Amélioration de la visualisation des métastases pulmonaires à la Résolution Single Cell chez les souris en combiné<em&gt; In situ</emPerfusion&gt; du tissu pulmonaire et coloration X-gal de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tag cellules tumorales

Résumé

Le nouveau protocole indiqué dans la présente étude permet une détection sélective des métastases pulmonaires à la résolution cellule unique chez la souris par combiné In situ et la coloration de fixation et de X-Gal LacZ-Marqué cellules tumorales.

Résumé

Les métastases sont la principale cause de décès dans la plupart des types de cancer et par conséquent un des principaux axes de recherche sur le cancer. Cependant, la détection des micrométastases par imagerie radiologique et le succès de leur éradication thérapeutiques restent limitées.

Alors que les modèles animaux se sont révélés être des outils précieux pour recherche sur le cancer ^1, le suivi / visualisation des micrométastases reste un défi et une évaluation inexacte de la dissémination métastatique dans les études précliniques conduit potentiellement à des résultats décevants dans les essais cliniques ^2. Par conséquent, il ya un grand intérêt à perfectionner les méthodes pour enfin permettre la détection reproductible et fiable des métastases jusqu'au niveau de la cellule unique dans les tissus normaux. L'objectif principal est donc sur des techniques qui permettent la détection de cellules tumorales in vivo, comme les micro-tomographie par ordinateur (micro-CT), la tomographie par émission de positons (TEP), imagerie de fluorescence ou de bioluminescence <sup> 3,4. Nous sommes actuellement à l'optimisation de ces techniques pour la surveillance in vivo de la croissance tumorale primaire et les métastases dans des modèles différents d'ostéosarcome. Certaines de ces techniques peuvent également être utilisées pour l'analyse ex vivo de métastases à côté des méthodes classiques comme qPCR ^{5, 6} ou FACS différents types de coloration histologique. Comme point de référence, nous avons établi dans la présente étude la transfection stable ou la transduction des cellules tumorales avec le gène lacZ codant pour l'enzyme bactérienne β-galactosidase qui métabolise le substrat chromogène 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-bêta-D -galactopyranoside (X-Gal) à un colorant insoluble bleu indigo ⁷ et permet très sensible et sélective coloration histochimique bleu de cellules tumorales in vivo de souris ex tissu jusqu'au niveau de la cellule unique comme indiqué ici. Il s'agit d'un outil à faible coût et non l'équipement à forte intensité, ce qui permet la validation précise des métastases ⁸ en études évaluant un nouveauthérapies ticancer ^9-11. Un facteur limitant de coloration X-gal est le faible contraste par exemple à du sang liée à une coloration rouge des tissus vascularisés ainsi. Dans le tissu pulmonaire, ce problème peut être résolu par la perfusion pulmonaire in situ, une technique qui a été récemment mis en place par Borsig et al. ¹² qui perfuse les poumons de souris sous anesthésie pour les faire disparaître du sang et de fixer et d'intégrer les in-situ sous gonflage à travers la trachée. Cette méthode empêche également l'effondrement du poumon et maintient ainsi la morphologie fonctionnelle des alvéoles pulmonaires, ce qui améliore la qualité du tissu pour analyse histologique. Dans la présente étude, nous décrivons un nouveau protocole, qui tire parti d'une combinaison de coloration X-gal de lacZ cellules tumorales exprimant et in-situ de perfusion et de la fixation du tissu pulmonaire. Ce protocole permet raffiné de haute sensibilité de détection de simples cellules métastatiques dans les poumons et nous a permis dans une étude récente à detect «dormants» micrométastases pulmonaires dans un modèle de ¹³ souris, qui a été décrit à l'origine comme non métastatique ^14.

Protocole

1. Perfusion pulmonaire in situ et de fixation

1. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de ~ 150 ul solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 112,5 mg / kg (poids corporel) kétamine, 16,5 mg / kg de xylazine et 15 mg / kg acépromazine (ou par un autre anesthésie contenant des analgésiques appropriés).
2. Lorsque les réflexes de la souris ne sont plus respectées, le fixer sur la table d'opération en arrière vers le bas et mouiller le pelage avec de l'éthanol à 70% lisses les cheveux vers le bas.
3. Ouvrir la peau de l'abdomen jusqu'au cou et tirez-le vers les côtés ou le supprimer.
4. Ouvrez le péritoine et le thorax à une taille suffisante. Prévenir les ruptures de vaisseaux de grande taille (par exemple, la veine jugulaire) afin d'éviter une perte d'efficacité de la perfusion ultérieure.
5. Couper la veine cave caudale sous le foie.
6. Utilisez une seringue de 20 ml équipé d'un 21G - 24G aiguille pour injecter le produit lentement 10-15 ml de PBS dans le ventricule droit du cœur battant jusqu'à ce que le poumon est complètement blanc etle cœur cesse de battre (asystolie).
7. Pincer les vaisseaux sanguins au-dessus du foie et le diaphragme avec une pince vasculaire.
8. Utiliser une seringue de 10 ml équipé d'un 21G - 24G aiguille pour injecter ~ 2 ml de paraformaldéhyde à 3% (PFA) dans le PBS dans le ventricule droit.
9. Découvrir la trachée à l'extérieur de la cage thoracique. Utilisez la même seringue pour injecter ~ 3 ml de PFA 3% dans du PBS crânienne (à l'extérieur du thorax) dans la trachée jusqu'à ce que le poumon est gonflé. Immédiatement après le retrait de l'aiguille, pincer la trachée caudale de la perforation avec une pince vasculaire et d'attendre 10 minutes pour permettre la fixation.
10. Transect les vaisseaux sanguins au-dessus du clamp vasculaire, enlever le collier et injecter ~ 2 ml de PBS dans le ventricule droit pour enlever l'excès PFA.
11. Percer les parties inférieures de l'ensemble des lobes de poumon avec une aiguille, retirer la pince vasculaire à la trachée et injecter 3-5 ml d'une solution d'enrobage moyen PolyFreeze / PBS 1:1 dans la trachée caudale de la première perforation jusqu'à ce que le PFA dans l' poumonlobes est remplacé par la solution.
12. Retirez soigneusement le poumon en tirant sur le cœur avec une pince et en sectionnant les ligaments du tissu conjonctif, des vaisseaux sanguins et la trachée. Gardez le coeur relié aux poumons.
13. Selon la façon de procéder à l'analyse des tissus du poumon continuent avec les protocoles décrits dans les sections 2 ou 3. Si vous voulez faire les deux analyses, enlever un lobe du poumon et procédez comme décrit au point 3. Traiter les lobes restants liés au cœur, comme décrit au point 2.

2. Visualisation de lacZ-taggés cellules tumorales métastatiques dans les lobes pulmonaires entières

1. Placer le poumon dans un gobelet en plastique avec couvercle à fermeture étanche et le fixer avec du formaldéhyde à 2% dans du PBS à température ambiante pendant 30-60 min.
2. Retirer la solution de fixation et de bien se laver 3 fois avec du PBS.
3. Ajouter au moins 10 ml fraîchement préparée 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal) solution de coloration (solution mère de X-Gal [40 mg / ml dansDiméthylformamide] 1:40 diluée dans une solution de coloration de base, pH 7,1 (tableau 1); abri de la lumière).
4. Placer un morceau de gaze sur le dessus du poumon natation de le garder complètement dans la solution et placez le couvercle que faiblement sur le pot pour permettre un échange d'air.
5. Incuber à 37 ° C pendant 3-5 h abri de la lumière.
6. Retirer X-Gal solution, rincer une fois avec du PBS pour éliminer les résidus X-Gal solution (en option) et ajouter 4% de PFA.

3. Visualisation de lacZ-taggés cellules tumorales métastatiques pulmonaires dans cryosections

1. Prefill un moule d'enrobage étiqueté à 1/3 avec support intégration PolyFreeze non dilué. Mettre le lobe pulmonaire sur le dessus et remplir avec incorporation moyen jusqu'à ce que le lobe est entièrement recouvert. Essayez d'éviter les bulles.
2. Incuber les poumons incorporés à 4 ° C pendant 20 min.
3. Puis geler les poumons embarqués lentement dans un mélange de glace sèche et l'isopentane et conserver à -80 ° C.
4. Couper um 10.07 cryosections sur un cryostat et les monter sur des lames de microscope SuperFrostPlus.
5. Incuber les sections immédiatement avec une solution de coloration X-Gal à 37 ° C pendant 24 heures dans une chambre humide.
6. Rincer les lames dans du PBS 2 fois pendant 5 min, puis brièvement dans de l'eau distillée.
7. Contre-coloration avec le rouge rapide nucléaire pendant 10-30 secondes, rincer à l'eau distillée et monter les lames avec Immu-Mount.

4. Les résultats représentatifs

Asai et al. Rapporté dans l'article d'origine sur le modèle de Dunn dérivé LM8 souris OS que les tumeurs sc primaires dérivées des cellules parentales Dunn, différents de ceux issus de la grande lignée de cellules métastatique LM8 sous, ne forment spontanément des métastases pulmonaires détectables dans syngéniques C3H ^14. Avec les techniques rapportées ici, nous avons une nouvelle enquête de la formation de métastases dans les modèles Dunn/LM8 OS souris. Nous avons profité de lacZ stable transduites par Dunn et LM8 cellules et d'un protocole pour la perfusion du poumon in situ et de la fixation sur des souris. Des images représentatives des poumons perfusés et non perfusée de souris injectées avec lacZ sous-cutanée transduites et non transduites contrôle Dunn et LM8 cellules sont représentées sur la figure 1. Chez les souris injectées avec des cellules de contrôle Dunn, métastases macroscopiques et microscopiques restée indétectable dans les poumons perfusés et non perfusés (figure 1A, i-iv). Mais, curieusement, chez des souris injectées avec des cellules Dunn-lacZ, coloration X-gal a révélé bleu micrométastatique foyers de cellules simples ou amas de cellules de petite taille (<0,1 mm) sur la surface de la non-perfusés poumons (figure 1A, vi). In- perfusion in situ et la fixation des poumons encore amélioré la détectabilité de Dunn-lacZ micrométastases (figure 1A, viii). Cependant, excroissance au macroscopique des foyers n'a pas été observé (figure 1A, v, vii).

Chez les souris injectées avec des cellules de contrôle LM8, translucides, à peine détectable macrométastatique foyers supérieure à 0,1 mm de diamètre ont été reconnus dans les poumons non perfusés (figure 1B, i). Perfusion du poumon (figure 1B, iii) n'améliore pas la détection des foyers. Cependant, chez les souris injectées avec LM8-lacZ plusieurs cellules X-Gal teinté bleu macro-(figure 1B, v) et micrométastases (figure 1B, vi) ont été détectés à la surface de la non-perfusés organes. En outre, la perfusion des poumons en outre amélioré la détectabilité des macro-et micro-métastases (figure 1B, vii - viii). Par conséquent, les micro-et macrométastases est devenu visible à une densité plus élevée et un plus grand nombre, principalement en raison de la translucidité du tissu perfusé dans lequel foyers sous la surface de l'organe est devenu aussi visible.

Une h supplémentaireanalyse istological utilisant cryosections de tissu pulmonaire confirmé l'amélioration de la détectabilité des métastases pulmonaires chez des souris injectées avec lacZ transduites par Dunn et LM8 cellules. Chez les souris ayant des tumeurs primaires dérivées de Dunn-lacZ ou LM8-lacZ cellules, contrairement aux souris atteintes de tumeurs primaires des cellules témoins respectifs, des micrométastases ou de cellules, même seul foyers ont été constatés dans les sections du poumon (figure 2). En outre, macrométastases étaient également plus clairement visible dans les souris injectées avec des cellules LM8-lacZ que chez les animaux injectés avec le contrôle LM8 cellules (figure 2C, D).

Figure 1. Détection de métastases spontanées de non transduites (i-iv) et lacZ-transduction (v-viii) Dunn (A) et LM8 (B) dans les cellules non perfusé (i, ii, v, vi) et perfusé (iii, iv, vii, viii) les poumons chez les souris C3H. Métastases représentant X-Gal-staINED poumons entiers (v, vii en A et B) et correspondant en gros plan (vi, viii A et B) apparaissent en bleu. Macrométastatique foyers (> 0,1 mm) dans les organes de souris injectées avec des cellules marqués LM8 (i-iv en B) sont indiqués par des astérisques. Zones indiquées dans les gros plans sont représentatifs de poumons entiers. Barres d'échelle indiquent 1 mm dans les images de poumons entiers et 0,1 mm en gros plan. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2. Détection de Dunn et LM8 micrométastases dans cryosections pulmonaires. Des coupes de tissu pulmonaire octobre embarqué ont été incubés dans X-Gal solution de coloration à 37 ° C pendant 24 heures dans une chambre humide et ensuite contre le nucléaire rapide rouge. Les flèches indiquent micrométastatique foyers reconnus dans les sections de poumons de souris injectées avec Dunn-lacZ (B) ou LM8-lacZ cellules (D). Micrometastases restée indétectable dans les sections de poumon de souris injectées avec des non-transduites Dunn (A) ou LM8 cellules (C). Barres d'échelle indiquent 0,1 mm.

Discussion

Les résultats présentés ici dans le modèle de souris Dunn/LM8 OS démontrer la puissance de la méthode nouvellement créée qui combine la coloration X-Gal de lacZ-taggés cellules tumorales avec la perfusion in situ / fixation du tissu pulmonaire. Cette combinaison de deux techniques permet de détecter des lésions de sensibilité micrométastatiques jusqu'au niveau de la cellule unique et améliore également la visualisation de macrométastases sur la surface du poumon (figure 1) ainsi que dans les sections du poumon (figure 2). Bien que la coloration X-Gal permet également la détection de (micro) métastases dans d'autres organes, in-situ de perfusion / fixation améliore la détectabilité des foyers métastatiques dans les tissus autres que le poumon que légèrement en raison de la couleur naturelle du sang et des tissus liée à de ces ¹³ organes. Même si la perfusion est dirigé vers un autre organe, par exemple le foie, l'élimination du sang serait que partiellement améliorer le contraste pariween coloration X-Gal et de la couleur naturelle de l'organe. Cependant, la méthode est applicable à tout type de lacZ étiquetées cellules tumorales, va considérablement améliorer la détectabilité des métastases pulmonaires jusqu'au niveau des dormants unicellulaires micrométastases et permet une quantification simple et fiable de macro-et micro-métastases. Une limitation de cette méthode et toutes les autres techniques qui sont basées sur des gènes rapporteurs luciférase, y compris les protéines fluorescentes, et c'est la stabilité de l'expression du transgène. Comme le montre la figure 2d, toutes les cellules tumorales dans les foyers macrométastatique sont colorés en bleu, ce qui indique un manque d'activité beta-galactosidase. Cela pourrait être lié à la nécrose, mais il est plus probablement due à une perte de l'expression du transgène. Nous avons observé que la Dunn et LM8 cellules sont très efficaces dans la régulation négative de lacZ et d'autres transgènes même dans la sélection continue d'expression. Nous avons donc mis dans des études récentes de la K12 murinet K7M2 et les humains HOS, 143B et Saos-2 lignées de cellules d'ostéosarcome, qui ont tous maintenu stable expression de lacZ in vitro ainsi que in vivo jusqu'à 100% au cours du temps.

Une fois stable lacZ-expression est garantie, cette technique peut être appliquée dans des études avec des gènes manipulés cellules tumorales de façon mécanique, par exemple pour étudier le processus de colonisation des tissus de ¹³ ainsi que pour le développement et les essais de nouveaux traitements visant à l'éradication des lésions métastatiques ^{15 , 16.} De plus, il peut servir de référence pour l'amélioration des techniques actuelles d'imagerie radiologique, tels que le PET, le (micro) TDM et l'IRM, utilisés pour la détection précoce des lésions métastatiques. Dans une étude récente PET (inédit) avec différents traceurs nous avons vérifié le dans le poumon détecté in vivo les métastases in vivo par la suite ex avec le protocole décrit. Dans une étude en cours avec un animal nouveau petit micro-CT (SkyScan) nous sommes si loin able pour détecter les métastases pulmonaires in vivo à une taille de 0,5 mm et ex vivo à 0,3 mm, mais nous visons à une résolution de 0,1 mm. Il est intéressant, c'est la limite de taille que nous avons mis de distinguer macro et micro-métastases avec la méthode combinée de la perfusion in situ et coloration X-Gal. Cela souligne encore une fois la sensibilité et l'utilité de cette technique facile et rentable.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Narketan10 (kétamine)	Vétoquinol SA		100 mg / ml, solution
Xylazin (xylazine)	Streuli Pharma AG		20 mg / ml, solution
Prequilan (acépromazine)	FATRO SpA		10 mg / ml, solution
Bulldog Type de Serrefine clamp vasculaire	Outils Fine Science	18051-35	courbé, 35 mm
Gobelet en plastique avec couvercle	Semadeni	2988	25 tasses ml avec couvercles
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); poudre	Axxora	ALX-582-002-G005	dissoudre dans de la N, N-di-méthylformamide à 40 mg / ml, magasin protégée lumière à -20 ° C
Une solution de coloration de base, équilibrée à pH 7,1, stockée lumière protégés à 4 ° C pendant max. 1 mois	auto-rendu		100 ml / L 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 ml / L 1M MgCl2, 2 ml / L 10% de NP40, 1 ml / L 10% Sodium désoxycholate-
Moyen Embedding PolyFreeze	Polysciences; distributeur suisse: Brunschwig	19636-1
Intégration moule	Polysciences	18646A-1
Leica CM1850 cryostat	Leica Microsystems
Diapositives SuperFrost	Menzel	J1800AMNZ
Nuclear Fast Red-- solution de sulfate d'aluminium	Division Chroma Waldeck GmbH & Co KG distributor: Medite	84-0241-00
Immu-Mount	Thermo Electron, distributeur suisse: Histocom	9990412