Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme<em&gt; In-situ</emAkciğer Doku ve X-Gal Boyanma&gt; Perfüzyon<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tümör Hücreleri

Özet

Bu çalışmada bildirilen yeni protokol kombine farelerde tek hücreli çözünürlükte metastaz seçici algılama sağlar In-situ Akciğer perfüzyon ve fiksasyon ve X-Gal boyama LacZ etiketli.

Özet

Metastaz kanser türlerinin çoğunda başlıca ölüm nedeni ve kanser araştırma, dolayısıyla bir ana odak noktasıdır. Ancak, radyolojik görüntüleme ve tedavi eradikasyon başarısı ile mikrometastaz tespit sınırlı kalır.

Hayvan modellerinde kanser araştırma ¹ için çok değerli araçlar olduğu kanıtlanmış olsa da, izleme / mikrometastazlar görselleştirme preklinik çalışmalarda bir meydan okuma ve metastatik yayılım eksik değerlendirilmesi potansiyel klinik çalışmalarda ² hayal kırıklığı yaratan sonuçlar yol açar kalır. Sonuç olarak, nihayet normal dokuda tek hücre düzeyinde metastaz tekrarlanabilir ve güvenilir algılama sağlamak için metodlarla rafine büyük ilgi var. Ana odak nedenle mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT), pozitron emisyon tomografisi (PET), biyolüminesans veya floresan görüntüleme gibi in vivo tümör hücrelerinin algılanmasına izin teknikleri üzerinde <> 3,4 sup. Biz şu anda farklı osteosarkom modelleri primer tümör büyümesi ve metastaz vivo izlenmesi için bu teknikleri optimize edilmiştir. Bu tekniklerin bazıları qPCR ^{5, 6} ya da FACS histolojik boyama farklı türleri gibi klasik yöntemlerin yanında metastaz ex vivo analiz için de kullanılabilir. Bir kriter olarak, kararlı transfeksiyon veya lacZ geni ile tümör hücrelerinin transdüksiyonu bakteriyel bir enzim kromojenik substrat 5-bromo-4-kloro-3-indolil-beta-D metabolize β-galaktosidaz kodlayan bu çalışmada kurduk çözülmeyen bir indigo mavisi ⁷ ve burada gösterildiği gibi tek hücre düzeyinde fare doku ex vivo olarak tümör hücrelerinin son derece hassas ve seçici histokimyasal mavisi boyama aşağı izin verir-galactopyranoside (X-Gal). Bu çalışmalarda metastaz ⁸ hassas doğrulama bir yeni değerlendirmede olanak sağlayan düşük maliyetli ve ekipman yoğun değil araçtırticancer tedaviler ^9-11. X-gal boyası bir sınırlayıcı faktör de vaskülarize dokuların kan ile ilgili kırmızı boyama, örneğin düşük kontrast olduğunu. Akciğer dokusunda bu sorunu yerinde akciğer perfüzyon, son zamanlarda Borsig ark. ^12. Kan bunları temizlemek için ve altında in-situ bunları düzeltmek ve gömmek için anestezi altında farelerin akciğerlerinde perfüze tarafından kurulmuş bir teknik ile çözülebilir trakea yoluyla enflasyon. Bu yöntem aynı zamanda akciğer çökmesi önler ve böylece histolojik analiz için doku kalitesini geliştirmektedir fonksiyonel akciğer alveol, morfolojisini muhafaza eder. Bu çalışmada, biz lacZ eksprese tümör hücrelerinin X-gal boyası bir arada yararlanır ve in-situ perfüzyon ve akciğer doku fiksasyonu., Yeni bir protokol, tarif Bu rafine protokol akciğerde tek metastatik hücrelerinin yüksek hassasiyet algılama sağlar ve d yeni bir çalışmada bize etkinBaşlangıçta ¹⁴ sigara metastatik olduğu açıklanan bir fare modeli ¹³ yılında "atıl" akciğer mikrometastazlar etect.

Protokol

1. In-situ Akciğer Perfüzyon ve Fiksasyon

1. ~ 150 ul fosfat IP enjeksiyonu ile farelerin anestetize salin (PBS) ile 112.5 mg / kg (vücut ağırlığı) ketamin, 16.5 mg / kg ksilazin, ve 15 mg / kg 'ye asepromazin (veya uygun bir ağrı kesici içeren başka bir anestezi ile). Içeren tamponlu
2. Fare refleksleri artık gözlenen olduğunda, geri aşağı ameliyat masasında düzeltmek ve aşağı kaygan kıllar% 70 Etanol ile kürk ıslak.
3. Boynuna karın cilt kadar açın ve yanlara çekin veya kaldırın.
4. Geniş bir boyuta periton ve toraks açın. Sonraki perfüzyon azalmış etkinlik kaçınmak için büyük gemilerin rüptürü (örn. vena jugularis) önleyin.
5. Karaciğer altında vena kava caudalis kesin.
6. Akciğer tamamen beyaz ve kadar dayak kalbin sağ ventrikül içine yavaşça 10-15 ml PBS enjekte 24G iğne - 21G ile donatılmış 20 ml şırınga kullanınkalp (asistoli) yenerek durur.
7. Vasküler klemp ile karaciğer ve diyafram yukarısında kan damarlarından sıkıştırın.
8. Sağ ventrikül içine PBS içinde% 3 paraformaldehid ~ 2 ml (PFA) enjekte 24G iğne - 21G ile donatılmış 10 ml şırınga kullanın.
9. Toraks dışında trakea ortaya çıkarın. Akciğer şişirilmiş kadar trakea içine PBS kranyal (toraks dışında) 3% PFA ~ 3 ml enjekte aynı şırınga kullanın. Hemen iğne çıkarıldıktan sonra, vasküler klemp ile ponksiyon trakea kaudal çimdiklemek ve fiksasyonu sağlamak için 10 dakika bekleyin.
10. Vasküler klemp üzerinde kan damarları transeksiyonu, kelepçe kaldırmak ve aşırı PFA kaldırmak için sağ ventriküle ~ 2 ml PBS enjekte.
11. Delinme bir iğne ile tüm akciğer lobu alt kısımları, trakea vasküler klemp kaldırmak ve de PFA kadar ilk ponksiyon trakea kaudal içine orta / PBS 01:01 gömme PolyFreeze bir çözüm 3-5 ml enjekte akciğerloblar çözümü ile değiştirilir.
12. Bir forseps ile kalp çekerek ve bağ dokusu bağ, kan damarları ve trakea transecting tarafından dikkatle akciğer çıkarın. Akciğere bağlı kalp tutun.
13. Akciğer doku analizi ile devam etmek nasıl bağlı bölümlerde 2 veya 3'te protokolleri ile devam edin. Her iki analiz yapmak istiyorsanız, bir akciğer lobunun kaldırmak ve 3 altında açıklandığı gibi devam edin. 2 altında tarif edildiği gibi kalp bağlı kalan loblar işlemden geçirin.

2. Tüm Akciğer lobları içinde lacZ etiketli Metastatik Tümör Hücrelerinin Görselleştirme

1. Sıkı bir kapatma kapağının ile plastik bir kap içinde akciğer yerleştirin ve 30-60 dakika için oda sıcaklığında PBS içinde% 2 formaldehit ile sabitleyin.
2. Fiksasyon çözüm çıkarın ve PBS ile iyice 3 kez yıkayın.
3. Taze 5-Bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktozid (X-Gal) boyama çözeltisi (X-Gal stok çözeltisi [40 mg / ml 'de hazırlanmış en az 10 mLDimetilformamid] 01:40 Temel Boyama Çözüm seyreltilerek, pH 7.1 (Tablo 1); ışıktan korumak).
4. Çözelti içinde tamamen tutmak ve hava değişimini sağlamak için kap üzerinde sadece gevşek kapak yerleştirmek için yüzme akciğer üstünde bir gazlı bezi koyun.
5. Işıktan korunmuş 3-5 saat süreyle 37 ° C'de inkübe edin.
6. X-Gal çözüm çıkarın, rezidüel X-Gal çözümü (isteğe bağlı) çıkarın ve% 4 PFA eklemek için bir kez PBS ile yıkayın.

3. Akciğer Cryosections yılında lacZ etiketli Metastatik Tümör Hücrelerinin Görselleştirme

1. Seyreltilmemiş PolyFreeze gömme orta 1/3 önceden doldur etiketli gömme kalıp. Üst lobun koyun ve lob tamamen kaplıdır kadar orta gömme ile doldurmak. Kabarcıkları önlemek için deneyin.
2. 20 dk için 4 ° C sıcaklıkta gömülü akciğer inkübe edin.
3. Daha sonra -80 ° C de yavaş yavaş kuru buz ve izopentan ve depo karışımı içinde gömülü akciğer donma
4. 7-10 mikron kriyo CutKriyostaz bölümleri ve SuperFrostPlus mikroskop slaytlar takar.
5. Nemlendirilmiş bir oda içinde 24 saat için 37 ° C de X-Gal boyama solüsyonu ile hemen bölümleri inkübe edin.
6. Distile su içinde kısa bir süre sonra 5 dk PBS 2 kez slaytları durulayın.
7. , 10-30 sn nükleer hızlı kırmızı ile Counter-leke distile su ile durulayın ve İmmünoreaktif-Dağı ile slaytlar monte.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Asai ark. Yüksek metastatik LM8 alt hücre hattı elde edilenler farklı ebeveyn Dunn hücrelerinden türetildiği sc primer tümörleri, kendiliğinden saptanabilir akciğer metastazları kurmazlar ki Dunn-türetilmiş LM8 OS fare modeli üzerinde özgün makale bildirilmiştir singenik C3H farelerin ^14. Burada bildirilen teknikleri ile, Dunn/LM8 fare OS modellerinde metastaz oluşumu yeniden incelenmiştir. Biz istikrarlı lacZ-transduced Dunn ve LM8 hücre yararlandıs ve farelerde in-situ akciğer perfüzyon ve fiksasyon için bir protokol. Deri altından enjekte edilmiş farelerin perfüze ve non-perfüze akciğer Örnek görüntüleri lacZ-transdük ve kontrol Dunn ve LM8 hücre Şekil 1 'de gösterilmiştir olmayan transdük. Kontrolü Dunn hücreleri enjekte farelerde, makroskopik ve mikroskopik metastaz olmayan perfüze ve perfüze akciğer (Şekil 1A, i-iv) algılanamayan kalmıştır. Ancak ilginç bir şekilde, Dunn-lacZ hücreleri ile enjekte edilen farelerde, X-gal boyaması olmayan akciğer perfüze (Şekil 1A, vi) yüzeyi üzerinde tek bir hücre ya da hücre kümeleri küçük (<0.1 mm) mavi mikrometastazların odak görüldü. Içinde, Akciğerlerin situ perfüzyon ve fiksasyon daha Dunn-lacZ mikrometastaz (Şekil 1A, viii) ve görülebilirliği artırıldı. Ancak, makroskopik odakları için akıbet (Şekil 1A, v, vii) gözlenmemiştir.

Saydam kumanda LM8 hücreleri, zor tespit macrometastatic odakları ile enjekte farelerde çapı 0.1 mm'den büyük olmayan perfüze akciğer (Şekil 1B, i) kabul edildi. Akciğer Perfüzyon (Şekil 1B, iii) odaklarının tespiti düzelmedi. Bununla birlikte, farelerde çoklu LM8-lacZ hücreleri ile enjekte X-Gal mavi lekeli makro-(Şekil 1B, D) ve mikrometastazların (Şekil 1B, vi) non-perfüze organ yüzeyine tespit edilmiştir. Ayrıca, akciğer perfüzyon daha tanımlanabilirliğini makro ve mikro metastaz (- viii Şekil 1B, vii) düzeldi. Sonuç olarak, mikro-macrometastases ve esas olarak, organ yüzeyin altında odaklar görünür hale geldiği perfüze doku geçirgenliği için, daha yüksek yoğunluk ve daha büyük bir sayıda görünür hale gelmiştir.

İlave bir saatAkciğer dokusunda cryosections kullanarak istological analizi lacZ-transduced Dunn ve LM8 hücreler enjekte edilmiş farelere akciğer metastazı gelişmiş tanımlanabilirliğini doğruladı. Dunn-lacZ veya LM8-lacZ hücrelerinden türetildiği primer tümörlü farelerde, ilgili kontrol hücreleri, mikrometastaz hatta tek hücre odakları primer tümörleri olan farelerin aksine akciğer bölümler (Şekil 2) kabul edildi. Ayrıca, macrometastases da kontrol LM8 hücreleri (Şekil 2C ve D) ile enjekte edilen hayvanlarda daha LM8-lacZ hücreleri ile enjekte edilen farelerde daha açık bir şekilde görünür olmuştur.

Şekil 1., Spontan metastazlarının tespiti olmayan, transdüksiyon, (i-iv) ve lacZ-transdüksiyon ile (V-VIII) Dunn (A) ve LM8 (B) non-perfüze (I, II, V, VI) ile perfüze hücreleri C3H farelerde (iii, iv, vii, viii) akciğerler. Temsili X-Gal-sta Metastazlariined bütün akciğerler (v, A ve B vii) ve ilgili yakın çekimler (vi, viii A ve B) mavi görünür. Etiketli olmayan LM8 hücreleri (B i-iv) ile enjekte edilen farelerin organlarında Macrometastatic odak (> 0,1 mm) yıldız işareti ile gösterilir. Yakın çekimler gösterildiği Alanları genelinde akciğerler için temsilidir. Ölçek çubukları tüm akciğer görüntüleri 1 mm ve yakın-up 0,1 mm göstermektedir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2. Dunn ve akciğer cryosections içinde LM8 mikrometastaz saptanması. Ekim gömülü akciğer doku kesitlerinde nemlendirilmiş bir oda içinde 24 saat boyunca 37 ° C'de X-gal boyaması çözelti içinde inkübe edildi ve daha sonra nükleer hızlı kırmızı ile zıt edildi. Oklar Dunn-lacZ (B) veya LM8-lacZ hücreleri (D) ile enjekte farelerin akciğer bölümlerinde tanınan mikrometastatik odakları işaret. Micrometastases olmayan transdük Dunn (A) ya da LM8 hücreleri (C) ile enjekte edilen farelerde akciğer bölümlerinde saptanamaz kalmıştır. Ölçek çubukları 0.1 mm göstermektedir.

Tartışmalar

Dunn/LM8 fare modelinde OS burada sunulan sonuçlar, in-situ perfüzyon / akciğer dokusunda tespit lacZ ile etiketlenmiş tümör hücreleri X-gal boyaması birleştiren yeni kurulan yöntem gücünü göstermektedir. İki tekniğin bu kombinasyonu tek bir hücre düzeyinde mikrometastazların lezyonların yüksek duyarlılık tespit aşağı izin verir ve aynı zamanda akciğer yüzey (Şekil 1) hem de akciğer bölümler halinde (Şekil 2) üzerindeki macrometastases bir görüntüleme artırır. X-Gal boyama da çünkü doğal kan ve doku ile ilgili renk diğer organları, in-situ perfüzyon / fiksasyonu (mikro) metastaz tespiti sadece biraz akciğer dışındaki dokularda metastatik odaklar tanımlanabilirliğini geliştirir sağlarken Bu organların ^13. Başka bir organ perfüzyon yönlendirilir bile, karaciğer, örneğin, kan kaldırılması sadece kısmen kontrast bahsi artıracakween X-Gal boyama ve organ doğal rengi. Bununla birlikte, yöntem lacZ-etiketli tümör hücrelerinin her türü için geçerli olduğu, önemli ölçüde hareketsiz tek hücreli mikrometastazların seviyesine akciğer metastazı tanımlanabilirliğini arttırmak aşağı ve makro ve mikrometastazların bir miktarı kolay ve güvenilir bir miktar sağlar olacaktır. Bu yöntem ve lusiferaz ve floresan proteinleri içeren muhabiri genleri, dayalı tüm diğer tekniklerin bir sınırlama transgen ifade istikrardır. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, macrometastatic odakları içindeki tüm tümör hücreleri beta-galaktosidaz aktivitesi eksikliği gösteren mavi lekeli. Bu nekroz ile ilgili olabilir, ama daha büyük olasılıkla transgen ekspresyonu kaybı nedeniyle. Biz Dunn ve LM8 hücreleri ifade için bile sürekli seçilim altında lacZ ve diğer transgenlerin down-regülasyonu çok etkili olduğu görülmektedir. Bu nedenle fare K12 için son yıllarda yapılan çalışmalarda açıkve K7M2 ve bütün in vitro hem de yukarı saat boyunca% 100 in vivo kararlı lacZ ekspresyonu yapılmaktadır HOS insan, 143b ve Saos-2 osteosarkoma hücre hattı.

LacZ ifade kez kararlı garantilidir, bu tekniğin mekanistik doku kolonizasyonu ¹³ gibi metastatik lezyonlar ¹⁵ eradikasyonu hedefleyen yeni tedavilerin geliştirilmesi ve test sürecini araştırmak için örneğin gen-manipüle tümör hücreleri ile çalışmalarda uygulanabilir ^{, 16.} Ayrıca, metastatik lezyonların erken tanısında kullanılan PET, (mikro) BT ve MRG gibi güncel radyolojik görüntüleme teknikleri, iyileştirilmesi için bir kriter olarak hizmet verebilir. Farklı izleyiciler ile yeni PET çalışmasında (yayımlanmamış) biz in vivo tespit akciğer açıklanan protokol ile sonradan ex vivo metastazları doğrulanmadı. Yeni bir küçük hayvan mikro-BT ile devam eden bir çalışmada (SkyScan) biz bugüne kadar ab vardırle 0,5 mm ve ex vivo aşağı 0,3 mm bir boyuta in vivo akciğer metastazları aşağı algılamak için, ama biz 0.1 mm çözünürlükte hedefliyoruz. İlginçtir, bu biz in-situ perfüzyon ve X-Gal boyama kombine yöntemi ile mikrometastaz makro-ayırt etmek ayarladığınız boyut sınırıdır. Bu da yine bu kolay ve maliyet-etkili bir tekniğin duyarlılık ve kullanışlılığı altını çiziyor.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Narketan10 (ketamin)	Vetoquinol AG		100 mg / ml solüsyon
Xylazin (xylazine)	Streuli Pharma AG		20 mg / ml çözelti
Prequilan (Acepromazine)	Fatro SpA		10 mg / ml çözelti
Bulldog Tipi vasküler klemp Serrefine	Güzel Bilim Araçları	18051-35	kavisli, 35 mm
Kapaklı plastik bardak	Semadeni	2988	Kapaklı 25 ml bardak
5-Bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktozid (X-Gal); toz	Axxora	ALX-582-002-G005	depo, N-Di-methylformamide 40 mg / ml 'ye, N-korumalı çözülür ışık -20 ° C' de
Maksimum ışık-korumalı 4 ° C'de saklanır pH 7.1 'e kadar dengelenmiş temel boyama çözeltisi,,. 1 ay	kendi kendini yetiştirmiş		100 ml / L 10xPBS, 1.64 g / L K3Fe (CN) 6, 2.1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 mL / L 1 M MgCl2, 2 ml / L, 10% NP40, 1 ml / L, 10% sodyum-deoksikolatın
PolyFreeze Katıştırma Orta	Polysciences; swiss distribütörü: Brunschwig	19636-1
Kalıp Katıştırma	Polysciences	18646A-1
Leica CM1850 kriyostat	Leica Microsystems
SuperFrost slaytlar	Menzel	J1800AMNZ
Nükleer-Hızlı Kırmızı - Alüminyum sülfat çözeltisi	Lig Chroma Waldeck GmbH & Co KG distributor: Medite	84-0241-00
İmmünoreaktif Montaj	Thermo Electron, swiss distribütörü: Histocom	9990412