Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusion des Lungengewebes und X-Gal Färbung von<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tumor Cells

Zusammenfassung

Das erfindungsgemäße Protokoll in der vorliegenden Studie berichtet ermöglicht selektiven Nachweis von Lungenmetastasen in einzelne Zelle Auflösung in Mäusen durch kombinierte In-situ Lungenperfusion und Fixierung und X-Gal-Färbung von LacZ-Tag.

Zusammenfassung

Metastasierung ist die häufigste Todesursache in den meisten Krebsarten und daher ein Schwerpunkt in der Krebsforschung. Allerdings bleiben die Detektion von Mikrometastasen durch radiologische Bildgebung und dem Erfolg in ihrer therapeutischen Tilgung begrenzt.

Während Tiermodellen erwiesen haben unschätzbare Werkzeuge für die Krebsforschung ¹ sein, bleibt die Überwachung / Visualisierung von Mikrometastasen eine Herausforderung und ungenaue Auswertung der Metastasierung in präklinischen Studien möglicherweise zu enttäuschenden Ergebnissen in klinischen Studien ^2. Folglich besteht ein großes Interesse bei der Verfeinerung der Methoden, um endlich zu reproduzierbaren und zuverlässigen Nachweis von Metastasen bis in die einzelne Zelle Ebene in normalem Gewebe. Das Hauptaugenmerk liegt daher auf Techniken, die den Nachweis von Tumorzellen in vivo zu ermöglichen, wie Mikro-Computer-Tomographie (Mikro-CT), Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Biolumineszenz oder Fluoreszenzabbildung <sup> 3,4. Wir derzeit Optimierung dieser Techniken zur in vivo Überwachung des primären Tumorwachstum und Metastasierung in verschiedenen Modellen Osteosarkom. Einige dieser Techniken können auch für die ex vivo-Analyse von Metastasen neben klassischen Methoden wie qPCR ^{5, 6} oder FACS verschiedenen histologischen Färbung verwendet werden. Als Maßstab haben wir in der vorliegenden Studie stellte die stabile Transfektion oder Transduktion der Tumorzellen mit dem lacZ Gen, das das bakterielle Enzym β-Galactosidase, die das chromogene Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D metabolisiert -galactopyranosid (X-Gal) an einen unlöslichen Farbstoff Indigoblau ⁷ und ermöglicht hochempfindlichen und selektiven histochemische Färbung der Tumorzellen in der Maus Gewebe ex vivo auf der einzigen Zelle Ebene wie hier dargestellt. Dies ist ein Low-Cost-und nicht Geräte-intensive Werkzeug, das eine präzise Validierung von Metastasen ⁸ in Studien, in denen neue ein ermöglichtticancer Therapien ^9-11. Ein limitierender Faktor X-gal-Färbung ist die geringe Unterschied zu blutsverwandten rote Färbung von gut vaskularisierten Geweben wie zB. Im Lungengewebe kann dieses Problem durch in-situ Lungenperfusion, eine Technik, die vor kurzem von Borsig et al. ^12, der die Lungen von Mäusen unter Narkose perfundiert, um sie aus dem Blut zu löschen und zu fixieren und diese in-situ unter etabliert gelöst werden Inflation durch die Luftröhre. Diese Methode verhindert auch den Zusammenbruch der Lunge und hält dadurch die Morphologie der funktionellen Lungenalveolen, die die Qualität des Gewebes für die histologische Analyse verbessert. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein neues Protokoll, das ausnutzt einer Kombination von X-gal-Färbung von lacZ-exprimierenden Tumorzellen und in-situ-Perfusion und Fixierung von Lungengewebe. Dieses elegante Protokoll ermöglicht hochempfindliche Nachweis von einzelnen metastatischen Zellen in der Lunge und es uns ermöglicht, in einer aktuellen Studie zu derwähle "ruhend" Lunge Mikrometastasen in einem Maus-Modell ^13, die ursprünglich beschrieben wurde als nicht-metastasiertem ^14.

Protokoll

1. In-situ Lung Perfusion und Fixation

1. Anästhesieren Mäusen durch ip Injektion von ~ 150 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 112,5 mg / kg (Körpergewicht) Ketamin, 16,5 mg / kg Xylazin und 15 mg / kg Acepromazin (oder durch eine andere geeignete Anästhesie enthält Schmerzmittel).
2. Wenn Reflexe der Maus nicht mehr beobachtet werden, fixieren sie auf dem OP-Tisch zurück-down-und benetzen das Fell mit 70% Ethanol zu slick den Haaren nach unten.
3. Öffnen Sie die Haut vom Bauch bis zum Hals und ziehen Sie sie an den Seiten oder entfernen.
4. Öffnen Sie das Bauchfell und den Brustkorb auf eine reichliche Größe. Verhindern von großen Brüchen Gefäße (zB die Vena jugularis) in reduzierter Effizienz der nachfolgende Perfusion vermeiden.
5. Schneiden Sie die Vena cava caudalis unter der Leber.
6. Verwenden eines 20-ml-Spritze mit einer 21G ausgestattet - 24G Nadel langsam 10-15 ml PBS in den rechten Ventrikel des schlagenden Herzens zu injizieren, bis die Lungen vollständig weiß unddas Herz aufhört zu schlagen (Asystolie).
7. Abkneifen die Blutgefäße der Leber und der Membran mit einer Gefäßklemme.
8. Eine 10 ml Spritze mit einer 21G ausgestattet - 24G Nadel auf ~ 2 ml 3% Paraformaldehyd (PFA) in PBS in den rechten Ventrikel zu injizieren.
9. Entdecken Sie die Luftröhre außerhalb des Thorax. Verwenden das gleiche Spritze auf ~ 3 ml 3% PFA in PBS kraniale (außerhalb des Thorax) injizieren in die Trachea bis zur Lunge aufgeblasen wird. Unmittelbar nach dem Entfernen der Nadel, abkneifen die Luftröhre kaudalen der Punktion mit einer Gefäßklemme und für 10 min, um die Fixierung zu ermöglichen.
10. Durchschneiden die Blutgefäße oberhalb der Gefäßklemme, entfernen die Klemme und injizieren ~ 2 ml PBS in die rechte Herzkammer, um überschüssiges PFA entfernen.
11. Punktieren der unteren Teile aller Lungenlappen mit einer Nadel, entfernen die Gefäßklemme an der Trachea und injizieren 3-5 ml einer Lösung von PolyFreeze Einbettungsmedium / PBS 1:1 in der Luftröhre kaudalen des ersten Punktion bis PFA in der LungeLappen durch die Lösung ersetzt.
12. Entfernen Sie die Lunge sorgfältig, indem das Herz mit einer Pinzette und durch Durchschneiden des Bindegewebes Bändern, Blutgefäßen und der Luftröhre. Halten Sie das Herz an der Lunge.
13. Je nachdem, wie mit dem Lungengewebe Analyse gehen mit den Protokollen in den Abschnitten 2 und 3 beschrieben fortsetzen. Wenn Sie beide Analysen durchführen möchten, entfernen Sie ein Lungenlappen und wie unter 3 beschrieben. Verarbeiten Sie die verbleibenden Lappen mit dem Herzen wie unter Punkt 2 beschrieben.

2. Visualisierung von lacZ-markierten metastatischen Tumorzellen in Entire Lungenlappen

1. Legen Sie die Lunge in einen Plastikbecher mit engen schließenden Deckel aufsetzen und mit 2% Formaldehyd in PBS bei Raumtemperatur für 30-60 min.
2. Entfernen Fixierungslösung und gründlich 3-mal mit PBS.
3. Hinzufügen mindestens 10 ml frisch hergestellte 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal) Färbelösung (X-Gal Stammlösung [40 mg / ml inDimethylformamid] 1:40 verdünnt in Basic Färbelösung; pH 7,1 (Tabelle 1); vor Licht schützen).
4. Legen Sie ein Stück Gaze auf der Oberseite des Swimming Lungen, um es vollständig zu halten in der Lösung und setzen Sie den Deckel nur lose auf dem Topf, den Austausch von Luft zu ermöglichen.
5. Inkubation bei 37 ° C für 3-5 Stunden vor Licht geschützt.
6. Entfernen X-Gal-Lösung, einmal mit PBS spülen, um restliches X-Gal-Lösung (optional) entfernen und 4% PFA.

3. Visualisierung von lacZ-markierten metastatischen Tumorzellen in Lung Kryoschnitte

1. Vorfüll ein markiertes Einbettform bis 1/3 mit unverdünntem PolyFreeze Einbettungsmedium. Legen Sie die Lungenlappen oben und füllen sich mit Einbettmedium bis der Lappen vollständig bedeckt ist. Versuchen Sie, um Blasen zu verhindern.
2. Inkubieren der eingebetteten Lungen bei 4 ° C für 20 min.
3. Dann frieren die eingebettete Lunge langsam in einer Mischung aus Trockeneis und Isopentan und bei -80 ° C.
4. Cut 7-10 um KryoAbschnitte auf einem Kryostaten und montieren sie auf SuperFrostPlus Objektträger.
5. Inkubiere die Abschnitte sofort mit X-Gal-Färbung Lösung bei 37 ° C für 24 Stunden in einer befeuchteten Kammer.
6. Spülen Sie die Objektträger in PBS 2 mal für 5 min und dann kurz in destilliertem Wasser.
7. Counter-Fleck mit Kernechtrot für 10-30 sec gründlich in destilliertem Wasser und montieren Sie die Folien mit Immu-Mount.

4. Repräsentative Ergebnisse

Asai et al. Im ursprünglichen Artikel auf der Dunn-OS abgeleiteten LM8 Mausmodell dass sc Primärtumoren von den parentalen Dunn Zellen abgeleitet, die sich von denen aus der hoch metastatischen LM8 Sub-Zelllinie abgeleitet sind, nicht spontan bilden nachweisbare Lungenmetastasen in gemeldet syngenen C3H Mäusen ^14. Mit den hier berichteten Techniken, untersuchten wir die Bildung von Metastasen in den Dunn/LM8 Maus OS-Modelle. Wir nutzten stabile lacZ-transduzierten Dunn und LM8 Zelles und eines Protokolls für in-situ Lungenperfusion und Fixierung in Mäusen. Repräsentative Bilder perfundierten und nicht-perfundierten Lungen von Mäusen subkutan injiziert mit lacZ-transduzierten und nicht-transduzierten Steuerung Dunn und LM8 Zellen in Abbildung 1 gezeigt. In Mäusen, die mit Zellen injiziert Steuerung Dunn blieb makroskopischen und mikroskopischen Metastasen in nicht nachweisbar nicht perfundierten und perfundierten Lunge (1A, i-iv). Aber interessanterweise in Mäusen mit Dunn-lacZ-Zellen injiziert, offenbarte X-gal-Färbung blauen mikrometastatischen Foci von Einzelzellen oder kleinen Zellaggregaten (<0,1 mm) auf der Oberfläche des nicht-perfundierten Lunge (Abbildung 1A, vi). Im situ Perfusion und Fixierung der Lunge weiter verbessert die Erkennbarkeit von Dunn-lacZ Mikrometastasen (1A, viii). Jedoch wurde Auswuchs auf makroskopische Foci nicht beobachtet (Abbildung 1A, V, VII).

Bei Mäusen mit Steuerung LM8 Zellen, transluzent, kaum nachweisbar macrometastatic Foci injiziert größer als 0,1 mm Durchmesser wurden im nicht-perfundierten Lunge (1B, i) erfasst. Perfusion der Lunge (1B, iii) nicht verbessert die Erkennung der Brennpunkte. Jedoch in Mäusen mit LM8-lacZ-Zellen injiziert mehrere X-Gal blau gefärbt makro-(1B, v) und Mikrometastasen (1B, vi) wurden auf der Oberfläche von nicht-perfundierten Organen detektiert. Darüber hinaus Perfusion der Lunge weiter verbessert die Erkennbarkeit von Makro-und Mikrometastasen (Abbildung 1B, VII - VIII). Folglich wurde der Mikro-und sichtbaren Makrometastasen bei einer höheren Dichte und einer größeren Anzahl, hauptsächlich aufgrund der Durchsichtigkeit des perfundierten Gewebe, in dem Brennpunkte unterhalb der Organoberfläche wurde ebenfalls sichtbar.

Ein zusätzlicher histological Analyse mit Gefrierschnitten des Lungengewebes bestätigt die verbesserte Nachweisbarkeit von Lungenmetastasen bei Mäusen mit lacZ-transduzierten Dunn und LM8 Zellen injiziert. Bei Mäusen mit Primärtumoren von Dunn-lacZ oder lacZ LM8-Zellen abgeleitet wurden im Gegensatz zu Mäusen, die mit primären Tumoren der jeweiligen Kontrollzellen, Mikrometastasen oder sogar einzelne Zellfoci in Lungenschnitten (Abbildung 2) erfasst. Darüber hinaus waren auch Makrometastasen deutlicher sichtbar in Mäusen mit LM8-lacZ-Zellen als bei Tieren mit der Steuerung LM8 Zellen (2C, D) injiziert.

Abbildung 1. Nachweis von spontanen Metastasen von nicht-transduzierten (i-iv) und lacZ-transduzierten (v-viii) Dunn (A) und LM8 (B) Zellen im nicht-perfundierten (i, ii, v, vi) und perfundierten (iii, iv, vii, viii) Lungen in C3H-Mäusen. Metastasen in repräsentativen X-Gal-stained ganzen Lunge (v, vii in A und B) und die entsprechenden Nahaufnahmen (vi, viii in A und B) blau erscheinen. Macrometastatic Brennpunkte (> 0,1 mm) in den Organen von Mäusen mit nicht-markierten Zellen LM8 (i-iv in B) eingespritzt sind durch Sternchen gekennzeichnet. Bereiche, in Nahaufnahmen sind repräsentativ für die gesamte Lunge. Maßstab Balken zeigen 1 mm in Bildern ganzer Lunge und 0,1 mm in Nahaufnahmen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 2. Erkennung von Dunn und LM8 Mikrometastasen in der Lunge Kryoschnitten. Abschnitte von OCT eingebettet Lungengewebe wurden in X-Gal-Färbung Lösung bei 37 ° C für 24 Stunden in einer befeuchteten Kammer inkubiert und dann gegengefärbt mit Kernechtrot. Pfeile zeigen auf mikrometastatischen Foci in Lungenschnitten von Mäusen mit Dunn-lacZ (B) oder LM8-lacZ-Zellen (D) eingespritzt erfasst. Micrometastases blieb nicht nachweisbar in Lungenschnitten von Mäusen mit nicht-transduzierten Dunn (A) oder LM8 Zellen (C) injiziert. Maßstab Balken zeigen 0,1 mm.

Diskussion

Die hier vorgestellten Ergebnisse im Dunn/LM8 Maus OS Modells demonstrieren die Macht des neu gegründeten Methode, die die X-Gal-Färbung von lacZ-markierten Tumorzellen mit in-situ Perfusion / Fixierung von Lungengewebe kombiniert. Diese Kombination der beiden Techniken ermöglicht eine hohe Empfindlichkeit Nachweis von Mikrometastasen Läsionen bis zum einzelnen Zellebene und verbessert auch die Visualisierung von Makrometastasen auf der Lungenoberfläche (Abbildung 1) als auch in der Lunge Abschnitten (Abbildung 2). Während die X-Gal-Färbung ermöglicht auch die Detektion von (Mikro-) Metastasen in anderen Organen, in-situ-Perfusion / Fixierung verbessert die Erkennbarkeit der metastatischen Foci in anderen Geweben als der Lunge nur leicht aufgrund der natürlichen Blut-und Gewebe-bezogene Farbe ¹³ dieser Organe. Selbst wenn die Perfusion einem anderen Organ gerichtet ist, zB der Leber, wären Entfernung des Blutes nur teilweise Verbesserung des Kontrasts Wetteschen X-Gal-Färbung und die natürliche Farbe des Organs. Jedoch ist das Verfahren anwendbar auf jede Art von lacZ-markierten Tumorzellen ist, wird die Gewinnung und Nachweisbarkeit von Lungenmetastasen bis auf die Ebene der ruhenden einzelligen Mikrometastasen und ermöglicht eine einfache und zuverlässige Quantifizierung von Makro-und Mikrometastasen. Eine Einschränkung dieses Verfahrens und alle anderen Techniken, die auf Reportergenen, einschließlich Luciferase und fluoreszierende Proteine, bezogen sind, ist die Stabilität der Transgen-Expression. Wie in 2d gezeigt ist, werden nicht alle Tumorzellen innerhalb der Herde macrometastatic blau gefärbt, was auf ein Fehlen von beta-Galactosidase-Aktivität. Das könnte im Zusammenhang mit Nekrose, aber es ist wahrscheinlicher, auf einen Verlust der Transgenexpression. Wir beobachteten, dass die Dunn und LM8 Zellen sehr wirksam bei der Herabregulierung von lacZ und andere Transgene auch unter kontinuierlicher Selektion auf Expression sind. Deshalb schaltet in neueren Studien der murinen K12und K7M2 und die menschlichen HOS, 143B und Saos-2 Osteosarcom-Zelllinien, die alle stabil lacZ-Expression in vitro als auch in vivo bis zu 100% der Zeit beibehalten wird.

Sobald stabile lacZ-Expression garantiert wird, kann diese Technik in Studien mit genmanipulierte Tumorzellen, zB um mechanistisch untersuchen den Prozess des Gewebes Kolonisierung ¹³ sowie für die Entwicklung und Erprobung neuer Therapien dem Ziel Tilgung der metastatischen Läsionen ¹⁵ angelegt werden ^{, 16.} Weiterhin kann als Richtwert für die Verbesserung des aktuellen radiologischen Bildgebung, wie PET, (Mikro-) CT-und MRI, für die frühe Erkennung des metastatischen Läsionen verwendet dienen. In einer kürzlich durchgeführten Studie PET (unveröffentlicht) mit unterschiedlichen Tracer wir überprüft die in vivo nachgewiesen Lungenmetastasen anschließend ex vivo mit dem beschriebenen Protokoll. In einer laufenden Studie mit einem neuen Kleintier Mikro-CT (SkyScan) sind wir so weit able, um Lungenmetastasen in vivo nachzuweisen bis zu einer Größe von 0,5 mm und ex vivo bis zu 0,3 mm, aber wir wollen mit einer Auflösung von 0,1 mm. Interessanterweise ist dies die maximale Größe, die wir zu unterscheiden Makro-von Mikrometastasen mit dem kombinierten Verfahren der in-situ Perfusion und X-Gal-Färbung eingestellt. Dies unterstreicht erneut die Empfindlichkeit und die Nützlichkeit dieses einfache und kostengünstige Technik.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Narketan10 (Ketamin)	Vétoquinol AG		100 mg / ml Lösung
Xylazin (Xylazin)	Streuli Pharma AG		20 mg / ml Lösung
Prequilan (Acepromazin)	Fatro SpA		10 mg / ml Lösung
Bulldog Typ Serrefine Gefäßklemme	Fine Science Tools	18051-35	gekrümmten, 35 mm
Plastikbecher mit Deckel	Semadeni	2988	25 ml Becher mit Deckel
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal); Pulver	Axxora	ALX-582-002-G005	lösen sich in N, N-Di-Methylformamid bis 40 mg / ml, Lagerung Licht geschützt bei -20 ° C
Grundlegende Färbelösung, äquilibriert auf pH 7,1, gelagert Licht geschützt bei 4 ° C für max. 1 Monat	selbst gemacht		100 ml / L 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 ml / L 1M MgCl2, 2 ml / L 10% NP40, 1 ml / L 10% Natrium-Desoxycholat
PolyFreeze Embedding Medium	Polysciences; Schweizer Vertrieb: Brunschwig	19636-1
Einbettform	Polysciences	18646A-1
Leica CM1850 Kryostat	Leica Microsystems
SuperFrost Dias	Menzel	J1800AMNZ
Nuclear-Fast Red - Aluminium-Sulfat-Lösung	Abteilung Chroma Waldeck GmbH & Co KG distributor: Medite	84-0241-00
Immu-Mount	Thermo Electron, Schweizer Vertrieb: HistoCom	9990412