סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס

Summary

המשקעים סידן פוספט הוא שיטה נוחה וחסכונית עבור transfection של תאים בתרבית. עם אופטימיזציה, ניתן להשתמש בשיטה זו בתאים שקשה transfect כמו נוירונים עיקרי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול מפורט שלנו עבור transfection סידן פוספט של נוירונים בהיפוקמפוס cocultured עם תאי astroglial.

Abstract

המשקעים סידן פוספט הוא שיטה נוחה וחסכונית עבור transfection של תאים בתרבית. עם אופטימיזציה, ניתן להשתמש בשיטה זו בתאים שקשה transfect כמו נוירונים עיקרי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול מפורט שלנו עבור transfection סידן פוספט של נוירונים בהיפוקמפוס cocultured עם תאי astroglial.

Introduction

הנוירונים עיקריים הם אחד מסוגי התאים בצורה הקשה ביותר לtransfect כפי שהם postmitotic ורגישים מאוד לשינויי מיקרו סביבתיים. ישנם ארבעה סוגים נפוצים של שיטות לביטוי של גנים אקסוגניים וRNAs קצר סיכה (shRNAs) בתאים אלה ^1. לכל אחד יש יתרונות משלה וחסרונות. לדוגמא, electroporation מבוצע בדרך כלל על נוירונים מבודדים טרי ^2, כמו תאים חייבים להיות מועברים לcuvettes עבור transfection. זיהום בנגיף בדרך כלל ניתן להשיג יעילות גבוהה מאוד ^3, אבל הוא יותר עתיר עבודה ומסוכנת למפעילים. ריאגנטים transfection בתיווך שומנים רבים זמינים באופן מסחרי, בדרגות שונות של הצלחה בתאי עצב ורמות שונות של cytotoxicity.

transfection סידן פוספט מייצג שיטה נוחה וחסכונית להחדרת גנים זרים לתוך תאי עצב. השיטה שימשה לראשונה להציג את ה-DNA adenovirus לתוך cel היונקיםls ידי גרהם ואן דר Eb (1973) ^4. Transfection בוצע על ידי ערבוב של סידן כלורי עם ה-DNA רקומביננטי בחיץ פוספט. זה מאפשר היווצרות של פוספט DNA / סידן שוקע בו, כאשר ירד בהדרגה על monolayer של תאים, לדבוק בתא השטח, נתפס על ידי אנדוציטוזה וסופו של דבר להיכנס לגרעין ^5. תהליך זה יביא לביטוי של גנים זרים הציגו בתא היעד. יעילות אופיינית למגוון transfection סידן פוספט בין 0.5-5% ^6-8. עם זאת, עם אופטימיזציה מדוקדקת וביצוע של פרוטוקול הניסוי עולה בקנה אחד, אפשר להגיע ליעילות transfection של כמעט 50%. כאן אנו מתארים הפרוטוקול מפורט שלנו עבור transfection סידן פוספט של נוירונים בהיפוקמפוס עיקריים, אשר cocultured עם תאי astroglial בפורמט כריך ^9.

Protocol

1. הכנת עכברוש astrocyte תרבות למדיה אוויר וastrocyte נוירון cocultures.

1. הכן את חיץ דיסקציה (BSS, ראה טבלת מס '1 למתכון) ולאחסן ב 4 ° C עד מוכן לשימוש.
2. הרדימי גורי ילוד חולדה (P0-P2) עם isoflurane בכוס 500 מיליליטר.
3. כאשר גורים הם נייחים, תרסיס עם אתנול 70% ולערוף.
4. הסר את המוח.
   1. חזק היטב את הראש עם זוג דומון # 5 מלקחיים, ולהשתמש במספריים בסדר לעשות חתך קו האמצע דרך העור והגולגולת.
   2. לחשוף את המוח על ידי המשקף את הגולגולת לצדדים, ולהסיר את המוח לתוך צלחת המכילה BSS הקר.
5. הפרד את אונות המוח מdiencephalon וגזע המוח תחת בהיקף לנתח. מוציא בזהירות את כל קרומי המוח על ידי ייצוב הרקמות עם זוג אחד של מלקחיים ומשייכתו בעדינות משם קרומי המוח עם זוג נוסף של מלקחיים.
6. לאסוף את כל אונות in אחד 60 מנה מ"מ. בעזרת מספריים קטנים, רקמת בשר טחון כדק ככל האפשר. לאחר מכן להעביר את הרקמות טחונות לצינור חרוטי 50 מיליליטר.
7. הוסף 1.5 מיליליטר של 1% DNase אני וטריפסין 1.5 מיליליטר של .2.5% ו12 מיליליטר של BSS (נפח כולל של 15ml) למוח. דגירה באמבט מים רועד במשך 15 דקות ב37 ° C. כדי להבטיח ערבוב טוב, צינור התערבל ביד כל 5 דקות.
8. העברת supernatant דרך מסננת 70 מיקרומטר תא מעל צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש. הוסף 3 מיליליטר FBS לsupernatant זה.
9. לחתיכות שנותרו, להוסיף 13.5 מיליליטר של BSS וטריפסין 1.5 מיליליטר 2.5% דגירה בwaterbath הרועדת לעוד דקות 15.
10. מעביר את supernatant שנותר דרך מסננת התא ולשלב עם supernatant משלב 1.8.
11. צנטריפוגה ב 1,000 סל"ד במשך 5 דקות עד גלולה התאים.
12. כדורי resuspend ב 5 מיליליטר של תקשורת גליה. Supernatant ניתן centrifuged שוב לגלולת התאים הנותרים.
13. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
14. cel פלייטls בצפיפות של 1 x 10 ⁷ סנטימטר ל150 ² בקבוק.
15. שינוי בתקשורת לתקשורת גליה טרי היום לאחר ציפוי. לאחר מכן, תאים להאכיל פעמיים בשבוע עם תקשורת גליה.
16. כאשר תאים הגיעו confluency> 80% (כ 10 ימים לאחר ציפוי), להקפיא את התאים למטה ב90% בסרום סוס וDMSO 10% ולהחזיק מלאי בחנקן נוזלי. תאים קפואים ב2 x 10 ⁶ לכל בקבוקון. אפשר להקפיא כ 5 בקבוקונים מבקבוק אחד.
17. על 10-14 ימים לפני הגדרת התרבות בהיפוקמפוס, ותאי גלייה הם מצופים מהמניות הקפואות. בדרך כלל אנחנו צלחת חמש 6 צלחות היטב, וזה מספיק כדי לתמוך בצמיחה של 90 coverslips של נוירונים בהיפוקמפוס (שלושה coverslips 15 מ"מ עגול לכל טוב). אנחנו גם צלחת שמונה עד עשר מנות נוספות 60 מ"מ של תאי גליה, המשמשת לתקשורת N2.1 האוויר עבור transfection. היום לפני התרבות עצבית, צריכים להיות מוזנים בתאים עם תקשורת NB27. האסטרוציטים אידיאלי צריכים להיות מחוברות 90%> ב ההוא נקודה. אנו מוצאים כי הקפאה מקטינה באופן משמעותי את מספר מיקרוגליה בתרבויות astroglial. מאז רעילות העצבית מוגברת נצפתה כאשר מיקרוגליה קיים בתרבויות astroglial, אנחנו תמיד משתמשים בתרבות astroglial הוכנה ממניות קפוא לcoculture עם הנוירונים.

2. עצבי תרבות

1. coverslips זכוכית נקי על ידי השטיפה הראשונה ב2x המים milliQ. אז הם ספוגים בחומצה חנקתית מרוכזת ל24 שעות, ולשטוף עם מים milliQ לפחות חמש פעמים על סך של 2 שעות. Coverslips הם מיובשים ועיקור על ידי אפייה בתנור בחום של C ° 225 במשך 6 שעות.
2. העברת coverslips 60 מ"מ מנות לאחר עיקור. הנח ארבע נקודות של פרפין סטרילי ליד הקצה החיצוני של כל coverslip כדי לשמור על תאי עצב להיפרד מתאי גליה במהלך coculture.
3. coverslips מעיל עם 1 מ"ג / פולי-L-ליזין מיליליטר במאגר M 0.1 borate לילה בחממת 37 מעלות צלזיוס.
4. למחרת, לשטוף coverslips פעמיים במ 'סטריליilliQ מים לפחות 15 דקות כל אחד. אז הם מודגרות לילה בתקשורת ציפוי ב37 ° C חממה.
5. להרדים חולדה בהריון (E18) על ידי הרדמה isoflurane אחרי חזה אוויר, ולהרדים חולדות עוברי על ידי עריפת ראש. הסר את המוח ולנתח את אונות המוח כפי שתואר לעיל.
6. לנתח את hippocampi מחץ כדור מוחין. מניחים את כל hippocampi לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר, ולעכל עם טריפסין 0.25% (0.5 מיליליטר 2.5% טריפסין, 4.5 מיליליטר BSS) על 37 ℃ במשך 15 דקות.
7. hippocampi מתעכלת הם שטופים ב3x BSS במשך 5 דקות כל אחד. אז הם נכתשו עם זכוכית פיפטה פסטר, וצפיפות התאים נקבעת באמצעות hemocytometer. אז נוירונים הם זורעים בצפיפות של 2 x 10 ⁵ תאים לכל 60 מנה מ"מ.
8. כ 2-4 שעות לאחר ציפוי, העברת coverslips עם הנוירונים מחוברים למנות המכילות תאי astroglial, עם הנוירונים פונים כלפי מטה לכיוון גליה. בDIV3, להוסיף arabinoside ציטוזין לתאים בריכוז סופי של 5 מיקרומטר לעצור התפשטות גליה.

3. Transfection סידן

1. תקשורת N2.1 מצב על גליה היום לפני transfection.
2. ביום transfection, לקחת תקשורת N2.1 התנתה הנחה של גליה ולהעביר לתוך צלחת חדשה. העברת coverslips עם נוירונים לתוך תקשורת N2.1 המותנה. תן לאזן באינקובטור במשך 10-30 דקות.
3. לקבוצה אחת של צינורות סטרילי, לשלב 1-4 מיקרוגרם של ה-DNA, 12.5 μl של 2 מ 'CaCl _2, וסטרילי H ₂ O להיקף כולל של 100 μl. לסט שני של צינורות, להוסיף של 2x HBS 100 μl.
4. הוספת ⅛ נפח של 2x HBS (12.5 μl) בכל פעם לצינור המכיל את תערובת CaCl ₂ / ה-DNA, vortexing לכמה שניות בכל פעם. לאפשר הצינורות לשבת במשך 15 דקות.
5. לאחר 15 דגירה דקות, מוסיף את dropwise תערובת transfection לתאים. דגירה של 1-1.5 שעה. שכבה של משקעים כמו חול צריכה להיות גלויהתחת מיקרוסקופ באמצעות מטרת 10X.
6. לאחר דגירה, לשטוף coverslips פעמיים עם חיץ לשטוף HBS חם.
7. לחזור coverslips למנות מקוריות עם גליה, להוסיף חומצת kynurenic לריכוז סופי של 0.5 מ"מ.
8. ניתן הדמיה נוירונים transfected חי או מעובד לimmunocytochemistry כבר ביום שלמחרת. נוירונים יכולים לשרוד עד שלושה שבועות לאחר transfection.

תוצאות

כאשר הפרמטרים השונים של transfection מותאמים ונשלטים בקפידה מניסוי לניסוי, ניתן להשיג יעילות transfection של עד 50%. איור 1 מציג שדה של נוירונים שהם transfected עם GFP על DIV4. השדה מכיל בסך הכל 28 נוירונים, ביניהם 16 היו transfected. זה מייצג את יעילות של מעל 50%. דגימה של שדות אחרים באותו cover...

Discussion

ישנם מספר פרמטרים מרכזיים שצריך להיות מבוקרים בקפידה לtransfections המוצלח באופן עקבי ^10,11. הפרמטר הקריטי ביותר עבור transfection סידן פוספט הוא ערך ה-pH של 2x HBS, אשר בידיים שלנו בדרך כלל נע בין 7.10-7.15. אנו ממליצים להכין שלוש קבוצות של מניות עם ערכי ה-pH ב0.05 מרווחים כדי להסביר את ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09	straight / sharp 8.5 cm
Vannas-Tubinger spring scissors	Fine Science Tools	15008-08	angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-16
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91401-14	blunt / 14.5 cm
Spring scissors	Fine Science Tools	15006-09	angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge
Isoflurane	Webster Veterinary	14043-225-06
Poly-L-lysine	Sigma	P2636
MEM	Sigma	M2279
100 mM Sodium pyruvate	Sigma	S8636
Glucose	Sigma	G8270
10x HBSS	Sigma	H4385
1 M HEPES, pH 7.3	Gibco/Invitrogen	15630-080
GlutaMAX	Gibco/Invitrogen	35050-061
Neurobasal Media	Gibco/Invitrogen	21130-049
B27 Supplement (50x)	Gibco/Invitrogen	17504-044
N2 Supplement	Gibco/Invitrogen	17502-048
Ovalbumin	Sigma	A5503
Penicillin/Streptomycin	Gibco/Invitrogen	15070-063
2.5% Trypsin	Gibco/Invitrogen	15090-046
DNase I	Sigma	DN-25
Cytosine arabinoside	Calbiochem/EMD Millipore	251010
Kynurenic acid	Sigma	K3375