ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב<em&gt; באתרו</em&gt; זלוף של רקמת ריאה וכתמי X-גל של<em&gt; LacZ</emגידול תאים&gt; תייג-

Summary

פרוטוקול הרומן שדווח במחקר הנוכחי מאפשר איתור סלקטיבי של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי שילוב באתרו זלוף ריאות וקיבעון וX-גל הכתמה של LacZ מתויג תאים סרטניים.

Abstract

גרורות הן סיבת מוות העיקרי ברוב סוגי הסרטן, ולכן התמקדות עיקרית בחקר הסרטן. עם זאת, זיהוי של micrometastases ידי radiologic הדמיה וההצלחה במיגור הטיפולי שלהם יישאר מוגבל.

בעוד מודלים של בעלי חיים הוכיחו להיות כלי רב ערך עבור סרטן ¹ מחקר, הניטור / ההדמיה של micrometastases עדיין מהווה אתגר והערכה מדויקת של התפשטות גרורה במחקרים פרה פוטנציאלי מוביל לתוצאות מאכזבות בניסויים קליניים ^2. כתוצאה מכך, יש עניין רב בשיטות זיקוק לבסוף לאפשר זיהוי לשעתק ואמין של גרורות עד לרמת התא הבודדה ברקמה נורמלית. ההתמקדות העיקרית לכן היא על טכניקות, המאפשרים זיהוי של תאים סרטניים בגוף חי, כמו מייקרו טומוגרפיה ממוחשבת (CT מייקרו), טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), פליטת אור או דימות פלואורסצנטי <sup> 3,4. כרגע אנחנו ייעול שיטות אלה לניטור vivo של גידול ראשוני וגידול בגרורות סרטן עצמות מודלים שונים. כמה טכניקות אלו יכולות גם לשמש לניתוח vivo לשעבר של גרורות לצד שיטות קלסיות כמו qPCR ^{5, 6} FACS או סוגים שונים של צביעה היסטולוגית. כאמת מידה, הקים במחקר הנוכחי transfection או התמרה של תאים סרטניים עם גן lacZ היציב קידוד חיידקי אנזים β-גלקטוזידאז שחילוף חומרי מצע chromogenic 5-4-כלורו-3-indolyl-beta-D bromo -Galactopyranoside (X-גל) לכחול וסגול, ⁷ צבע מסיס ומאפשר את הצביעה רגישה מאוד סלקטיבית histochemical הכחולה של תאים סרטניים ברקמת vivo לשעבר עכבר לרמת התא הבודדה, כפי שמוצג כאן. זהו כלי עלות נמוכה ולא ציוד אינטנסיבי, המאפשר אימות מדויקת של גרורות ⁸ במחקרי ההערכה חדשהטיפולי ticancer ^9-11. גורם מגביל של מכתים X-gal הוא ניגודיות הנמוכה לדוגמא כתמי דם אדומים הקשורה ברקמות כלי דם כן. ברקמת ריאת בעיה זו יכולה להיפתר על ידי זלוף ריאות באתרו, טכניקה שהוקמה לאחרונה על ידי Borsig et al. Perfused ¹² שריאות של עכברים תחת הרדמה כדי לנקות אותם מהדם ולתקן ולהטמיע אותם באתרו תחת אינפלציה דרך קנה הנשימה. שיטה זו מונעת גם הקריסה של ריאות ובכך שומרת על המורפולוגיה של הריאות alveoli הפונקציונלי, אשר משפר את האיכות של הרקמות לניתוח היסטולוגית. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול חדש, שמנצל את היתרון של שילוב של כתמי X-גל של lacZ-להביע תאים סרטניים ובאתרו זלוף וקיבוע של רקמת ריאה. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מעודן רגישות גבוהה של תאים גרורתי בודדים בריאה ואפשר לנו בשנים האחרונה במחקר לדetect micrometastases "הרדום" ריאה במודל עכבר ^13, שתואר במקור להיות שאינם גרורתי ^14.

Protocol

1. זלוף וקיבוע ריאות באתר

1. הרדם עכברים בהזרקת ה-IP של ~ פוספט μl 150 נאגר מלוח (PBS) המכיל 112.5 מ"ג / ק"ג (משקל גוף) קטמין, xylazine 16.5 מ"ג / ק"ג, ומ"ג / ק"ג 15 acepromazine (או על ידי הרדמה אחרת המכילה משככי כאבים מתאימים).
2. כאשר הרפלקסים של העכבר כבר לא נצפו, לתקן את זה על שולחן ניתוחי גב כלפי מטה ומרטיב את הפרווה עם אתנול 70% לחלקלקות את השערות למטה.
3. פתח את העור מהבטן עד הצוואר ולמשוך אותו לצדדים או להסיר אותו.
4. פתח הצפק ובית החזה לגודל בשפע. למנוע קרע של כולים גדולים (jugularis הווריד למשל) כדי להימנע מיעילות מופחתת של זלוף שלאחר מכן.
5. חותך את הווריד הנבוב caudalis מתחת הכבד.
6. השתמש במזרק 20 מ"ל מצויד ב21 ז'- 24G מחט להזריק לאט 10-15 המ"ל PBS לחדר הימני של הלב הפועם עד הריאות הן לבנות לחלוטין והלב מפסיק לפעום (asystole).
7. צבוט את כלי הדם מעל הכבד והסרעפת עם מהדק של כלי דם.
8. השתמש במזרק מ"ל 10 מצוידים ב21 ז'- 24G מחט להזריק ~ 2 מ"ל של paraformaldehyde 3% (PFA) ב PBS לחדר ימין.
9. לחשוף את קנה הנשימה מחוץ לבית החזה. השתמש באותו המזרק כדי להזריק ~ 3 מ"ל של 3% PFA ב( מחוץ לבית החזה) PBS גולגולת לתוך קנה הנשימה עד לריאות מנופחות. מייד לאחר הסרת המחט, לצבוט את קנה הנשימה של הזנב לנקב עם מהדק של כלי דם ולחכות 10 דקות כדי לאפשר לקיבעון.
10. תחצה את כלי הדם מעל מהדק כלי הדם, להסיר את המהדק ולהזריק ~ 2 המ"ל PBS לתוך חדר ימין להסיר PFA העודף.
11. לנקב את החלקים התחתונים של כל אונות הריאה עם מחט, להסיר את המהדק של כלי הדם בקנה הנשימה ולהזריק 3-5 מ"ל של תמיסה של PolyFreeze הטבעה בינונית / PBS 01:01 לקנה הנשימה של הזנב לנקב הראשון עד PFA ב ריאותאונות מוחלפות בפתרון.
12. הסר את הריאות בזהירות על ידי משייכת הלב עם מלקחיים וtransecting רצועות רקמות חיבור, כלי דם וקנו נשימה. שמור על הלב הקשור לריאות.
13. תלוי איך להמשיך עם ניתוח רקמת הריאה להמשיך בפרוטוקולים המפורטים בסעיפי 2 או 3. אם אתה רוצה לעשות את שני הניתוחים, להסיר אונת ריאה אחת והמשך כמתואר תחת 3. לעבד את האונות הנותרות הקשורים ללב כפי שתואר תחת 2.

2. ויזואליזציה של תאי גידול גרורתי lacZ מתויג-באונה של ריאות שלמות

1. הנח את הריאות בכוס פלסטיק עם מכסה סגירה הדוק ולתקן את זה עם פורמלדהיד 2% ב PBS בטמפרטורת חדר במשך 30-60 דקות.
2. הסר פתרון קיבעון ולשטוף ביסודיות 3 פעמים עם PBS.
3. הוסף לפחות 10 מ"ל מוכן טרי 5-Bromo-4-כלורו-3-β-indolyl-D-galactoside (X-גל) (פתרון מנייה מכתים פתרון ה-X גל [40 מ"ג / מ"ל ​​בDimethylformamide] 1:40 דילול בפתרון בסיסי כתמים; pH 7.1 (טבלה 1); להגן מפני אור).
4. שים פיסת הגזה על גבי הריאה שהחייה כדי לשמור אותו לחלוטין בפתרון ולמקם את המכסה רק באופן רופף על הסיר על מנת לאפשר חילופי האוויר.
5. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3-5 שעות מוגנות מפני אור.
6. הסר פתרון X-גל, לשטוף פעם עם PBS להסיר פתרון ה-X גל שיורים (אופציונלי) ולהוסיף 4% PFA.

3. ויזואליזציה של תאי גידול גרורתי lacZ מתויג-בCryosections ריאות

1. מלא מראש עובש כותרת הטבעה ל1 / 3 עם מדיום הטבעת PolyFreeze מהול. שים את אונת הריאה על גבי ולהתמלא בהטבעה בינונית עד שהאונה מכוסית לגמרי. נסה למנוע בועות.
2. דגירת הריאות המשובצות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
3. אז להקפיא את הריאות המשובצות לאט בתערובת של קרח יבש וIsopentane ולאחסן ב -80 ° C.
4. חותך מיקרומטר cryo 7-10קטעים על cryostat ולעגן אותן בשקופיות מיקרוסקופ SuperFrostPlus.
5. דגירת הסעיפים מייד עם פתרון מכתים X-גל על ​​37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות בתא humidified.
6. שטוף את השקופיות ב2 פעמי PBS למשך 5 דקות ולאחר מכן לזמן קצר במים מזוקקים.
7. Counter-הכתם אדום במהירות גרעינית ל10-30 שניות, לשטוף במים מזוקקים ולעגן את השקופיות עם Immu-הר.

4. נציג תוצאות

Asai et al. דיווח במאמר המקורי על מודל דאן נגזר-OS LM8 העכבר שגידולי sc עיקריים הנגזרים מתאי דאן ההורים, שונים מאלה הנגזרים משורת התאים גרורתי מאוד LM8 משנה, לא באופן ספונטני בצורת גרורות בריאות בגילוי עכברי syngeneic C3H ^14. עם טכניקות כאן שדווחו, אנו reinvestigated ההיווצרות של גרורות בDunn/LM8 מודלי OS עכבר. נצלנו היציב דאן lacZ-transduced וLM8 תאשל ושל פרוטוקול לזלוף באתרו ריאות וקיבעון בעכברים. תמונות מייצגות של ריאות perfused ולא perfused של עכברים שהוזרקו תת עורית עם lacZ-transduced ולא transduced השליטה דאן וLM8 תאים מוצגים באיור 1. בעכברים הוזרקו תאי בקרת דאן, גרורות מאקרוסקופיים ומיקרוסקופיות נותרו בלתי ניתנות לגילוי בריאות הלא perfused וperfused (איור 1 א, I-IV). אבל, באופן מעניין, בעכברים הוזרקו תאי דאן-lacZ, כתמי X-gal חשפו micrometastatic מוקדים כחולים של תאים בודדים או באשכולות של תאים קטנים (<0.1 מ"מ) על פני השטח של ריאות שאינן perfused (איור 1 א, ו). ב זלוף וקיבעון אתר של ריאות נוספות שפרו את יכולת הגילוי של דאן-lacZ micrometastases (איור 1 א, ח). עם זאת, תולדה למוקדים מקרוסקופית לא נצפתה (איור 1 א, נ, ז).

בעכברים שהוזרקו עם LM8 תאי בקרה, שקופים למחצה, בקושי נראה macrometastatic מוקדים גדולים מ -0.1 מ"מ בקוטר הוכרו ריאות הלא perfused (האיור 1B, ט). הטפטוף של הריאות (האיור 1B, ג) לא שפר את זיהוי של המוקדים. עם זאת, בעכברים שהוזרק תאים מרובים LM8-X-lacZ גל מוכתם כחול מאקרו-(התרשים 1B, v) וmicrometastases (האיור 1B, ו) התגלו על פני השטח של איברים שאינם perfused. יתר על כן, זלוף של ריאות נוספות שפר את יכולת הגילוי של מקרו וmicrometastases (האיור 1B, ז - ח). כתוצאה מכך, מייקרו וmacrometastases הפך גלוי בצפיפות גבוהה יותר ומספר גדול יותר, בעיקר בשל השקיפות של רקמת perfused שבמוקדים מתחת לפני שטח האיבר הפכו גם גלויים.

שעות נוספותניתוח istological באמצעות cryosections של רקמת ריאה אשר detectability המשופרת של גרורות בריאות בעכברים שהוזרקו עם דאן lacZ-transduced וLM8 תאים. בעכברים עם גידולים ראשוניים מקורם דאן-lacZ או תאי LM8-lacZ, שלא כמו בעכברים עם גידולים ראשוניים של תאי בהתאמה בקרה, micrometastases או תא מוקדים אפילו אחת הוכרו בסעיפי ריאה (איור 2). יתר על כן, היו גם יותר macrometastases נראה בבירור בעכברים הוזרקו תאי LM8-lacZ מאשר בבעלי חיים הוזרקו שליטת LM8 תאים (איור 2 ג, ד).

איור 1. איתור של גרורות ספונטניות של הלא transduced (I-IV) וlacZ-transduced (V-VIII) דאן () וLM8 (ב ') בתאים שאינם perfused (I, II, VI, V) וperfused (ג, ד, ז, ח) ריאות בעכברי C3H. גרורות בנציג X-גלאון staריאות לעצמה שלמה (v, ז בA ו-B) והתקריבים מתאימים (VI, VIII בA ו-B) נראה כחול. Macrometastatic המוקדים (> 0.1 מ"מ) באיברים של עכברים שהוזרקו עם LM8 תאים שאינם מתויגים-(I-IV בבוקר) מסומנים בכוכביות. אזור שמוצג בצילומי תקריב הוא נציג לריאות שלמות. ברים בקנה מידה של 1 מ"מ מצביעים בתמונות של ריאות שלמות ו0.1 מ"מ בתקריב. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2. איתור של דאן וLM8 micrometastases בcryosections ריאה. קטעי רקמת ריאה מוטבע אוקטובר הודגרו בפתרון מכתים X-גל על ​​37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות בתא ולאחר מכן humidified counterstained באדום מהר גרעיני. חיצים מצביעים על micrometastatic המוקדים המוכרים בחלקי ריאות של עכברים שהוזרקו עם דאן-lacZ (B) או תאי LM8-lacZ (ד '). Micrometastases נשאר בלתי ניתן לגילוי בסעיפי ריאות של עכברים שהוזרקו עם דאן אינו transduced () או LM8 תאים (C). ברי קנה מידה מצביעים 0.1 מ"מ.

Discussion

התוצאות שהוצגו כאן במודל עכבר Dunn/LM8 OS להדגים את כוחה של השיטה החדשה שהוקמה שמשלבת מכתים X-הגל של תאים סרטניים lacZ מתויג-עם זלוף באתרו / קיבוע של רקמת ריאה. זה שילוב של שתי הטכניקות מאפשר גילוי רגישות גבוהה של נגעי micrometastatic עד לרמת התא הבודדה ומשפר גם את ההדמיה של macrometastases על פני הריאות (איור 1), כמו גם בחלקי ריאה (איור 2). בעוד מכתים X-הגל גם מאפשר זיהוי של גרורות (מייקרו) באיברים אחרים, זלוף באתרו / קיבעון משפר את יכולת הגילוי של גרורת מוקדים ברקמות אחרות מאשר הריאה רק במעט בגלל צבע דם ורקמות הקשורה הטבעי ¹³ איברים אלה. גם אם זלוף מופנה לאיבר אחר, כגון הכבד, הסרת הדם הייתי חלקי בלבד לשפר את הימור הניגודמכתים Ween X-גל והצבע הטבעי של האיבר. עם זאת, השיטה ישימה לכל סוג של lacZ בתיוג תאים סרטניים, באופן דרמטי לשפר את יכולת הגילוי של גרורות ריאות עד לרמה של micrometastases הרדום תא בודד ומאפשר כימות קלה ואמינה של מאקרו וmicrometastases. מגבלה של שיטה זו ואת כל טכניקות האחרות המבוססות על גנים מדווחים, כוללים חלבוני וציפראז וניאון, היא היציבות של ביטוי transgene. כפי שמוצג באיור 2, שלא כל התאים הסרטניים בתוך macrometastatic המוקדים מוכתמים כחול, המעיד על חוסר הפעילות בטא גלקטוזידאז. זה יכול להיות קשור לנימק, אבל זה סביר יותר עקב אובדן ביטוי transgene. הבחנו כי דאן וLM8 התאים יעילים מאוד במורד הוויסות של lacZ ומושתל אחרים גם בבחירה מתמדת לביטוי. לכן החלפנו במחקרים שנעשה לאחרונה לK12 העכבריוK7M2 והוז, 143B האדם וSaOS-2 קווים סלולריים, סרטן העצמות שנשמרה כל ביטוי lacZ יציב במבחנה, כמו גם in vivo עד 100% לאורך זמן.

ברגע lacZ ביטוי יציב מובטח, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת במחקרים בתאים סרטניים מניפולציות גנטיות, למשל מכניסטי לחקור את התהליך של קולוניזציה הרקמה ^13, כמו גם לפיתוח והבדיקה של טיפולים החדשים שמטרתה מיגור הגרורות ^{15 , 16.} יתר על כן, הוא יכול לשמש כאמת מידה לשיפור טכניקות נוכחיות רדיולוגיות הדמיה, כגון PET, (מייקרו) CT ו-MRI, המשמשות לגילוי מוקדם של גרורות. במחקר PET האחרון (לא פורסם) עם קליעים נותבים שונים שאומתו בריאה זוהתה vivo גרורות vivo מכן לשעבר עם הפרוטוקול המתואר. במחקר מתמשך עם חיה קטנה חדשה מייקרו-CT (SkyScan) אנחנו כל כך הרבה able לזהות גרורות בריאות בvivo עד גודל של 0.5 מ"מ וvivo לשעבר עד 0.3 מ"מ, אך אנו שואפים ברזולוציה של 0.1 מ"מ. מעניין, זה הוא מגבלת הגודל שאנו קובעים להבחין המאקרו מmicrometastases עם השיטה המשולבת של זלוף באתר ומכתים X-גל. זה מדגיש שוב את הרגישות והתועלת של טכניקה קלה וחסכונית זו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
Narketan10 (קטמין)	Vétoquinol AG		100 מ"ג / מיליליטר פתרון
Xylazin (xylazine)	Streuli פארמה AG		20 מ"ג / מיליליטר פתרון
Prequilan (acepromazine)	Fatro SpA		10 מ"ג / מיליליטר פתרון
בולדוג סוג Serrefine מהדק כלי דם	כלי מדע פיין	18051-35	, 35 מ"מ מעוגל
כוס פלסטיק עם מכסה	Semadeni	2988	25 מיליליטר כוסות עם מכסים
5-Bromo-4-כלורו-3-β-indolyl-D-galactoside (X-גל); אבקה	Axxora	ALX-582-002-G005	מתמוסס בN, N-Di-methylformamide עד 40 מ"ג / מ"ל, חנות אור המוגן ב -20 ° C
פתרון בסיסי מכתים, מתאזן ל-pH 7.1, מאוחסן אור המוגן ב 4 ° C למקסימום. 1 חודש	מתוצרת עצמית		100 10xPBS מ"ל / ליטר, 1.64 גר '/ ל' K3Fe (CN) 6, 2.1 גר '/ ל' K4Fe (CN) 6, 2 מ"ל / ליטר MgCl2 1M, 2 10% מ"ל / L NP40, 1 מ"ל / L 10% נתרן Deoxycholate
בינוני הטבעת PolyFreeze	Polysciences; מפיץ שויצרי: רונשוויג	19636-1
הטבעה של עובש	Polysciences	18646A-1
יקה CM1850 cryostat	Microsystems היקה
שקופיות SuperFrost	מנזל	J1800AMNZ
פתרון אלומיניום סולפט - גרעיני-Fast אדום	חטיבת Chroma Waldeck GmbH & Co KG distributor: Medite	84-0241-00
Immu-הר	Thermo Electron, מפיץ שויצרי: Histocom	9990412