Il s’agit d’une méthode alternative et facile à utiliser pour délivrer des gènes d’intérêt aux oeufs de souris fécondés par perforation laser de la zona pellucida et la livraison du gène lentiviral. La perforation assistée au laser de la procédure de donneur de souris peut également s’appliquer aux ovules fécondés d’autres espèces pour faciliter l’entrée d’autres types de virus ou de réamen transfection. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas de compétences spécialisées pour la micromanipulation et la micro-injection des œufs de souris fécondés.
Page Myers, chercheur à la direction de la médecine comparée au NIEHS, fera la démonstration d’une procédure d’isolement des ovules de souris fécondés. 16 à 24 heures après l’accouplement, isoler les ovaires et les ovules des souris femelles avec des bouchons vaginaux, selon les protocoles standard. Lorsque tous les tissus ont été recueillis, déchirer l’ampulla de chaque ovaire, et libérer les ovules fécondés, entourés de cellules cumulées, et transférer les œufs dans des cellules cumulées à un plat de 35 millimètres contenant un x hyaluronidase dans le milieu M2 frais, pour une incubation de trois à cinq minutes à température ambiante.
Pipette les oeufs à quelques reprises pour libérer les cellules cumulées, et transférer les œufs dans un nouveau plat de 35 millimètres contenant M2 moyen, avec pipetting pour laver l’enzyme. Ensuite, transférez les œufs lavés dans un plat de 35 millimètres contenant du simplex de potassium optimisé moyen, ou KSOM, et pipette pour laver le reste M2 moyen et hyaluronidase. Ensuite, transférez les œufs dans des plaques traitées de culture tissulaire de 35 millimètres épépinées de 50 microlitres de KSOM et de deux millilitres de diméthylpolysiloxane pendant un équilibre de deux heures à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et d’oxygène et 90 % d’azote.
Pendant que les oeufs sont dans l’incubateur, installez et étalonnez le laser XYClone, selon les recommandations du fabricant. Lorsque les œufs sont prêts, placez la première plaque de chute sur le stade du microscope laser, et concentrez manuellement la zona pellucida. Après avoir confirmé que la lumière LED laser est visible à travers l’objectif, déplacer le stade microscope pour cibler la zona avec le laser LED, et utiliser le logiciel pour définir le laser XYClone à 250 microsecondes.
Réglez la taille de la lumière LED aux dimensions appropriées, et perforer la zona pellucida de chaque œuf trois fois avec le laser pour produire trois trous de 10 micromètres. Il est essentiel d’effectuer la perforation rapidement, mais avec soin, car les œufs fécondés ne peuvent pas rester à l’extérieur de l’incubateur pendant plus de 15 minutes. Ensuite, retournez les œufs perforés à l’incubateur pendant encore deux heures.
À la fin de la deuxième incubation, traiter la baisse de 50 microlitres KSOM avec deux microlitres de lentivirus concentré sans mélange. Et retourner les œufs à l’incubateur pendant quatre jours. Lorsque les ovules se sont développés en blastocystes, utilisez un dispositif non chirurgical de transfert d’embryons, pour déposer environ 10-15 embryons dans environ deux microlitres de KSOM.
17 jours après le transfert de l’embryon, permettre à la souris enceinte d’accoucher naturellement ou de recueillir les nouveau-nés par césarienne si nécessaire. Ensuite, recueillir les tissus des chiots pour le génotypage, pour déterminer le taux de transgenèse. Le développement isolé et transduced d’oeuf fertilisé de souris peut être vérifié sous le microscope quotidiennement.
60 à 70 % des embryons sains et non traités se développent en blastocystes dans un délai de trois à quatre jours. Alors qu’environ 47% des embryons transforés au laser se développent en blastocystes, dont 85% expriment le gène transduced d’intérêt. Viser le laser pour amincir la zona, au lieu de créer un trou, permet aux embryons en développement de bénéficier d’une zona pellucida intacte et encapsulante tout en restant permissif à la transduction lentivirale.
La transduction avec un lentivirus recombinant, exprimant le GFP de copepod d’un promoteur de facteur d’allongement 1A induit des intégrations lentiviral multiples, et une expression élevée de GFP sous une lampe bleue de LED. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que, tandis que la capacité des lentivirus à s’intégrer dans le génome hôte en fait un outil puissant pour la livraison stable des gènes, mais l’intégration aléatoire peut également introduire des mutations insertionnelles. Cette technique pourrait permettre aux chercheurs dans le domaine de la génétique de développer rapidement des modèles animaux transgéniques pour l’étude des maladies pour la production de protéines in vivo, ou pour des études génétiques fonctionnelles.
Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’immunohistochimie peuvent être effectuées sur des échantillons de tissus isolés provenant de chiots transduced pour répondre à des questions supplémentaires sur l’emplacement et l’étendue de l’expression des gènes dans divers tissus d’intérêt. N’oubliez pas que travailler avec des lentivirus peut être extrêmement dangereux. Veuillez donc suivre vos directives institutionnelles pour travailler avec les lentivirus.
Portez des vêtements de protection individuelle et décontaminez tous les déchets avant l’élimination.
