הנדסה האבולוציה של הנגיף Adeno הקשורים סינתטי (AAV) בריפוי גנטי באמצעות וקטור משפחת ה-DNA של גרירת רגליים

Summary

אנחנו מדגימים את הטכניקה הבסיסית מולקולרי מהנדס ולהתפתח סינתטיים Adeno הקשורים נגיפיים (AAV) טיפול וקטורים גנים באמצעות DNA המשפחה גרירת רגליים. יתר על כן, אנו מספקים הנחיות כלליות ודוגמאות נציג לבחירת וניתוח של capsids chimeric בודדים בעלי תכונות משופרות על תאים היעד בתרבות או בעכברים.

Abstract

Adeno הקשורים נגיפיים (AAV) וקטורים מהווים חלק מכלי הרכב החזקים ביותר ומבטיח להעברת טיפולית הגן האנושי עקב שילוב ייחודי של תכונות מועילות ^1. אלה כוללים את apathogenicity של וירוסים wildtype הבסיס לבין מתודולוגיות מתקדמות ביותר לייצור גבוהה titer טוהר גבוהה, וקליניים כיתה וקטורים רקומביננטי ^2. יתרון נוסף של מערכת מסוימת AAV על וירוסים אחרים הוא הזמינות של עושר טבעי של קפסיד, השונים בנכסים חיוניים עדיין יכולים להיות מהונדסים בקלות באמצעות וקטורים ^1,2 פרוטוקול נפוץ. יתר על כן, מספר קבוצות, כולל שלנו פיתחו לאחרונה אסטרטגיות להשתמש באותם וירוסים טבעי כתבניות ליצירת וקטורים סינתטיים אשר גם לשלב את הנכסים של קפסיד קלט מרובים, או אשר משפרים את המאפיינים של אחת לבודד. הטכנולוגיות המתאימות כדי להשיג מטרות אלה arה-DNA או המשפחה דשדוש ^3, כלומר פיצול של גנים שונים AAV קפסיד ואחריו הרכבה מחדש שלהם מבוסס על homologies חלקי (בדרך כלל> 80% עבור רוב קפסיד AAV), או להציג פפטיד ^4,5, כלומר הכנסה של 7 חומצות אמינו בדרך כלל לתוך לולאה חשוף של capsid ויראלי שבו פפטיד אידיאלי מתווכת מחדש מיקוד לסוג התא הרצוי. להצלחה מקסימלית, שתי השיטות מיושמות באופן תפוקה גבוהה לפיה הפרוטוקולים הם עד בקנה מידה להניב ספריות של כ 1,000,000 קפסיד גרסאות שונות. שיבוט כל כך מורכב משילוב ייחודי של וירוסים הורים רבים (גישת ה-DNA של גרירת רגליים) או מכילה פפטיד ייחודי בתוך עמוד השדרה ויראלי זהה (גישת התצוגה פפטיד). השלב האחרון לאחר מכן הוא איטרטיבי מבחר של הספרייה כזה על תאים היעד על מנת להעשיר את capsids בודדים הממלאים את רוב או את כל הדרישות אידיאלי של תהליך הבחירה. זו האחרונה רצוי לסרקאינס לחץ חיובי, כגון גידול לסוג תא מסוים של עניין, עם סלקציה שלילית, לשם מניעת מופע של כל capsids מגיבים עם נוגדנים נגד AAV. שילוב זה מגדיל הסיכוי capsids סינתטיים ששרדו את הבחירה להתאים את הצרכים של היישום ניתן באופן סביר להניח שלא נמצאו כל AAV טבעי לבודד. כאן, אנו מתמקדים בשיטת ה-DNA המשפחה דשדוש כמו תיאורטית ו ניסיוני יותר מאתגר של שתי הטכנולוגיות. אנו מתארים ולהפגין בכל האמצעים החיוניים לייצור ובחירת גררה את רגליה ספריות AAV (איור 1), ולאחר מכן לדון את החסרונות ואת ההיבטים הקריטיים של הפרוטוקולים, כי אחד צריך להיות מודע כדי להצליח עם האבולוציה AAV מולקולרית.

Protocol

1. הכנת סטים פלסמיד קידוד AAV גנים capsid

1. כדי להקל על שגרת ההכנה של כמות מספקת של שונות AAV קפסיד (CAP) הגנים של ה-DNA לאחר גרירת רגליים, בתחילה subclone הגנים האלה לתוך עמוד השדרה פלסמיד משותף. חשוב לכלול רצפים זהים משני צדי של> 20 נוקלאוטידים לשימוש מאוחר יותר כאתרי פריימר מחייב עבור PCR מקונן ועל שיבוט (איור 2).
2. באמצעות פריימרים מתאימים (ראו טבלה עבור primers למופת עבור AAV5), PCR להגביר גנים כובע הרצוי מתוך זמינים בדרך כלל פלסמידים AAV כי בדרך כלל מכילים את הגן AAV2 נציג ליד הגן שווי של בחירה. כי מוצר ה-PCR ישמש שיבוט רגיל, ~ 1 מיקרוגרם של מטוהרים המוצר כבר מספיק, וכל פרוטוקול ה-PCR קונבנציונאלי ולכן יכול לשמש.
3. לעכל את ה-PCR מטוהרים המוצר (למשל, השתמש agarose טיהור ג'ל או ערכת טיהור תקן ה-PCR) והנמען פלסמיד עם אנזימי הגבלה אשר אתרי הכרה נמצאים על פריימרים המשמשים הגברה שוק (1.1), כמו גם למקבל פלסמיד. במעבדה שלנו, אנו משתמשים פאק אני עולה אתרים I (איור 2) כאשר הם נעדרים ברוב AAVs.

2. DNase מבוסס ין שווי פיצול

1. PCR להגביר גנים כובע של בחירה מתוך פלסמידים שנוצרו בשלבים 1.1-1.3. תגובה אחת כמתואר להלן תניב ~ 3 מיקרוגרם של מוצר ה-PCR. תלוי במספר גנים כובע להיכלל בספרייה, זה מספיק עד שש תגובות דשדוש.
2. עבור ה-PCR, להגדיר תגובה 50 μl המכיל 200 ng שווי פלסמיד, כל צבע יסוד בריכוז 2 מיקרומטר האחרון, חיץ 10 μl 5x HiFi ו 1 μl פולימראז HiFi. התחל עם 5 דק 'ב 95 ° C ולאחר מכן להפעיל 40 מחזורים של 15 שניות 94 ° C, 30 sec 57 ° C ו 3 דקות 68 ° C, ואחריו שלב 10 הגמר דקות ב72 ° C. לטהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ג'ל או ערכת ואז להגדיר מבוקר DNase תקציר ליצור גנים כובע שברי עבור הרכבה מחדש לתוך מפלצות.
3. לכן, באותה מידה לערבב את המוצרים השונים כובע ה-PCR לסכום כולל של 4 מיקרוגרם של 54 μl H ₂ O. הוסף μl 6 חיץ DNase התגובה ו -0.5 DNase μl אני לתגובה, בזהירות קפיצי שלוש פעמים, ספין בקצרה ולשים מיד על בלוק 25 ° C חימום. דגירה בין 1 ל 2 דק '(להגדיר תגובות מקבילים מרובים ולסיים אותם בהפרשים של 15 שניות), ואז לעצור את התגובה על ידי הוספת 6 μl 25 מ"מ ו EDTA על ידי לחיצה קצרה vortexing דוגרים ו 10 דק' ב 75 ° C.
4. לטהר את שברי התקרה של ג'ל רגיל agarose 1%. באופן אידיאלי, למרוח צריך להיות גלוי בין 100 ל 500 זוגות בסיסים. מאז אני DNase הוא אנזים חזק מאוד, הטיפול הנכון בעיתוי קריטי בשלב זה, וריאציות רבות בזמן הדגירה בשלב 2.3 יש צורך בהזמנה עבור מיל אופטימלייםאולטס (איור 3). לטהר את ה-DNA eluted באמצעות ערכת רגיל לקבוע את ריכוזו.

3. ה-DNA משפחה גרירת רגליים

1. ראשית, להרכיב מחדש את שברי כובע אל באורך מלא רצפים באמצעות PCR שבה עצמית הממשלה על בסיס homologies חלקי. לכן, הקים תגובה 50 μl עם 500 שברי מטוהרים נג (שלב 2.4), 10 Phusion μl בופר 10x, 1 μl 10 dNTPs מ"מ, 1.5 DMSO ו μl 0.5 μl פולימראז II Phusion. דגירה 30 שניות על 98 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להפעיל 40 מחזורים של 10 שניות 98 ° C, 30 sec 42 ° C עד 45 ° C 72 שניות, ואחריו שלב 10 הגמר דקות ב 72 ° C.
2. ב-PCR 2 שהתפתח, להגביר מחדש שנאספו גנים כובע על שיבוט לאחר מכן, באמצעות primers אשר נקלטות על ידי רצפי משני צדי המשתמרים (איור 2). לכן, הקים תגובה 50 μl המכיל 2 μl של ה-PCR הראשון (שלב 3.1), כל צבע יסוד בריכוז הסופי של 2 מיקרומטר, 0.5 μl MgCl2,10 μl חיץ 5x HiFi ו 1 μl פולימראז HiFi. אנו ממליצים לרוץ 16-24 PCRs כדי להבטיח תשואות גבוהות מספיק עבור שיבוט שלאחר מכן. בריכת PCRs ולטהר את הלהקה באורך מלא שוק (ג'ל או הערכה).
3. לעכל גן מטוהרים בריכה כובע עם פאק אני עולה לי על שיבוט תוך שכפול, המוסמכת AAV פלסמיד שנשא AAV ITRS (חוזר מסוף כפולות, שכפול אותות אריזה), כמו גם את הגן AAV2 נציג. זה האחרון אמור להיות מלווה אותם אתרים כדי להתאים את הגן שווי הבריכה "במסגרת" (ראה איור 2. לפרטים נוספים). כדי להשיג עיכול מלא של מוצר ה-PCR, דגירה בין לילה עם האנזים עודף.
4. ולקשור את שברי כובע לחתוך כראוי AAV ITR / נציג השדרה ביחס טוחנת 03:01. לעשות 40 μl נפח mastermix הכולל (מספיק ל -20 טרנספורמציות) בריכוז ה-DNA הסופית של 50 ג ng / μl ו דגירה הלילה בגיל 16 °
5. להפוך את התגובה קשירת ידי ערבוב (על קרח) 2 μl עם 30 μl אלקטרו המוסמכת א ' coli (גדלה מ תאים מסחריים ועשה המוסמכת באמצעות כל פרוטוקול סטנדרטי). הוסף לתוך מראש מקורר cuvettes electroporation (1 הפער מ"מ) על קרח. Electroporate ב 1.8 kV, 200 Ω ו - 25 μF. זמן קבוע צריך להיות קרוב ל 5 ms. מיד להוסיף 1 מ"ל מחומם מראש בינוני SOC והעברה בקבוק 250 מ"ל. 20 electroporations כאלה תניב ספרייה עם מגוון של כ 1x10 ⁶ שיבוטים שונים.
6. הוסף 1 מחומם מראש בנפח בינוני SOC על התמורות אספו וללחוץ על 37 מעלות צלזיוס, 180 סל"ד עבור 1 שעה. ואז להעלות את הנפח הכולל ל 800 מ"ל עם מדיום LB בתוספת ampicillin (הריכוז הסופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל) ו - דגירה של 16 שעות אחר באותם תנאים. לטהר את ספריית ה-DNA פלסמיד באמצעות למשל. מגה Qiagen ערכת הכנה.

חובה על כל צעד 3.6: כדי לחשב את המגוון הספרייה מדויק, צלחת aliquOT הפתרון 800 מ"ל (לפני הדגירה ח 16) ב-LB ampicillin צלחות (למשל, 10 μl על הצלחת 10 ס"מ) ומושבות לספור ביום המחרת. כמו כן, כדי לאמת את יעילות דשדוש גבוהה, כגון רצף 24 שיבוטים וליישר אותם הגנים כובע ההורים (ראה גם איור. 8). לבסוף, כדי לאשר את החיוניות ספריית והגיוון תפקודית גבוהה, subclone אקראי הרים גנים לתוך כובע עוזר AAV פלסמיד ולהשתמש בהם כדי לייצר ולנתח וקטורים רקומביננטי בקנה מידה קטן (איורים 4-5) (ראה גם לשלב 5.4 להלן).

4. הפקה של ספריית ויראלי

1. זרע 10 15 ס"מ ² מנות של תאים HEK293T (4.5x10 ⁶ תאים / צלחת) ו 48 שעות מאוחר יותר עם ​​transfect 220 מיקרוגרם AAV ספריה ו 220 מיקרוגרם פלסמיד adenoviral (נדרש AAV התפשטות). לכן, מראש חם PEI (polyethylenimine) ו - 300 mM NaCl ב 37 ° C. לאחר מכן מערבבים 7.9 מ"ל NaCl ו-DNA, ולהוסיף H ₂ O ל volu הכולללי 15.8 מ"ל. בצינור נפרד, לערבב 3.52 מ"ל PEI, 7.9 מ"ל NaCl ו 4.38 מ"ל H ₂ O (כל הכרכים של עשר transfections). לשלב את תערובות (מערבולת) ו דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, לפני הפצת הפתרון באופן שווה על פני כלים (3 מ"ל לכל מנה).
2. לאחר 48 שעות, לגרד את התאים לתוך המדיום ומסובב אותם ב 1200 סל"ד במשך 15 דקות. Resuspend תא גלולה במאגר 6 מ"ל תמוגה (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 50 מ"מ NaHCO ₃₎ ובכפוף 5 בהקפאה ההפשרה מחזורים -80/37 (° C). דגירה עם 50 U benzonase לכל מ"ל של 1 ש 'על 37 מעלות צלזיוס, לפני שצנח פסולת התא בסל"ד 3750 עבור 20 דקות.
3. הכן 15%, 25% ו -40% (עם דילולים μl 2.5 / מ"ל phenolred) iodixanol מ 60% (OptiPrep ב-PBS ח"כ) מניות של PBS, ח"כ (1x PBS, 1 mM MgCl _2, 2.5 מ"מ KCl).
4. הגדרת שיפוע לטיהור AAV באמצעות פיפטה פסטר להוסיף 5 מ"ל וירוס ההשעיה לתוך צינור Beckman מהיר חותם צנטריפוגות (14x89 מ"מ), ואחריו 1.5 מ"ל EACח של 15%, 25% והפתרון iodixanol 40%. למעלה את שיפוע עם חיץ תמוגה.
5. Ultracentrifuge ב K 50.000 עבור 2 שעות על 4 מעלות צלזיוס הרוטור Beckman Ti70.1. לאחר מכן לנקות את החלק החיצוני של הצינור עם אתנול 70%, מקל מחט לתוך החלק העליון של צינור אוורור ולצייר 1.2 מ"ל של חלק iodixanol 40% באמצעות מחט. תשמרי על עצמך כדי לא למשוך חלק מ 25% מכיוון שהיא מכילה ריקים capsids AAV.

5. מיון בחירה

1. בשלב זה, ניתן גם חוזרת להגביר את הספרייה כולה בתאים בתרבית או בבעלי חיים עד capsids chimeric המציגים תכונות הרצויות צמחו (איורים 6-11).
2. כדי לבחור בתאים בתרבית, שיתוף להדביק aliquots שונים של הספרייה (למשל, 1, 10 ו - 100 μl) ו adenovirus-5 לתמוך בצמיחה AAV. בדיקת וריאציות רבות של הספרייה עוזר adenoviral חיוני כמו infectivity הספריה סוג תא נתון לא ניתן לחזות. למסוקתאים לאחר ~ 3 ימים, לחלץ AAV מוגבר באמצעות הקפאה, הפשרה, adenovirus להשבית למשך 30 דקות ב 56 תאים חדשים מעלות צלזיוס, להדביק מחדש. חזור עד 5 פעמים עד capsids ברורים להיות מועשר (לאמת על ידי רצף).
3. לבחירה אצל בעלי חיים, להדביק עם הספרייה ולחלץ הרצוי רקמות או תאים מסוג אחר שבוע ~ 1. לא לשתף להדביק עם adenovirus כמו זה יגרום רעילות לרעה על בעלי החיים. להציל את ה-DNA הנגיפי באמצעות PCR בעזרת פריימרים כמו פעם (איור 2), חוזרת לשבט בריכה כובע, לייצר ספריית חוזר טרי עד capsids ברורים להיות מועשר (לאמת על ידי רצף).
   1. התנאים המדויקים (נפח, titer, המסלול) לבחירת in vivo יהיה תלוי רקמות המטרה של עניין. עבור כבד, עכברים נגועים בדרך כלל עם 1x10 ¹¹ עד ¹² 1x10 חלקיקים נגיפיים בנפח כולל של 200 PBS μl באמצעות הזרקה לווריד הזנב (IV). הגורם המגביל הוא בדרך כלל titer ויראלי של originaהכנה אני, כי הזרקת AAV ¹² 1x10 ב μl 200 דורש titer של מ"ל לפחות 5x10 / ^12, שלא במעבדות כל יכול להשיג באופן שגרתי. לפיכך, בעוד titer היותר מועיל זיהום 1 (כי הספרייה עדיין לא מועשר עבור capsids יעיל ברקמה מסוימת וייתכן ובכך יש infectivity הכוללת נמוכה יחסית), מומלץ להשתמש לפחות 1x10 ¹¹ חלקיקים לכל העכבר לבחירה הכבד.
   2. אם עכברים מרובים זמינים, כדאי מאוד להכניס מספר חלקיקים שונים הדומים בהרכבם הבחירה בתאים בתרבית, ולהשתמש כמה עכברים בכל קבוצה (ואז לרכז את כבדי שנאספו בתוך כל קבוצה) על מנת לצמצם שונות ולהגביר את ההצלחה ארנונה, למשל 3 עכברים בבית 1x10 ¹¹ ו -3 עכברים ב ¹² חלקיקים 1x10.
   3. מאז AAV הוא וירוס פתוגניים שאינם ושכפול, פסול (ללא helpervirus), אין תופעות לוואי לחפש בהעדר עדןovirus.
   4. עבור euthanization, בעלי חיים היו anesthesized באמצעות מכשיר האדים isoflurane ו להרדים לאחר מכן באמצעות פריקה צוואר הרחם.
   5. הרקמות (כבד במקרה זה) נקצרו לאחר החיות אושרו להרדים. באופן כללי, אין צורך גם ברקמות אחרות perfuse החיות או למסוק AAV-נגועים איברים לפני המוות, שכן ה-DNA AAV יציב והוא יכול בקלות להיות ניצל מתאי / רקמות קפואות.
4. ללמוד capsids יחיד (מהספרייה (שלב 3.6) או לאחר הבחירה (מדרגות 5.2-5.3)), לייצר וקטורים AAV קידוד גנטי הכתב (למשל, ה-GFP ⁶⁾ על ידי ביצוע צעדים 4.1-4.5. לכן, לשבט את הגן שווי של עניין תוך עוזר AAV תקן פלסמיד ^2. בשלב 4.1, משולש transfect את התאים עם 14.7 מיקרוגרם כל אחת AAV וקטור (קידוד הכתב), AAV עוזר וגם עוזר adenoviral. להדביק תאים בתרבית או בעלי חיים עם הנגיף מטוהרים בסכומים שונים determiנה יעילות התמרה למשל באמצעות FACS או במיקרוסקופ.

6. נציג תוצאות

השימוש בפרוטוקול שמתואר כאן בדרך כלל התוצאות ספריות ויראלי עם מגוון של כ 1x10 ⁶ capsids ייחודיים אז מה שיכול להיות מוקרן עבור חלקיקים בודדים המציגים את רוב או את כל התכונות הרצויות על קו נתון נייד או בבעלי חיים. בחלק הבא, נספק דוגמאות מייצגות עבור תוצאות כאלה במבחנה או הקרנות vivo.

לפני כן, עם זאת, אנחנו רואים את זה חשוב שוב להדגיש את התועלת של ניתוח שיבוטים בודדים מספריית הפלסמיד המקורי הפונקציונליות שלהם והמגוון (לא חובה על כל צעד 3.6). הסיבה לכך היא כי שני האחרונים הם פרמטרים קריטיים תנאים מוקדמים עליונה להצלחת הבחירה של הספרייה ויראלי בפועל כי הוא עשוי ספריית פלסמיד. לכן, ניתן באופן אקראי לקחת אחת גררכובע הגנים ולהשתמש בהם כדי לייצר וקטורים AAV רקומביננטי (תמציות גסים או חלקיקים מטוהרים, תלוי במידה הרצויה של דיוק) המבטאים גן הכתב לזיהוי בקלות לכימות. Assay טיפוסי להשוות בין גרסאות שונות קפסיד אז הוא מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כפי שמוצג בדוגמה נציג איור. 4.

שיטה חלופית היא FACS מבוסס מדידה של ביטוי גנים ניאון כתב המחזיקה את היתרונות הנוספים הוא גם מאפשר להגדרה של ביטוי גנים לכל תא, בתוספת שזה עובד עבור תאים ההשעיה. איור. 5 מראה תוצאה אופיינית מניתוח כזה FACS מבוסס על הנפט הגולמי lysates AAV וקטור בסוגי תאים שונים.

כי את הבחירה המתואר לעיל של מפלצות כובע בודדים היא אקראית מוגבל, זה כמובן לא שימושי כגישה בפועל להעשרת המועמדים הרצויים. במקום זאת, הבחירה של viהספרייה RAL בתאים או ברקמות היעד בבעלי חיים מתאים יותר. כפי התנאים והפרמטרים ישתנו עם כל יישום, אנו רק להדגיש הנחיות נציג כמה ותוצאות.

הבחירה הקלה ביותר היא איטרטיבי הגברה הספרייה על שורות תאים בתרבית או תאים ראשוניים (שלב 5.2). מאז AAV דורש adenovirus שיתוף זיהום להפצת שלו, התאים היעד חייב להיות רגישים עבור adenovirus. אפשר לאחר מכן לגדול להדביק אותם למשל צלחות 6-המחזיקים גם מספרים סלולריים מספיקות לכל גם כדי להבטיח כיסוי מלא של הספרייה. המושג החשוב השני הוא כי מאזן AAV ו adenovirus הוא עדין, AAV יותר מדי ימנע adenovirus, בעוד העולה על זו האחרונה תהיה להרוג את התאים (בניגוד AAV, adenovirus גורמת לזיהומים ממס) לפני AAVs יוכלו לשכפל.

עם זאת, מאז infectivity ספריה לסוג תא מסוים אינו ידוע, למצוא AAV "טוב": יחס adenovirus באשר גם יכול להפיץ במקביל דורש בדיקה של שילובים שונים של מנות של הספרייה עוזר adenoviral (למשל 10:01, 01:01 ו - 01:10). ליתר ביטחון לזיהום adenovirus חזק הוא המופע של תופעות cytopathic שלושה ימים לאחר חיסון לנגיף, שמעידים עיגול התא ניתוק כפי שניתן לראות בתרשים. 6. ולהיפך, שימושיות לקריאה מתוך לזיהום AAV וגם הגברה הוא זיהוי של חלבונים על ידי קפסיד המערבי סופג, באמצעות נוגדנים B1 המכירה שמור ביותר AAV capsid epitope (איור 7) ^7.

החלטה חשובה היא אז מה AAV גולמי תמציות לבחור לזיהום מחדש לאחר מכן של תאים חדשים (שלב 5.2). באופן אידיאלי, אחד ייקח את אלה שבהם קפסיד להקות AAV בולטים לפחות (איור 7), כי אלה מצביעים על זיקה הדוקה גנוטיפ, פנוטיפ. האחרון מתאר מצב שבו הגנום קידוד גרסה capsid שבטוחארוז ממש לתוך capsid המקביל. כדי להשיג ולשמור על זיקה הדוקה גנוטיפ, פנוטיפ היא המפתח לבחירה מוצלחת של מועמדים נגיפיים בודדים כפי שהוא בתורו מבטיח capsids בעלי תכונות הרצויות לספק את התבנית הגנטית מאותו מקור לתוך התאים במהלך סיבובים רצופים זיהום. לכן, מומלץ לבחור את תמציות גסים עם הביטוי capsid מתונה של זיהום מחדש ולהשתמש בכמויות מצומצמות. יחד, שתי צעדים כדי למנוע עומס יתר של תאים נדבקים עם קפסיד / הגנום שילובים שונים שעלולות להפריע הצמדה גנוטיפ, פנוטיפ פעם מחדש נגועים וירוסים להתחיל לשחזר מחדש את אריזת הגנום שלהם לתוך שאינם מאותו מקור capsids.

בנוסף, חשוב לעקוב אחר מגוון הספרייה במהלך סבבי דלקות חוזרות ונשנות של רצפי DNA. באופן אידיאלי, אחד ישים לב שינויים בהרכב שיבוטים בודדים המעידים על הבחירה המוצלחת, כלומר accumulation של שברי סרוטיפ והפסדים שונים של אחרים, כפי שהודגם בתרשים. 8. במקרה מושלם, רק מעטים או אפילו שיבוט אחד בסופו של דבר להתגלות אשר לאחר מכן ניתן לנתח כפי שתואר לעיל. אם, לעומת זאת, אין משמרות הם נצפו לאחר ארבעה או חמישה קטעים, צריך גם להגביר את הלחץ הבחירה (ראו דיון), או סבור כי הקו הסלולרי משמש אולי כי זה בלתי הולם עלולים לסבול מדי מהזנים אליהם יותר מדי.

עבור הגברה ספריית in vivo (שלב 5.3), אותם כללים חלים ושיקולים, עם שני הבדלים קריטיים: ראשית, לא שיבוטים מסך שנבחרו באופן אקראי בבעלי חיים, בשל העלויות הכרוכות ושיקולים אתיים. שנית, אף אחד לא ישתפו להדביק עם adenovirus עוזר כפי שהוא גורם רעילות או הרוגים בבעלי חיים, וכן זיקה adenoviral היה להגביל את הבחירה תאים רגישים לנגיף עוזר. במקום זאת, ספריה AAV הוא החדיר לתוך הדואר בעלי חיים, שניצלו מתאי היעד / רקמה על ידי ה-PCR (איור 9) ולאחר מכן מחדש משובט מחדש ארוז לסיבוב זיהום חדש. כמו בכל בחירה בתרבות, תהליך זה חוזר על עצמו עד מועמדים בודדים צמחו.

ללא קשר הליך הבחירה, השלב האחרון הוא אימות של גרסאות קפסיד המועשר מערכות מתאימות. תאנים. 10 ו -11 מייצגים להראות דוגמאות הבחירה הקודמת שלנו של מפלצות AAV המבצעות באופן יוצא מן הכלל בתרבות רקמה או הכבדים של העכברים. כפי שניתן לראות באיור. 10, 1 שיבוט בפרט (AAV-DJ ³⁾ אכן בביצועיו אוסף של שמונה wildtypes AAV טבעי במגוון רחב של שורות תאים. לבסוף, עוד שיבוט שנבחר קווי hepatoma בתרבית מפגין זיקה גבוהה יותר כבד Murine ובהתאם פחות מחוץ המיקוד כאשר חדורים שולי מ וקטור AAV8 עוצמה שליטה נבדק com ישירה לעכברים בוגריםparison (איור 11). שים לב, אם כי להיות יותר ספציפי לכבד, שיבוט AAV-DN למעשה transduces את האיבר קצת פחות יעיל מאשר AAV8. מבחינה זו, AAV-DN היא דוגמה מייצגת טובה לתוצאה של האבולוציה AAV ובחירת המועמדים הסופיים שבהם בדרך כלל להציג מספר תכונות רצויות, אך אינם מושלמים בהכרח בכל ההיבטים.

איור 1 תוכנית:. הנדסה סינתטי AAV capsid באמצעות DNA המשפחה דשדוש ובחירת הבאים בתאים או בבעלי חיים. צעדים פרוטוקול מודגשים באפור.

2. איור AAV גן שווי התורם פלסמידים הנמענים להשתמש במעבדה שלנו על ה-DNA המשפחה גרירת רגליים ודור הספרייה. לציין כי אלה דוגמאות מייצגות בלבד, וכי האתרים המדויקים רצפיםיכול להיות מותאם אישית. התורם הבסיסי שלנו פלסמיד נגזר זמינים מסחרית pBlueScript II KS (+) וקטור שאנו מהונדסים להכיל מחייב פריימר הראו כמו גם אתרי הגבלה, מתואר על ידי חצים או משולשים, בהתאמה. אנחנו משובטים אז הגנים כובע של AAV קפסיד 1-9 (מוגבר עם primers capF / R) לתוך פלסמיד זה, להיות מוקף פאק אני עולה אתרים שאני הגבלה. Primers T3 ו - T7 משמשים בידוד שווי בשלב 2.2, תוך הגברה מאוחר יותר מחדש התאספו רצפים chimeric (שלב 3.2) ניתן להשיג באמצעות משני זוגות פריימר SAF / R או CUF / R, או הן PCR מקוננת. הנמען שכפול-המוסמכת הפלסמיד נושא חוזר AAV מסוף הפוכים (ITRS, שכפול אותות האריזה) משני צדי הגן AAV2 נציג בשליטת היזם AAV P5. פאק אני עולה אתרים שאני הגבלת במורד הזרם של נציג לאפשר "במסגרת" שיבוט הבריכה של דשדש גנים כובע.המוצגים פריימר Lseq אתרי הקישור שימושיים שווי רצף הגן (שלב 3.6).

איור 3. דוגמא DNase אני תקציר של גנים שווי שוק (AAV2, 8 ו - 9). המוצג הוא ג'ל אלקטרופורזה agarose ניתוח של תוצרי גנים שווי מעכל באמצעות פעמים הצביע דגירה שונים (דקות: שניות). ליין U מראה שווי מעוכלים קלט שבר בריכת כמו שליטה. גודל של סמן להקות ה-DNA של נתיבי M נמצאים kilobases. בדוגמה זו, אידיאלי מעכל התקבלו עם זמני הדגירה של 1:45 או 2:00 דק ', אשר הניב את שיא העיקרי המועדף סביב 100 עד 500 זוגות בסיסים (תיבת צהוב).

איור 4. דוגמה לניתוח מיקרוסקופיה מבוססת על שלוש שורות תאים אנושיים נגועים 5 שונה יש רקומביננטי AAV Yfp-להביעctors (שמות על גבי) עשה עם גנים כובע גררה את רגליה נבחר באקראי מתוך הספרייה המקורי מבוסס על AAV2, 8 ו -9.

איור 5. דוגמה לניתוח FACS מבוסס על ארבעה סוגי תאים נגועים (על פי עשרה דילולים סדרתיים) עם 18 שונים Yfp-לבטא וקטורים רקומביננטי AAV (שמות על גבי, כולל אלה של איור 4.) עשה עם גרר גנים כובע שנבחרו באופן אקראי מהספרייה המקורית (AAV2, 8 ו - 9). הביטוי Yfp היה בצבעים להדמיה יותר קל. אחוזי המתוארים הם של transduced תאים, לפיה שחור תמיד מצביע על 0% לבן המספר הגבוה ביותר נמדד כל סוג תא. B2 Clone (אדום) מדגים שיבוט עם היעילות הכוללת העניים, כפי שניתן לצפות מן capsids נבחרו. שים לב, ניתוח FACS רגיש יותר והוא יכול לשמש גם עבור תאים ההשעיה (כגון SupT1) כי הם נוחים פחות במיקרוסקופ. הו, אנושי, MU, murine.

איור 6. מראה אופייני של תופעות cytopathic בתאים (הלה במקרה זה) אחרי פרודוקטיבי שיתוף זיהום AAV ו adenovirus. תאים נותרו גם נגוע (פאנל שמאל למעלה) או נגוע הסכומים המצוין (חלקיקים לכל תא) של adenovirus.

איור 7. גילוי של ביטוי החלבון capsid AAV ידי המערבי סופג כמדד לזיהום ספריה הגברה. כתם שמאל מראה תאים נגועים שיתוף עם אמצעי אחסון שונים (ב μl) של הספרייה AAV ו adenovirus עוזר. הראשונים שני נתיבים הם דוגמאות טובות לדוnditions מניב להבחין בקושי ביטוי AAV חלבון, המציין מספקת אך לא מופרזת זיהום AAV וגם הגברה ולכן הצמדה הרצוי חזק גנוטיפ, פנוטיפ. לכן, 0.1, 1 או 10 μl של supernatants אלה שימשו זיהום מחדש של תאים חדשים (כתם מימין). התאים לנתיב C נדבקו AAV לבד כביקורת שלילית (אין ביטוי לזיהוי בשל העדר helpervirus).

איור 8. השוואת רצפי חלבונים (במדבר הם חומצות אמינו) של AAV שיבוטים מהספריה מבוססת על AAV2, 8 ו 9 לפני ואחרי הבחירה. רצפים מעל הקו האדום להראות את AAVs ההורים. החצים הסגולים מציינים הומולוגיים אירועים רקומבינציה. החץ האדום מסמן צולבות על בין AAV2 ו AAV9 ציין את כל שיבוטים שנבחרו.

איור 9. </ Rescue> חזקה של נגוע בהצלחה שיבוטים AAV מרקמות העכבר באמצעות PCR. בדוגמה זו, AAV גנים כובע היו PCR-הגברה של כבדי עכבר חילוץ שבוע לאחר עירוי ספריית היקפי, באמצעות זוג פריימר SAF / R (איור 2). ליין 1 מציג את הלהקה הצפוי 2.2 kilobase, ואילו במסלול 2 היא השליטה הלא התבנית. בעקבות פאק אני והגבלת עולה לי, השברים היו מוגבר מחדש משובטים אל הנמען המקורי פלסמיד (איור 2) לייצור לאחר מכן מחדש עירוי של ספריה משנית. גודל של סמן ה-DNA של להקות M נתיבים מסומנים ב kilobases.

איור 10. דוגמה עבור ביצועים מעולים של AAV מועשר הכימרה בתאים בתרבית. Clone AAV-DJ דווחה על ידינו לפני ^3, אלא בעיקר מהווה הכלאה בין קפסיד AAV 2, 8 ו -9, ו נבחר מתוך librar Y המכיל את שלושת בתוספת 5 קפסיד נוספים בתאי כבד אנושיים בנוכחות נסיובי אדם אספו. כדי להשוות את היעילות שלה לשמונה קפסיד טבעיים AAV (מסומנת 1-6, 8 ו -9 על גבי), גנים כל כובע נעשה שימוש כדי לייצר מטוהרים עצמית משלימים Gfp-לבטא וקטורים ^8,19. אלה היו מנורמל להכיל 2x10 ⁹ הגנום וקטור לכל מ"ל ולאחר מכן השתמשו כדי transduce את שורות תאים מופיע בצד של פי עשרה דילולים סדרתיים. שלושה ימים לאחר מכן, GFP-לבטא תאים נספרו ו titers זיהומיות נקבעו על ידי לקיחה בחשבון את גורם לדילול. בניגוד לקוד באיור. 5, בצבעים כהים כאן עולה infectivities גבוהים יותר לכל מספר החלקיקים. כפי שניתן לראות, שנבחר AAV-DJ כימרה בביצועיו את כל wildtypes AAV הטבע, הממחיש את ההצלחה של תוכנית הבחירה מיושם. fibr, fibroblasts, חה, אוגר, הו, אדם, MU, Murine, סי, סימיאן.

>

איור 11. דוגמה לניתוח של AAV נבחרת כימרה בכבד העכבר. Clone AAV-DN נבחרה על תאים hepatoma Murine ולאחר מכן להשתמש כדי לייצר וקטורים בלוציפראז-להביע רקומביננטי ^8. המוצגים הם עכברים נציג (3 לכל קבוצה) שבוע לאחר עירוי היקפי של מנות שוות של וקטור זה או שליטה על AAV8 wildtype, אחד החזקים ביותר מבודד טבעיים הידועים בכבד העכבר ^9. שים לב כי בזמן שיבוט AAV-DN נותן ביטוי מעט הכוללת פחות בכבד (פאנל (אני)), היא ספציפית יותר על האיבר הזה שכן הוא מציג באופן משמעותי פחות מחוץ למיקוד של הכבד ללא רקמות פעם אחת את הביטוי רמות כבד היה התאמה באמצעות תוכנת הדמיה (פאנל (II)).

Discussion

הנה, יש לנו התווה צעדים ניסיוניים חיוניים והנחיות AAV capsid הנדסת באמצעות DNA המשפחה גרירת רגליים ועל האבולוציה בתאים או בבעלי חיים. בעיקרו של דבר, פרוטוקולים אלה הן גרסאות סטנדרטיות של הנהלים שאנחנו דיווח לראשונה בתחום AAV בשנת 2008 ^3. בעוד גל של מחקרי מעקב על ידי אחרים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
אני DNase	Invitrogen	18068-015
Polyethylenimine (PEI)	Sigma-Aldrich	408727
הגבלת אנזימים	חוד	שונים
האנזים T4 DNA	חוד	M0202T
ג'ל ערכת חילוץ	Qiagen	28704
Phusion II Kit פולימראז	Finnzymes (חוד)	F-540S
HotStar HiFi ערכת פולימראז	Qiagen	202602
DMSO	Finnzymes (חוד)	F-540S (חלק ערכת)
EDTA (25 מ"מ)	Invitrogen	18068-015 (חלק ערכת)
טריס	רוט	4855.2
Ampicilin מלח נתרן	רוט	K029.2
dNTPs (10 מ"מ, 100 μl)	Invitrogen	18427013
Iodixanol (OptiPrep)	ציר ה-Shield	1114739
Phenolred	מרק	107241
הפלסמיד הכנה מגה בערכה	Qiagen	12181
Ultracentrifuge	Beckman Coulter-	אופטימה L90K
חותם מהיר צנטריפוגות צינורות	Beckman Coulter-	342414
Electroporation היחידה	ביו רד	GenePulserXcell
תרמית Cycler	Eppendorf	Vapo הגנה
חימום בלוק	BIOER	MB-102
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	אולימפוס	IX81
FACS Analyzer	Beckman Coulter-	Cytomics FC500 MLP
MegaX DH10B T1R תאים	Invitrogen	C640003
Benzonase	מרק	101695
Adenovirus-5	ATCC	VR-5
pBlueScript II KS (+) פלסמיד	Stratagene	212207
cap5F (פאק באתר אני בצהוב, cap5 ספציפיים רצפים באותיות מודגשות): GACTCTTAATTAACAGGT ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC	IDTDNA	התאמה אישית פריימר
cap5R (ASC אני באתר בירוק, cap5 ספציפיים רצפים באותיות מודגשות): GTGAGGGCGCGCC TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC	IDTDNA	התאמה אישית פריימר