Les auteurs remercient le Dr Karine Loulier pour l’accès à la lignée de souris transgéniques MAGIC-Markers. Les auteurs remercient également la plateforme de carottage animalier RAM-Neuro et la plateforme d’imagerie IRM, membre de l’infrastructure nationale France-BioImaging soutenue par l’Agence nationale de la recherche (ANR-10-INBS-04, « Investissements d’avenir »). Ces recherches ont été soutenues par le programme ATIP-Avenir, l’Inserm, la Région Occitanie, l’Université de Montpellier, l’Agence Nationale de la Recherche (ANR-21-CE17-0061), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140) et la Fondation Groupama.

Toutes les expériences ont été approuvées par le National Animal Experiment Board.
1. Préparatifs
<ol><li>Préparez une solution anesthésique de kétamine-xylazine pour l’anesthésie. Injecter de la kétamine à 80 mg/kg et de la xylazine à 10 mg/kg en diluant 200 μL de kétamine (100 mg/mL) et 125 μL de xylazine (20 mg/mL) dans 2 175 mL de NaCl stérile à 0,9 %.</li>
	<li>Préparer une solution de buprénorphine à 0,02 mg/mL comme solution analgésique en ajoutant 100 μL de buprénorphine à 0,3 mg/mL à 1 400 mL de NaCl stérile à 0,9 %.</li>
	<li>Préparez la solution de coloration fluorescente.<ol><li>À l’aide d’une balance fine, peser 10 mg de sel de fluorescéine et le diluer dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour obtenir une solution de fluorescéine à 0,1 %.</li>
		<li>Protégez la solution de la lumière et agitez-la pendant 5 min. Filtrer la solution à l’aide d’une seringue de 10 mL et d’un filtre à seringue de 0,2 μm. REMARQUE : La solution fluorescente doit être protégée de la lumière et peut être conservée à +4 °C pendant 5 jours.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de la souris<ol><li>Peser la souris et induire l’anesthésie en effectuant une injection intrapéritonéale de 10 μL/g de poids de souris (MW) de la solution anesthésique. Lorsque la souris s’arrête de bouger, placez-la sur une plaque chauffante (37 °C) et vérifiez qu’elle est complètement anesthésiée en lui pinçant les orteils.</li>
		<li>Appliquez une goutte de larme artificielle sur l’œil subissant la chirurgie et une goutte de gel oculaire sur l’œil controlatéral.</li>
		<li>Une fois que la souris ne réagit plus au pincement, injecter l’analgésie (0,02 mg/mL de buprénorphine) à 5 μL/g de MW pour fournir 0,1 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée dans le cou.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Abrasion de la cornée
<ol><li>Suivez l’étape 1.3 pour préparer la solution de coloration fluorescente.</li>
	<li>Suivez l’étape 1.4 pour préparer la souris.</li>
	<li>Avant de procéder à l’abrasion, trempez la bavure oculaire dans de l’EtOH à 70 %, puis dans du PBS pour la nettoyer.</li>
	<li>Placez la souris sur une plaque chauffante (37 °C) sur le côté pour accéder facilement à l’œil en cours d’opération.<ol><li>Utilisez un coton-tige pour absorber la larme artificielle et brossez les cils sans toucher l’œil.</li>
		<li>Allumez la bavure oculaire, ouvrez la paupière de la souris avec deux doigts et bloquez simultanément les vibrisses pour éviter qu’elles ne se coincent dans la bavure.</li>
	</ol></li>
	<li>Localisez la pupille ou le centre de l’œil et appliquez la bavure oculaire sur la surface de l’œil, et faites des mouvements circulaires. En regardant de près, la surface de l’épithélium retiré peut être observée. Sinon, faites environ 20 mouvements circulaires sur la cornée.</li>
	<li>Remettez la souris sur le ventre et vérifiez si le gel oculaire est toujours présent dans l’œil controlatéral.</li>
	<li>Appliquez une goutte de solution colorante fluorescente sur l’œil abrasé et attendez 20 s. Absorbez la goutte avec un mouchoir en papier sans toucher l’œil et rincez-la avec une goutte de larme artificielle. Absorbez la goutte de la larme artificielle avec un mouchoir et illuminez l’œil avec la lampe au cobalt bleu. REMARQUE : L’abrasion doit avoir une forme circulaire. Il faut une certaine formation pour l’obtenir.</li>
	<li>Appliquez une goutte de gel oculaire sur l’œil abrasé et laissez la souris se réveiller sur le coussin chauffant. Lorsque la souris se déplace toute seule, remettez-la dans sa cage.</li>
	<li>Vérifier le bien-être de l’animal pendant les 2 jours suivants.</li>
	<li>Après l’utilisation de la bavure oculaire, utilisez un tissu mou pour retirer les cellules épithéliales coincées dans la tête de la bavure et trempez-la dans 70% d’EtOH puis de PBS. REMARQUE : Une fois que les cellules épithéliales sont retirées avec les tissus mous, assurez-vous qu’aucun morceau de tissu n’est coincé dans la tête de la bavure.</li>
</ol>3. Axotomie des nerfs cornéens
<ol><li>Suivez l’étape 1.4 pour préparer la souris.</li>
	<li>Placez la souris sous une loupe binoculaire sur le côté pour accéder à l’œil subissant la chirurgie. Placez le fond d’une boîte de Pétri sous la tête de la souris pour que l’œil soit horizontal. REMARQUE : Les étapes suivantes seront effectuées en regardant à travers la loupe binoculaire.</li>
	<li>Retirez la larme artificielle avec un coton-tige et retirez les cils sans toucher l’œil.</li>
	<li>Placez une pince lisse et incurvée sous l’œil de l’animal afin de le faire sortir de l’orbite. Assurez-vous de fermer suffisamment la pince pour que l’œil ne puisse pas retourner dans l’orbite une fois la pression appliquée, mais pas excessivement pour éviter d’endommager le nerf optique.</li>
	<li>Appliquer le poinçon de biopsie de 2,5 mm verticalement sur l’œil sans pression pour assurer un contact total du poinçon avec la surface de la cornée. REMARQUE : Une fois le poinçon appliqué contre la cornée, la main de l’expérimentateur peut interférer avec le champ de vision.</li>
	<li>Ensuite, commencez à appliquer une pression et tournez le poinçon plusieurs fois. REMARQUE : En fonction de la pression, le nombre de torsions peut varier, mais généralement il est d’environ 5. Il faut s’entraîner pour ressentir la bonne pression et le bon mouvement. Si une pression trop forte est appliquée, l’œil se rompt. Dans ce cas, on peut observer du liquide sortir de la lésion et l’œil se ramollir. L’animal doit être sacrifié.</li>
	<li>Retirez le poinçon de biopsie. Un cercle doit être visible sur la cornée où le poinçon de biopsie a été appliqué. REMARQUE : Les étapes suivantes ne nécessitent pas de loupe binoculaire.</li>
	<li>Vérifiez si l’œil controlatéral a encore du gel oculaire et appliquez-en sur l’œil axotomisé.</li>
	<li>Laissez la souris se réveiller sur un coussin chauffant (37 °C) et remettez-la dans sa cage lorsqu’elle se déplace seule.</li>
	<li>Vérifier le bien-être de l’animal pendant les 2 jours suivants.</li>
</ol>4. Traitement de la cornée à montage entier
<ol><li>Prélèvement et fixation d’échantillons.<ol><li>Peser la souris et induire l’anesthésie en effectuant une injection intrapéritonéale de 10 μL/g de poids de souris (MW) de la solution anesthésique.</li>
		<li>Lorsque la souris s’arrête de bouger et n’a pas de réflexes par pincement des orteils, effectuez une luxation cervicale.</li>
		<li>Sortez l’œil de l’orbite à l’aide de deux doigts et énucléez l’œil en coupant le nerf optique à l’aide de ciseaux incurvés.</li>
		<li>Placez l’œil dans un tube en plastique de 2 ml contenant du PBS.</li>
		<li>Fixez l’œil en remplaçant le PBS par du paraformaldéhyde à 4 % et en le plaçant sur un shaker (30 tr/min) à température ambiante (RT) pendant 20 min.</li>
		<li>Rincer 3 fois pendant 10 min avec PBS à RT sur un shaker (30 tr/min).</li>
	</ol></li>
	<li>Dissection de la cornée<ol><li>Placez une goutte de PBS sur un morceau de parafilm à l’intérieur d’une boîte de Pétri.</li>
		<li>Placez l’œil dans cette goutte de PBS.</li>
		<li>Placez la boîte de Pétri sous la loupe binoculaire.</li>
		<li>Disséquez la cornée à l’aide de ciseaux de microdissection et d’une pince. Coupez au-dessus du corps ciliaire pour garder le limbe.</li>
		<li>Retirez le cristallin, le corps ciliaire et l’iris à l’aide d’une pince fine.</li>
		<li>Replacez la cornée dans un tube en plastique de 2 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Protocole d’immunofluorescence<ol><li>Incuber la cornée dans 2 mL de gélatine de peau de poisson à 2,5 %, de sérum de chèvre à 5 % et de détergent à 0,5 % dans du PBS pendant 1 h à RT sur un shaker (30 tr/min).</li>
		<li>Incuber la cornée dans 150 μL d’une solution de gélatine de peau de poisson à 2,5 %, de sérum de chèvre à 5 % et de détergent à 0,1 % dans du PBS contenant l’anticorps primaire dilué à 1/1000 (anticorps anti-tubuline βIII) pendant une nuit à 4 °C sur un agitateur (30 tr/min).</li>
		<li>Rincer 3 fois pendant 1 h avec 0,1% de lessive en PBS à RT sur un shaker (30 tr/min).</li>
		<li>Incuber la cornée dans la même solution qu’à l’étape 4.3.2, contenant l’anticorps secondaire dilué à 1/500 pendant une nuit à 4 °C sur un agitateur (30 tr/min).</li>
		<li>Rincer 3 fois pendant 1 h avec du PBS à RT sur un shaker (30 tr/min).</li>
		<li>Incuber la cornée pendant 10 min avec 150 μL d’intercalateur d’ADN dilué à 1/5000 à RT sur un agitateur (30 tr/min).</li>
		<li>Rincez 2 fois pendant 5 min avec du PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Montage de la cornée<ol><li>Placez la cornée sur une lame, l’épithélium face à la lame, et utilisez un scalpel pour créer quatre sections sans atteindre le centre. REMARQUE : Faites les sections opposées l’une à l’autre pour former une forme de fleur.</li>
		<li>Placez l’endothélium cornéen face de la lame et retirez le PBS autour de la cornée à l’aide d’un mouchoir. REMARQUE : Ne retirez pas le PBS sous la cornée ; sinon, des bulles d’air peuvent apparaître. Si c’est le cas, ajoutez du PBS à la cornée et retirez la bulle d’air. Recommencez ensuite à partir de l’étape 4.3.2.</li>
		<li>Ajoutez de la pâte de modèle aux quatre coins d’une lamelle rectangulaire. REMARQUE : La pâte modèle surélève la lamelle car la cornée est un tissu épais.</li>
		<li>Déposez 50 μL d’un produit de montage sur la cornée et posez soigneusement la lamelle au-dessus pour éviter la formation de bulles.</li>
		<li>Scellez la lamelle avec du vernis à ongles.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagerie<ol><li>Placez la lame sous un microscope à épifluorescence.</li>
		<li>Définissez la taille de la mosaïque et la profondeur de l’image et lancez l’acquisition.</li>
		<li>Appliquez un programme de défloutage et de déconvolution sur l’image acquise. REMARQUE : L’étape 4.6.3 est une option sélectionnée sur le logiciel d’acquisition (Large Volume Computational Clearing [LVCC])</li>
	</ol></li>
</ol>5. Ablation localisée au laser des nerfs cornéens
<ol><li>Allumez le microscope multiphotonique vertical et le laser combiné à un oscillateur paramétrique optique. Activez la platine chauffée du microscope (37 °C) et réglez les lasers à 850 nm et 1100 nm, correspondant aux longueurs d’onde requises pour le modèle de souris.</li>
	<li>Utilisez un wattmètre pour régler simultanément la puissance des lasers à environ 20 mW.</li>
	<li>Suivez l’étape 1.4 pour préparer la souris et appliquez le gel oculaire sur les deux yeux. NOTE : L’animal utilisé pour ce protocole doit provenir d’une lignée de souris transgénique (souris transgénique MAGIC-Marker21) qui exprime un fluorophore endogène dans les fibres nerveuses cornéennes.</li>
	<li>Installez l’animal dans un porte-tête. Tournez l’animal de 90° pour que l’œil qui vous intéresse fasse face au plafond.</li>
	<li>Attachez les vibrisses de l’animal pour dégager le contour des yeux. Attachez le corps de l’animal pour réduire le mouvement de la tête induit par la respiration.</li>
	<li>Placez une lamelle circulaire sur l’œil au-dessus du gel oculaire. La lamelle doit être horizontale. N’hésitez pas à bouger la tête de l’animal pour que la lamelle soit correctement positionnée.</li>
	<li>Ajoutez une goutte de PBS au-dessus de la lamelle. Placez soigneusement l’animal sur la platine du microscope et placez la tourelle d’objectif à la bonne distance.</li>
	<li>Utilisez l’objectif aqueux 20x et l’épifluorescence pour localiser l’œil et l’innervation à travers l’oculaire.</li>
	<li>Activez les lasers et définissez la profondeur à éclairer.</li>
	<li>Acquérez une image de 1024 x 1024 (pixels) à une vitesse d’acquisition de 70 % à 85 % de la vitesse de numérisation maximale.</li>
	<li>Une fois l’image acquise, retirez l’animal du microscope et retirez la lamelle et les sangles. Retirez l’animal du support de tête, ajoutez plus de gel oculaire si nécessaire et laissez-le se réveiller dans une cage sur une plaque chauffante. NOTE : La destruction de l’innervation peut être observée 1 semaine après l’imagerie. Ce protocole peut être répété une fois par semaine pendant plusieurs semaines pour augmenter les dommages causés par les lasers.</li>
	<li>Lorsque l’animal se déplace seul, remettez la cage dans l’écurie et vérifiez son bien-être pendant les 2 jours suivants.</li>
</ol>

Protocoles d’atteinte des fibres sensorielles cornéennes pour les études de régénération axonale

<ol>
	<li>Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+human+corneal+innervation.">Anatomy of the human corneal innervation.</a> Exp Eye Res. 90 (4), 478-492 (2010).</li><li>Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+nerves+in+health+and+disease.">Corneal nerves in health and disease.</a> Prog Retin Eye Res. 73, 100762 (2019).</li><li>Dua, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+keratopathy.">Neurotrophic keratopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 66, 107-131 (2018).</li><li>Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+keratitis.">Neurotrophic keratitis.</a> Eye. 17 (8), 989-995 (2003).</li><li>Barrientez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Injury:+Clinical+and+molecular+aspects.">Corneal Injury: Clinical and molecular aspects.</a> Exp Eye Res. 186, 107709 (2019).</li><li>Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+roles+of+nitrate+and+nitrite+in+nitric+oxide+metabolism+in+the+eye.">Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye.</a> Sci Rep. 10 (1), 13166 (2020).</li><li>Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+corneal+insult+in+Zebrafish+results+in+a+bilateral+cell+shape+and+identity+modification,+supporting+wound+closure.">Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P+promotes+diabetic+corneal+epithelial+wound+healing+through+molecular+mechanisms+mediated+via+the+Neurokinin-1+receptor.">Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor.</a> Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).</li><li>Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+corneal+wound+healing+using+exosome-mediated+targeting+of+NF-&#954;B+c-Rel.">Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-&#954;B c-Rel.</a> Inflamm Regen. 43 (1), 6 (2023).</li><li>Downie, L. 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P., Said, D. G., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellar+keratoplasty+techniques.">Lamellar keratoplasty techniques.</a> Indian J Ophthalmol. 66 (9), 1239-1250 (2018).</li><li>Gautier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV2/9-mediated+gene+transfer+into+murine+lacrimal+gland+leads+to+a+long-term+targeted+tear+film+modification.">AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

La kératite neurotrophique est considérée comme une maladie rare, affectant 5 personnes sur 10 000. Cependant, les personnes souffrant de NK en raison d’une blessure physique telle que des brûlures chimiques, ou des syndromes tels que le diabète ou la sclérose en plaques ne sont pas incluses dans ces statistiques3. De plus, cette affection reste largement sous-diagnostiquée22 et la prévalence de la maladie est sous-estimée. Il existe un fort besoin de nouveaux tr...

La cornée, qui est la surface transparente de l’œil, est composée de trois couches distinctes : l’épithélium, le stroma et l’endothélium. Cet organe a la plus forte densité d’innervation dans le corps et est composé principalement de fibres sensorielles (types Aδ et C) provenant de la branche ophtalmique du ganglion trijumeau. Les fibres sensorielles pénètrent à la périphérie de la cornée dans le stroma moyen sous la forme de gros faisceaux qui se ramifient pour couvrir la surface. Ils bifurquent ensuite pour percer la membrane de Bowmann et former le plexus sous-basal, facilement reconnaissable par la formation d’un vortex au centre de la cornée. Ces fibres se terminent par des terminaisons nerveuses libres à la surface externe de l’épithélium. Ils sont capables de transduire des stimuli thermiques, mécaniques et chimiques et de libérer des facteurs trophiques essentiels à l’homéostasie de l’épithélium 1,2. La kératite neurotrophique (NK) est une maladie dégénérative affectant l’innervation sensorielle cornéenne. Cette maladie rare provient d’une diminution ou d’une perte de sensibilité cornéenne qui se traduit par une baisse de la production de larmes et de mauvaises propriétés cicatrisantes de la cornée3. La NK progresse à travers trois stades bien décrits, du stade 1 où les patients souffrent de défauts épithéliaux, au stade 3 où une fusion stromale et/ou une perforation cornéennese produisent 4.
Cliniquement, les origines de cette maladie peuvent être diverses. Les patients peuvent perdre l’innervation cornéenne après une blessure physique à l’œil, une intervention chirurgicale ou à la suite de maladies chroniques, telles que le diabète 5,6. À ce jour, le processus de pathogenèse NK reste mal compris, et les options thérapeutiques pour cette maladie menaçant la vue sont très limitées. Par conséquent, une meilleure compréhension des caractéristiques des défauts épithéliaux est nécessaire pour mieux comprendre les mécanismes à l’origine de la régénération de ces fibres et potentiellement les favoriser. Ici, nous proposons plusieurs modèles de lésions cornéennes qui induisent la NK chez la souris.
Le premier modèle est l’abrasion de la couche épithéliale de la cornée avec une bavure oculaire. Ce modèle a été principalement étudié dans le cadre de la régénération de l’épithélium chez différents animaux, tels que les rongeurs et les poissons 7,8,9, et pour tester des molécules favorisant la cicatrisation cornéenne10,11. Physiologiquement, il faut 2 à 3 jours pour que les cellules épithéliales referment la plaie. Le schéma physiologique de l’innervation, cependant, prend plus de quatre semaines pour se remettre de l’abrasion12,13. Au cours de la chirurgie, la bavure oculaire enlève la couche épithéliale de la cornée qui contient le plexus sous-basal et les terminaisons nerveuses libres des fibres. Cette procédure peut être comparée cliniquement aux patients ayant subi une kératectomie photoréfractive (PKR) pour corriger les défauts de réfraction oculaire. L’intervention consiste à enlever l’épithélium de la cornée puis à remodeler le stroma à l’aide d’un laser14. Les patients peuvent ressentir plusieurs effets secondaires à la suite d’une telle chirurgie, tels qu’une diminution de la densité du nerf cornéen pendant 2 ans et une réduction de la sensibilité pendant une durée de 3 mois à un an après la chirurgie15. Étant donné que la chirurgie induit une fragilité du microenvironnement cornéen, ce modèle pourrait permettre d’étudier ces effets secondaires et de développer des approches thérapeutiques qui favoriseraient une réinnervation plus rapide, réduisant ainsi les effets secondaires en question.
Le second modèle consiste à sectionner les axones à la périphérie de la cornée à l’aide d’un poinçon de biopsie, induisant une dégénérescence wallérienne de l’innervation centrale 16. Cliniquement, cette méthode pourrait être comparée à la kératoplastie lamellaire antérieure, dans laquelle le chirurgien réalise une trépanation partielle de la cornée pour enlever une partie de l’épaisseur antérieure de la cornée et la remplacer par une greffe de donneur 17. Après une kératoplastie lamellaire, les patients peuvent souffrir d’un certain nombre de symptômes, notamment la sécheresse oculaire, la perte de l’innervation cornéenne et le rejet du greffon18. Ce modèle d’axotomie réalisée sur les nerfs cornéens pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes de la dégénérescence des fibres, qui se produit après une greffe, suivie de la régénération des axones.
La troisième méthode endommage les nerfs cornéens avec un laser. En utilisant un microscope multiphotonique sur la cornée d’animaux anesthésiés, la dégénérescence des nerfs localisés dans le champ optique est induite à la suite de la formation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), ce qui entraîne des dommages à l’ADN et une cavitation cellulaire19. Cette méthode récapitule les photodommages cornéens induits par une surexposition aux UV naturels (coups de soleil), qui déclenchent également la formation de ROS, entraînant des dommages à l’ADN20. Les patients qui souffrent de coups de soleil cornéens ressentent une grande douleur, car la détérioration des cellules épithéliales prive les extrémités des fibres cornéennes de tout.
Les trois méthodes décrites ici sont conçues pour permettre l’étude du processus de pathogenèse NK et de la régénération axonale. Ils sont facilement reproductibles et précis. De plus, ils permettent une récupération rapide et un suivi facile des animaux.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m seringe filter</td>
			<td>CLEARLINE</td>
			<td>51733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm rust ring remover</td>
			<td>Alger Equipment Company</td>
			<td>BU-5S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendrof&#160;</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algerbrush burr, Complete instrument</td>
			<td>Alger Equipment Company</td>
			<td>BR2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta III Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigenfix</td>
			<td>Diapath</td>
			<td>P0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tear</td>
			<td>Larmes artificielles Martinet</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprecare</td>
			<td>Animalcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Any provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SGM 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated plate</td>
			<td>BIOSEB LAB instruments</td>
			<td>BIO-HE002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalgene 1000</td>
			<td>BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France</td>
			<td>N/A</td>
			<td>French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Large volume computational clearing (LVCC) process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Chameleon Ultra II</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser power meter</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder Imager Tissue microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td>TVM lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parametric oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penlights with blue cobalt filtercap</td>
			<td>Bernell</td>
			<td>ALPEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>Axotomy protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td>Cornea whole-mount processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2%</td>
			<td>Elanco</td>
			<td>N/A</td>
			<td>French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile biopsy punch 2.5 mm</td>
			<td>LCH medical</td>
			<td>LCH-PUK-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>EuroBioSciences</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three strategies to induce neurotrophic keratitis and nerve regeneration in murine cornea

La cornée est un tissu transparent qui recouvre l’œil et qui est crucial pour une vision claire. C’est le tissu le plus innervé du corps. Cette innervation procure sensation et fonction trophique à l’œil et contribue à préserver l’intégrité cornéenne. La perturbation pathologique de cette innervation est appelée kératite neurotrophique. Cela peut être déclenché par une blessure à l’œil, une intervention chirurgicale ou une maladie. Dans cette étude, nous proposons trois protocoles différents pour infliger des dommages à l’innervation de manière à récapituler les trois types de cas généralement rencontrés en clinique.
La première méthode consiste à effectuer une abrasion de l’épithélium à l’aide d’une fraise ophtalmique. Cela implique l’ablation de la couche épithéliale, des terminaisons nerveuses libres et du plexus sous-basal d’une manière similaire à la chirurgie de kératectomie photoréfractive réalisée en clinique. La deuxième méthode ne cible l’innervation qu’en la sectionnant à la périphérie avec un poinçon de biopsie, en maintenant l’intégrité de l’épithélium. Cette méthode est similaire aux premières étapes de la kératoplastie lamellaire et conduit à une dégénérescence de l’innervation suivie d’une repousse des axones dans la cornée centrale. Cette dernière méthode endommage l’innervation d’un modèle de souris transgénique à l’aide d’un microscope multiphotonique, qui localise spécifiquement le site de cautérisation des fibres nerveuses fluorescentes. Cette méthode inflige les mêmes dommages que la photokératite, c’est-à-dire une surexposition aux rayons UV.
Cette étude décrit différentes options pour étudier la physiopathologie de l’innervation cornéenne, en particulier la dégénérescence et la régénération des axones. Favoriser la régénération est crucial pour éviter des complications telles que des défauts de l’épithélium ou même une perforation de la cornée. Les modèles proposés peuvent aider à tester de nouvelles molécules pharmacologiques ou des thérapies géniques qui améliorent la régénération nerveuse et limitent la progression de la maladie.

The cornea, which is the transparent surface of the eye, is composed of three distinct layers: the epithelium, the stroma, and the endothelium. This organ has the highest density of innervation in the body and is composed mainly of sensory fibers (types A&#948; and C) originating from the ophthalmic branch of the trigeminal ganglion. Sensory fibers penetrate the periphery of the cornea in the mid-stroma in the form of big bundles that branch out to cover the surface. They then bifurcate to pierce the Bowmann&#39;s membrane and form the subbasal plexus, which is easily recognizable by the formation of a vortex in the center of the cornea. Those fibers terminate as free nerve endings at the external surface of the epithelium. They are able to transduce thermal, mechanical, and chemical stimuli and to release trophic factors that are essential for epithelium homeostasis1,2. Neurotrophic keratitis (NK) is a degenerative disease affecting the corneal sensory innervation. This rare disease stems from a decrease or a loss of corneal sensitivity that results in lower tear production and poor healing properties of the cornea3. NK progresses through three well-described stages, from stage 1 where patients suffer epithelial defects, to stage 3 where stromal melting and/or corneal perforation occur4.
Clinically, the origins of this disease can be diverse. Patients can lose corneal innervation after physical injury to the eye, surgery, or through chronic diseases, such as diabetes5,6. To date, the NK pathogenesis process remains poorly understood, and therapeutical options for this sight-threatening condition are very limited. Therefore, a better understanding of the characteristics of epithelial defects is needed to better understand the mechanisms behind the regeneration of those fibers and potentially promote them. Here, we propose several models of corneal injury that induce NK in mice.
The first model is the abrasion of the epithelial layer of the cornea with an ocular burr. This model has mainly been studied in the context of the regeneration of the epithelium in different animals, such as rodents and fish7,8,9, and to test molecules promoting corneal healing10,11. Physiologically, it takes 2-3 days for the epithelial cells to close the wound. The physiological pattern of the innervation, however, takes more than four weeks to recover from the abrasion12,13. During the surgery, the ocular burr removes the epithelial layer of the cornea that contains the subbasal plexus and the fibers&#39; free nerve endings. This procedure can be clinically compared to patients with photorefractive keratectomy (PRK) to correct eye refractive defects. The procedure consists of removing the epithelium of the cornea and then reshaping the stroma with a laser14. Patients can experience several side effects following such surgery, such as a decrease of corneal nerve density for 2 years and a reduction in sensitivity for a duration of 3 months to one year post-surgery15. Given that the surgery induces a fragility of the corneal microenvironment, this model could help investigate these side effects and develop therapeutical approaches that would promote faster reinnervation, thus reducing the side effects in question.
The second model consists of sectioning the axons at the periphery of the cornea with a biopsy punch, inducing a Wallerian degeneration of the central innervation 16. Clinically, this method could be compared to anterior lamellar keratoplasty, in which the surgeon realizes a partial trephination of the cornea to remove a part of the anterior thickness of the cornea and replace it with a donor transplant 17. Following lamellar keratoplasty, patients may suffer from a number of symptoms including dry eye, loss of corneal innervation and graft rejection18. This axotomy model performed on corneal nerves could provide insight into the mechanisms of fiber degeneration, which occurs after a graft, followed by the axons&#39; regeneration.
The third method damages the corneal nerves with a laser. By using a multiphoton microscope on the cornea of anesthetized animals, degeneration of the nerves localized in the optical field is induced as a result of reactive oxygen species (ROS) formation, which leads to DNA damage and cellular cavitation19. This method recapitulates the corneal photodamage induced by overexposure to natural UV (sunburn), which also triggers ROS formation, leading to DNA damage20. Patients who suffer from corneal sunburn experience great pain, as the deterioration of epithelial cells deprives the corneal fibers&#39; extremities of all.
The three methods described here are designed to enable the investigation of the NK pathogenesis process and axon regeneration. They are easily reproducible and precise. Moreover, they allow quick recovery and easy monitoring of the animals.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser la recherche sur l’innervation cornéenne grâce à des modèles novateurs 

Trois stratégies pour induire la kératite neurotrophique et la régénération nerveuse dans la cornée murine

The cornea, which is the transparent tissue covering the eye, requires a balanced microenvironment to maintain its integrity. The dense innervation of the cornea participates to this microenvironment. If there is a loss, which could be partial or total, of this innervation, then a specific condition arises, which is called neurotrophic keratitis.To find new cures and efficient cures for this disease, we need to have specific models. The expansion of the use of transgenic animal bearing fluorescent reporters and microscopic advances have opened new possibilities in visualizing axonary generation. In vivo imagine has become more accessible to any research lab willing to follow the neurogeneration process.The various causes inducing neurotrophic keratitis underlying the difficulties of having only one model to test nerve regeneration therapies. These three models are reproducing various situations seen in clinics, and sharing those methods will allow other labs to uncover new aspects of corneal innervation from which innovative treatments will be designed.

Cette étude propose plusieurs protocoles pour infliger des dommages à l’innervation cornéenne chez la souris. Alors que des protocoles similaires ont été utilisés pour étudier la physiopathologie de la cicatrisation de l’épithélium, nous avons choisi d’adapter et de développer de nouvelles méthodes d’étude de la régénération de l’innervation cornéenne. Pour observer l’innervation, nous avons utilisé deux techniques. Dans un premier temps, nous avons utilisé une technique d’immunofluorescen...

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Nous proposons ici trois méthodes différentes pour endommager les fibres sensorielles qui innervent la cornée. Ces méthodes facilitent l’étude de la régénération axonale chez la souris. Ces trois méthodes, adaptables à d’autres modèles animaux, sont idéales pour l’étude de la physiologie et de la régénération de l’innervation cornéenne.

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation ...

La cornée, qui est le tissu transparent qui recouvre l’œil, a besoin d’un microenvironnement équilibré pour maintenir son intégrité. L’innervation dense de la cornée participe à ce microenvironnement. S’il y a une perte, qui peut être partielle ou totale, de cette innervation, une affection spécifique survient, appelée kératite neurotrophique.Pour trouver de nouveaux remèdes et des remèdes efficaces contre cette maladie, nous avons besoin de modèles spécifiques. L’expansion de l’utilisation des rapporteurs fluorescents transgéniques portant des animaux et les progrès microscopiques ont ouvert de nouvelles possibilités dans la visualisation de la génération axonaire. L’imagine in vivo est devenu plus accessible à tout laboratoire de recherche désireux de suivre le processus de neurogénération.Les différentes causes induisant la kératite neurotrophique sous-tendent les difficultés de n’avoir qu’un seul modèle pour tester les thérapies de régénération nerveuse. Ces trois modèles reproduisent diverses situations observées dans les cliniques, et le partage de ces méthodes permettra à d’autres laboratoires de découvrir de nouveaux aspects de l’innervation cornéenne à partir desquels des traitements innovants seront conçus.

three-strategies-to-induce-neurotrophic-keratitis-nerve-regeneration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea

996 vues.  University of  Montpellier, INSERM. La cornée, qui est le tissu transparent qui recouvre l’œil, a besoin d’un microenvironnement équilibré pour maintenir son intégrité. L’innervation dense de la cornée participe à ce microenvironnement. S’il y a une perte, qui peut être partielle ou totale, de cette innervation, une affection spécifique survient, appelée kératite neurotrophique.Pour trouver de nouveaux remèdes et des remèdes efficaces contre cette maladie, nous avons besoin de modèles spécifiques....

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser la recherche sur l’innervation cornéenne grâce à des modèles novateurs 

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation provides sensation and trophic function to the eye and contributes to preserving corneal integrity. The pathological disruption of this innervation is termed neurotrophic keratitis. This can be triggered by injury to the eye, surgery, or disease. In this study, we propose three different protocols for inflicting damage on the innervation in ways that recapitulate the three types of cases generally encountered in the clinic.
The first method consists in making an abrasion of the epithelium with an ophthalmic burr. This involves the removal of the epithelial layer, the free nerve endings, and the subbasal plexus in a manner similar to the photorefractive keratectomy surgery performed in the clinic. The second method&#160;only targets the innervation by sectioning it at the periphery with a biopsy punch, maintaining the integrity of the epithelium. This method is similar to the first steps of lamellar keratoplasty and leads to a degeneration of the innervation followed by regrowth of the axons in the central cornea. The last method damages the innervation of a transgenic mouse model using a multiphoton microscope, which specifically localizes the site of cauterization of the fluorescent nerve fibers. This method inflicts the same damage as photokeratitis, an overexposure to UV light.
This study describes different options for investigating the physiopathology of corneal innervation, particularly the degeneration and regeneration of the axons. Promoting regeneration is crucial for avoiding such complications as epithelium defects or even perforation of the cornea. The proposed models can help test new pharmacological molecules or gene therapy that enhance nerve regeneration and limit disease progression.

Here, we propose three different methods of damaging the sensory fibres innervating the cornea. These methods facilitate the study of axon regeneration in mice. These three methods, which are adaptable to other animal models, are ideal for the study of corneal innervation physiology and regeneration.

Recherche

Neurosciences

Murine Corneal Nerve Abrasion for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin corneal abrasion, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of artificial tear on the eye undergoing the surgery. Apply a drop of ocular gel on the contralateral eye.Next, position the mouse on its side on a heated plate. Gently use a cotton swab to absorb the artificial tear, and brush aside the mouse's eyelashes without making contact with the eye. Turn on the ocular burr, and carefully open the mouse's eyelid with two fingers.Simultaneously shield the vibrancy to prevent them from entangling in the burr. Locate the pupil or the eye center and gently apply the ocular burr to the eye's surface in circular motions until the epithelium is removed. Alternatively, perform about 20 circular movements on the cornea.Now apply a drop of fluorescent staining solution on the abraided eye. After 20 seconds, dab the eye with a tissue to absorb the solution. Then rinse it with a drop of artificial tear.Finally, absorb the artificial tear with a tissue, and illuminate the eye using a blue cobalt lamp. Prior to the surgery, the basal epithelium was intact and the nerve fibers in the sub basal plexus formed a vortex. The burr tip removed the outer corneal layer, leaving the stroma and endothelium intact with a visible gap at the basal epithelium and sub basal plexus.Regeneration of the epithelium occurred over a week post-surgery. However, the vortex remained absent from the corneal center.

Abrasion du nerf cornéen murin pour l’induction de la kératite neurotrophique

Murine Corneal Nerve Axotomy for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin corneal nerve axotomy, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of artificial tear on the eye undergoing the surgery. Apply a drop of ocular gel on the contralateral eye.Position the mouse under a binocular loupe to assess the eye that is being operated on. Place the bottom of a Petri dish under the mouse's head to keep the eye horizontal. With a cotton swab, carefully dad the artificial tear from the eye and remove the eyelashes without touching the eye.Place a pair of smooth curved pillars under the animal's eye and gently pop it out of the orbit. Gently place a biopsy punch vertically against the cornea surface, apply pressure, and twist the punch several times. Then, remove the biopsy punch and a circular mark should be visible on the cornea.A thin peripheral ring was seen at the point where the biopsy punch was applied, which damaged the basal epithelium. The peripheral nerves appeared to be sectioned, triggering the Wallerian axon degeneration. Heavy degeneration was observed, leading to total loss of innervation in the cornea center.This resulted in the disintegration of the epithelial layer, creating an ulcer.

Axotomie du nerf cornéen murin pour l’induction de la kératite neurotrophique

Localized Laser Ablation of Murine Corneal Nerves for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of ocular gel on both eyes. Place the animal in a head holder to secure its position.Rotate the animal by 90 degrees so that the eye being operated on faces the ceiling. Secure the animal's vibrancy to clear the area around the eye. Secure the animal's body to minimize head movements caused by breathing.Place a circular cover slip horizontally over the eye on top of the ocular gel. Adjust the animal's head as necessary to correctly position the cover slip. Add a drop of PBS on top of the cover slip, then carefully place the animal onto a microscope stage.Adjust the objective turret of the microscope to the appropriate distance for observation. Activate the lasers to induce corneal nerve ablation. Once nerve ablation is complete, remove the animal from the head holder and place it in a cage on a heated plate.The vortex was visibly absent one week after laser ablation. A group of immune cells were observed to have migrated to the illumination site. The stromal fiber bundles appeared to have thinned out.