans les étiquettes, qui sont très sensibles à la réticulation des aldéhydes. Notre protocole évite l’utilisation de fixateurs d’aldéhydes et préserve l’activité du marqueur et l’ultrastructure. en même temps.L’étiquetage EM a toujours été difficile, souffrant d’une mauvaise morphologie ou d’un étiquetage inefficace. Nos protocoles synthétisent des nanoparticules in situ directement sur des protéines individuelles pour fournir une localisation claire et précise des protéines cibles, avec un rapport signal sur bruit élevé, une efficacité et une spécificité élevées. Jusqu’à présent, nous avons obtenu un excellent marquage dans des protéines isolées, des cellules E. coli, des cellules de levure et des cellules HeLa.Nous explorerons et optimiserons la méthode pour l’application aux échantillons de tissus. La combinaison des technologies cryo-FIB et cryo-EM nous permettra d’aborder d’importantes questions biologiques.

direct-synthesis-em-visible-gold-nanoparticles-cells-for-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure

817 vues.  National Institute of Biological Sciences, Beijing. La détection et la localisation des protéines sont essentielles dans la recherche biologique. Notre protocole décrit une nouvelle technologie de marquage EM utilisant des étiquettes codées génétiquement qui permet la visualisation d’une seule molécule in situ avec une ultrastructure bien préservée. Il est crucial d’éviter la surfixation.La méthode de marquage est basée sur l’activité des cystéines dans les étiquettes, qui sont très sensibles à la réticulation d...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Synthèse directe de nanoparticules d’or visibles EM dans les cellules pour l’analyse de la localisation des protéines avec une ultrastructure bien préservée  

Analyzing the precise localization of protein molecules in cells with ultrastructural resolution is of great significance for the study of various physiological or pathological processes in all living organisms. Therefore, the development of clonable tags that can be used as electron microscopy probes is of great value, just as fluorescent proteins have played a crucial role in the field of optical imaging. The autonucleation suppression mechanism (ANSM) was recently uncovered, which allows for the specific synthesis of gold nanoparticles (AuNPs) on cysteine-rich tags, such as metallothionein (MT) and antifreeze protein (AFP).
Based on the ANSM, an electron microscopy labeling technology was developed, which enables the specific detection of tagged proteins in prokaryotic and eukaryotic cells with an unprecedented labeling efficiency. This study illustrates a protocol for the detection of MTn (an engineered MT variant lacking aldehyde-reactive residues) fusion proteins in mammalian cells with well-preserved ultrastructure. In this protocol, high-pressure freezing and freeze-substitution fixation were performed using non-aldehyde fixatives (such as tannic acid, uranyl acetate) to preserve near-native ultrastructure and avoid damage to the tag activity caused by aldehyde crosslinking.
A simple one-step rehydration was used prior to the ANSM-based AuNP synthesis. The results showed that the tagged proteins targeted various organelles, including the membranes and the lumen of the endoplasmic reticulum (ER), and mitochondrial matrices were detected with high efficiency and specificity. This research provides biologists with a robust protocol to address an enormous range of biological questions at the single-molecule level in cellular ultrastructural contexts.

The present protocol describes a clonable electron microscopy labeling technology for detecting metallothionein-tagged proteins in cells using a novel autonucleation suppression mechanism-based gold nanoparticle synthesis technique.

Recherche

Biologie

﻿Preparing Sapphire Discs for Cell Culture

Preparing Sapphire Discs for Cell Culture  

Transfer three millimeters by 0.16 millimeters sapphire discs to a two-milliliter centrifuge tube containing one milliliter ethanol and sonicate it in an ultrasonic cleaner for 10 minutes. Burn each sapphire disc in an alcohol lamp flame until there are no visible deposits on the surface. Label one side of each sapphire disc with a number using a solvent-resistant pen.Place the labeled sapphire discs on the bottom of a 35-millimeter culture dish with the labeled side facing up. Sterilize the cell culture dish with sapphire discs under ultraviolet light for 30 minutes. Flip the sapphire discs with tweezers, ensuring that the labeled side is facing down, and sterilize under ultraviolet light for an additional 30 minutes.Seed the stable HeLa cell lines expressing MTn tags on the prepared sapphire discs and grow to 80 to 90%confluency in a cell incubator.

Préparation des disques de saphir pour la culture cellulaire

High-Pressure Freezing (HPF), Freeze-Substitution Fixation (FSF) and Rehydration of Sapphire Disc-Carrier Assembly

Prepare a high pressure freezing or HPF machine, at least two hours before starting the experiment according to the manufacturer's instructions. Transfer Type A HPF aluminum carriers to a two-millimeter centrifuge tube containing one milliliter ethanol and sonicate them in an ultrasonic cleaner for 10 minutes. Dry the carriers in a Petri dish covered with qualitative filter paper.Soak the pre-cleaned carriers in 1-hexadecene. Use fine tweezers to pick up a pre-prepared sapphire disk from the HeLa cell culture dish. Touch the labeled surface with qualitative filter paper to remove the excess medium.Mount the sapphire disk into the HPF specimen holder and quickly cap the disk with a 0.025-millimeters-deep aluminum carrier containing 1-hexadecene. Aspirate excess solution with qualitative filter paper. Load the specimen holder for high-pressure freezing.Unload the sapphire disk carrier assembly under liquid nitrogen in a foam cryo box. Prepare two milliliters of the freeze-substitution fixation or FSF solution one in a 20-millimeter round polypropylene container in a fume hood and freeze it using liquid nitrogen. Use a pair of pre-cooled tweezers to load the sapphire disks and carrier assemblies into the container with frozen FSF solution one under liquid nitrogen.Transfer this container to a pre-cooled automated freeze substitution machine chamber for FSF processing at minus 90 degrees Celsius. Keep the specimens at minus 90 degrees Celsius for one hour, then separate the sapphire disks from the carriers with pre-cooled tweezers, making sure that the marked sides of the sapphire disks are facing down. Keep the specimens at minus 90 degrees Celsius for an additional 8 to 10 hours before warming up to minus 60 degrees Celsius within three hours.Replace the FSF solution one in the container with pre-cooled acetone and incubate at minus 60 degrees Celsius for one hour. Repeat this acetone wash twice. Warm up to minus 30 degrees Celsius within three hours.Meanwhile, prepare and pre-cool two milliliters of FSF solution two in a two-milliliter centrifuge tube at minus 30 degrees Celsius. Replace the acetone with FSF solution two and incubate at minus 30 degrees Celsius for three hours. Then replace FSF solution two in the container with pre-cooled acetone and incubate for 30 minutes at minus 30 degrees Celsius.Repeat this acetone wash twice. Warm for minus 30 to 4 degrees Celsius within two hours. Replace the acetone with two milliliters of 0.2 molar HEPES buffer.Change the buffer once and incubate at room temperature or four degrees Celsius overnight.

Congélation à haute pression (HPF), fixation par substitution de gel (FSF) et réhydratation de l’ensemble disque-support en saphir

Gold Nanoparticle Synthesis for Mammalian Cells Using Sapphire Discs

Take a pre-prepared HPF and FSF treated sapphire disc containing stable HeLa cells, wash it with PBS-A buffer for five minutes, and repeat this process three times. Transfer the sapphire discs to a 35-millimeter culture dish containing one milliliter of PBS-A buffer at room temperature. Replace the PBS-A buffer in the culture dish with one milliliter of reducing solution and incubate for one hour at room temperature.Prepare the gold precursor in one milliliter of reducing solution and immediately mix by vortexing. Add 80 microliters of 500-millimolar D-Penicillamine in double distilled water to the gold precursor solution. And immediately vortex.Replace the solution in the cultured dish with one milliliter of gold precursor solution and incubate for two hours at four degrees Celsius. Add 20 to 100 microliters of the freshly prepared sodium borohydride solution to the gold precursor solution, immediately shake to mix well, and incubate for five minutes at room temperature. Replace the solution with two milliliters of PBS-A buffer to stop the reaction.Then prepare the epoxy resin mixture according to the manufacturer's instructions, transfer the sapphire discs to flat bottom embedding capsules, and infiltrate with resin for at least 30 minutes at room temperature. Polymerize the specimen at 60 degrees Celsius in an oven for at least 18 hours. Prepare ultra-thin sections of the polymerized specimen by trimming the specimen blocks carefully using a razor to expose the sapphire discs.Dip the block tips with sapphire discs into liquid nitrogen for several seconds and thaw room temperature. Repeat the freeze-thaw action several times to detach the discs from the blocks. The EGFP-MTn-KDEL protein appeared as two to five-nanometer sized gold nanoparticles exclusively distributed in the peripheral ER lumen and in the perinuclear space of the nuclear envelope.The well-preserved ultra structure enabled the single molecule identification of tagged proteins and facilitated the analysis of organelle interactions, such as ER mitochondria interactions. Nanoparticles of the Ost4-EGFP-MTn protein delineated the ER membrane in the outer membrane of the nuclear envelope. Likewise, the Mito-acGFP-MTn expressing cells exhibited specific labeling in the mitochondrial matrix.