Ce protocole permet à l’utilisateur d’obtenir une expression transgénique efficace dans le myocarde ventriculaire, facilitant ainsi les études d’expression génique pour examiner les arythmies cardiaques et la fonction dans le tissu ventriculaire. La technique d’expression des transgènes viraux est peu invasive pour l’animal, causant moins de dommages et un temps de récupération réduit que les approches conventionnelles impliquant une thoracotomie. La technique pour induire des arythmies dans les petits cœurs de rongeurs est utile pour évaluer la susceptibilité aux arythmies dans les petits modèles animaux de maladie cardiaque.
La démonstration de la procédure sera le docteur Alice Lu, une boursière postdoctorale du laboratoire. Pour commencer, stérilisez la région inférieure gauche de la poitrine de la souris anesthésiée avec des rondes alternées d’un gommage à base d’iode ou de chlorhexidine, dans de l’alcool, trois fois dans un mouvement circulaire. Sous guidage par imagerie par ultrasons, insérer l’aiguille de la seringue contenant le virus dans la poitrine de l’animal.
Approchez la pointe de l’aiguille dans la paroi libre avant ventriculaire gauche et injectez lentement 10 à 15 microlitres du virus. Vérifier la réussite de l’injection dans les images échographiques par la luminosité améliorée près de la pointe de l’aiguille. Retirez l’aiguille du cœur et insérez-la dans d’autres régions du ventricule gauche pour une deuxième et une troisième injection de la même quantité de virus.
Pour effectuer une perfusion Langendorff du cœur de souris, placez le cœur canulé dans une boîte en plastique de 10 centimètres recouverte d’élastomère de silicone, avec le ventricule gauche vers le haut. Canuler l’aorte du cœur avec une aiguille émoussée reliée à un système de profusion Langendorff modifié en mode débit constant. Perfuser le cœur avec une solution Tyrode à bulles d’oxygène à 37 degrés Celsius.
Au début de la perfusion, vérifiez la bonne canulation aortique en observant le lavage du sang du cœur pendant les deux ou trois premiers battements cardiaques et en changeant la couleur du cœur du rouge au pâle. Ajustez le débit pour maintenir la pression de perfusion à 70 à 80 millimètres de mercure. Après confirmation, placez les électrodes d’un système ECG pour petit animal autour du cœur en les insérant dans le revêtement en élastomère de silicone dans le plat.
Ensuite, enregistrez l’ECG à l’aide d’un logiciel compatible. Ensuite, effectuez une stimulation des récepteurs adrénergiques et perfuser le cœur avec de l’isoprotérénol et une solution Tyrode. Après 10 minutes, effectuez une stimulation électrique programmée pour induire des tachyarythmies ventriculaires en stimulant le cœur à l’apex avec deux électrodes de platine reliées à un stimulateur électrique.
Commencez la procédure de stimulation avec 10 stimuli initiaux consécutifs, S1, suivis d’un stimulus supplémentaire, S2, avec un intervalle initial de 80 millisecondes. Ensuite, réduisez à plusieurs reprises l’intervalle S2 de deux millisecondes à chaque fois jusqu’à ce que le rythme cardiaque ne puisse plus être capturé ou que la période réfractaire effective du cœur, ou ERP, soit atteinte. Surveiller toute tachyarythmie ventriculaire induite, y compris la tachycardie ventriculaire et la fibrillation, par ECG.
Si aucune arythmie n’est induite. ajouter un autre stimulus supplémentaire, S3, après S2, avec les mêmes paramètres jusqu’à ce que l’ERP soit atteint. Si les tachyarythmies ventriculaires ne sont toujours pas induites, arrêtez la stimulation électrique et considérez le cœur comme non inductible.
Au cours de la stimulation électrique programmée, la stimulation réussie du cœur est vérifiée par la capture individuelle du rythme cardiaque pendant les stimuli S1 consécutifs et le complexe QRS prolongé pendant la stimulation S1. Ces stimulations adrénergiques et électriques combinées n’ont induit aucune tachyarythmie ventriculaire chez les cœurs de souris de type sauvage sains et exploités de manière simulée, ou dans les cœurs de rats contrôlés injectés par un adénovirus et GFP. En revanche, le même protocole a induit des tachyarythmies ventriculaires chez 77% des cœurs de souris de type sauvage après un infarctus du myocarde et chez trois rats sur quatre après injection intramyocardique d’Ad-Wnt3a.
Lors de l’insertion de l’aiguille, assurez-vous que l’extrémité de l’aiguille est encastrée dans la paroi libre et non à l’intérieur du ventricule. En outre, la sécurisation et la canulation de l’aorte du cœur est l’étape la plus critique. En suivant ces procédures, les cœurs peuvent être utilisés pour des études histologiques standard ou des tests de biologie moléculaire.
Alternativement, les cellules vivantes peuvent être isolées afin d’effectuer des études électrophysiologiques unicellulaires.
