Fosfato de cálcio transfecção de primário neurônios do hipocampo

Resumo

Precipitação com fosfato de cálcio é um método conveniente e económico para a transfecção de células em cultura. Com a otimização, é possível usar esse método em células de difícil transfecção como neurônios primários. Aqui nós descrevemos o nosso protocolo detalhado para a transfecção de fosfato de cálcio dos neurônios do hipocampo co-cultivadas com células gliais.

Resumo

Precipitação com fosfato de cálcio é um método conveniente e económico para a transfecção de células em cultura. Com a otimização, é possível usar esse método em células de difícil transfecção como neurônios primários. Aqui nós descrevemos o nosso protocolo detalhado para a transfecção de fosfato de cálcio dos neurônios do hipocampo co-cultivadas com células gliais.

Introdução

Neurónios primários são um dos tipos de células difíceis de transfectar, como eles são pós-mitótico e são muito sensíveis às alterações de micro-ambientais. Existem quatro tipos vulgarmente utilizados para os métodos de expressão de genes exógenos e RNAs de curto hairpin (shRNAs) nestas células ^1. Cada um tem suas próprias vantagens e desvantagens. Por exemplo, a electroporação, são geralmente realizados em neurónios recentemente isolados ^2, como as células têm de ser transferidos para cuvetes de transfecção. Infecção pelo vírus geralmente pode alcançar uma eficiência muito alta ^3, mas é mais trabalhoso e arriscado para os operadores. Muitos reagentes de transfecção mediada por lipidos são disponíveis comercialmente, com variados graus de sucesso em neurónios e diferentes níveis de citotoxicidade.

Transfecção com fosfato de cálcio representa um método conveniente e económico para a introdução de genes estranhos em neurónios. O método foi usado pela primeira vez para introduzir o DNA do adenovírus em cel mamíferosls por Graham e Van der Eb (1973) ^4. A transfecção foi realizada por mistura de cloreto de cálcio com o ADN recombinante, em tampão fosfato. Isto permite a formação de fosfato de DNA / precipitados de cálcio que, quando gradualmente libertado para uma monocamada de células, aderem à superfície da célula, são ocupados por endocitose e, finalmente, entrar no núcleo ^5. Este processo conduzirá à expressão de genes estranhos introduzidos na célula alvo. Eficiência típicos de cálcio gama de transfecção de fosfato de entre 0,5-5% ^6-8. No entanto, com cuidado e optimização execução consistente do protocolo experimental, é possível atingir uma eficiência de transfecção de quase 50%. Aqui, descrevemos a protocolo detalhado para a transfecção com fosfato de cálcio de neurónios do hipocampo primárias, que são co-cultivadas com células gliais em um formato de sanduíche ^9.

Protocolo

1. Preparando Rat Astrocyte Cultura para meios condicionados e Astrocyte neurônio-co-culturas.

1. Preparar tampão de dissecção (BSS, ver Tabela 1 para receita) e armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
2. Anestesiar filhotes de ratos neonatais (P0-P2) com isoflurano em um copo de 500 ml.
3. Quando os filhotes são imóveis, spray com etanol 70% e decapitar.
4. Remover o cérebro.
   1. Segure a cabeça com firmeza com um par de Dumont # 5 fórceps, e usar uma tesoura fina para fazer uma incisão na linha média através da pele e crânio.
   2. Exponha o cérebro, refletindo o crânio para os lados, e remover o cérebro em um prato contendo frio BSS.
5. Separa-se os hemisférios cerebrais do diencéfalo e do tronco cerebral, sob um escopo de dissecação. Retire com cuidado todas as meninges através da estabilização do tecido com um par de fórceps e puxando suavemente as meninges com outro par de fórceps.
6. Colete todos os hemisférios in um prato de 60 milímetros. Com uma tesoura pequena, tecido picada finamente quanto possível. Em seguida, transferir o tecido picada para um tubo cônico de 50 ml.
7. Adicionar 1,5 ml de 1% de DNase I e 1,5 ml de 2,5% de tripsina e 12 ml de BSS (volume total de 15 ml) para o cérebro. Incubar em um banho de água com agitação durante 15 min a 37 ° C. Para garantir uma boa mistura, o tubo é rodou pela mão a cada 5 min.
8. Transfira o sobrenadante através de um filtro de 70 mM celular sobre um novo tubo de 50 ml. Adicionar 3 ml de FBS a este sobrenadante.
9. Para as peças restantes, adicione 13,5 ml de BSS e 1,5 ml de 2,5% de tripsina e incubar em banho-maria com agitação durante mais 15 min.
10. Transferir o sobrenadante restante através do filtro de células e combinam-se com o sobrenadante do passo 1.8.
11. Centrifugar a 1000 rpm durante 5 min para sedimentar as células.
12. Ressuspender as peletes em 5 mL de meio gliais. O sobrenadante pode ser centrifugado novamente para sedimentar as restantes células.
13. Contagem de células utilizando um hemocitómetro.
14. Placa cells a uma densidade de 1 x 10 frasco ⁷ para 150 cm ^2.
15. Mude de mídia para mídia gliais frescos do dia após o plaqueamento. Posteriormente, alimentar as células duas vezes por semana com meios glial.
16. Quando as células atingiram> 80% de confluência (aproximadamente 10 dias após o plaqueamento), congelar células para baixo em 90% de soro de cavalo e 10% DMSO e manter estoques em nitrogênio líquido. As células são congeladas a 2 x 10 ⁶ por frasco. Aproximadamente 5 frascos podem ser congeladas a partir de cada frasco.
17. Cerca de 10-14 dias antes da configuração da cultura do hipocampo, as células gliais são banhados dos estoques congelados. Costumamos chapa cinco placas de 6 poços, o que é suficiente para suportar o crescimento de 90 lamelas de neurônios do hipocampo (três lamelas de 15 milímetros rodada por poço). Também placa um oito a dez 60 milímetros pratos adicionais de células da glia, que é usado para a mídia condicionado N2.1 para transfecção. Um dia antes de cultura neuronal, as células devem ser alimentados com a mídia NB27. Os astrócitos deve ser idealmente> 90% confluentes no thé o ponto. Descobrimos que o congelamento reduz grandemente o número de microglia nas culturas astrogliais. Desde aumentou neurotoxicidade é observado quando microglia está presente nas culturas astrogliais, usamos sempre a cultura astroglial preparados a partir de estoques congelados por co-cultura com os neurônios.

2. Neuronal Cultura

1. Lamelas de vidro limpo de primeira lavagem em milliQ 2x água. Eles são, em seguida, embebidas em ácido nítrico concentrado, durante 24 horas, e lavado com água MilliQ para, pelo menos, cinco vezes durante um total de 2 horas. As lamelas são secos e esterilizados por cozimento num forno a 225 ° C durante 6 horas.
2. Transferência de lamelas de 60 milímetros pratos após a esterilização. Coloque quatro pontos de parafina estéril perto do bordo exterior de cada lamela para manter neurónios separar a partir de células da glia durante a cocultura.
3. Lamelas revestimento com 1 mg / ml de poli-L-lisina em tampão borato 0,1 M durante a noite a 37 ° C em incubadora.
4. No dia seguinte, lave lamelas duas vezes em m estérililliQ água por pelo menos 15 min cada. Eles são, então, incubadas durante a noite em meio de plaqueamento em 37 ° C incubadora.
5. Eutanásia ratos fêmeas grávidas (E18) pela anestesia isoflurano seguido por pneumotórax, e sacrificá ratos embrionárias por decapitação. Remover os cérebros e dissecar os hemisférios cerebrais, como descrito acima.
6. Dissecar o hipocampo do hemisfério cerebral. Coloque todos os hipocampos em um tubo de 15 ml, e digest com 0,25% de tripsina (0,5 ml de 2,5% de tripsina, 4,5 ml de BSS) a 37 ℃ durante 15 min.
7. Hipocampos digeridas são lavados em 3x BSS durante 5 minutos cada. Eles são, em seguida, triturado com uma pipeta de Pasteur de vidro, e a densidade de células é determinado por meio de um hemocitómetro. Os neurónios são então semeadas a uma densidade de 2 x 10 ⁵ células por prato de 60 milímetros.
8. Sobre 2-4 horas após o plaqueamento, transferência lamelas com os neurônios ligados aos pratos contendo células gliais, com os neurônios virado para baixo em direção à glia. No DIV3, adicionar citosina arabinosido para oAs células a uma concentração final de 5 uM para parar a proliferação de células gliais.

3. A transfecção de cálcio

1. Mídia Condição N2.1 em glia um dia antes da transfecção.
2. No dia da transfecção, tomar mídia N2.1 condicionado fora da glia e transferir para um novo prato. Transferência de lamelas com os neurônios na mídia N2.1 condicionado. Deixe-se equilibrar na incubadora durante 10-30 min.
3. Para um conjunto de tubos esterilizados, combinar 1-4 ug de ADN, 12,5 ul de 2 M de CaCl ₂ e H ₂ O estéril para um volume total de 100 ul. Para um segundo conjunto de tubos, adicione 100 ml de 2x HBS.
4. Adicionar o volume ⅛ de 2x HBS (12,5 ul) de cada vez que o tubo contendo a mistura de CaCl ₂ / ADN, vortex durante alguns segundos de cada vez. Deixe os tubos em repouso por 15 min.
5. Após 15 minutos de incubação, adicionar a mistura de transfecção gota a gota às células. Incubar por 1-1,5 horas. Uma camada de precipitados areia-como deve ser visívelao microscópio utilizando uma objectiva de 10X.
6. Após a incubação, lavar lamelas duas vezes com tampão de lavagem HBS quente.
7. Retornar lamelas para pratos originais com glia, adicionar ácido kynurenic para uma concentração final de 0,5 mM.
8. Neurônios transfectadas podem ser visualizados ao vivo ou processados ​​para imunocitoquímica, logo no dia seguinte. Neurônios podem sobreviver até três semanas após a transfecção.

Resultados

Quando os diferentes parâmetros de transfecção são optimizados e cuidadosamente controlada de experiência para experiência, é possível obter eficiências de transfecção de até 50%. Figura 1 mostra um campo de neurónios que são transfectadas com GFP em DIV4. O campo contém um total de 28 neurónios, entre os quais 16 foram transfectadas. Isto representa um rendimento de mais de 50%. Uma amostragem de outros campos na mesma lamela mostra a eficiência global é de cerca de 50% (dados não mo...

Discussão

Existem vários parâmetros-chave que precisam ser cuidadosamente controlado para transfections consistentemente bem sucedidos ^10,11. O parâmetro mais crítico para a transfecção de fosfato de cálcio é o valor de 2x HBS, que nas nossas mãos geralmente varia entre 7,10-7,15 pH. Recomendamos fazer três lotes de ações com valores de pH em 0,05 incrementos para explicar a diferença entre os medidores de pH. Alternativamente, o kit de transfecção de mamíferos Clontech fornece 2x HBS que sempre rende u...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09	straight / sharp 8.5 cm
Vannas-Tubinger spring scissors	Fine Science Tools	15008-08	angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-16
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91401-14	blunt / 14.5 cm
Spring scissors	Fine Science Tools	15006-09	angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge
Isoflurane	Webster Veterinary	14043-225-06
Poly-L-lysine	Sigma	P2636
MEM	Sigma	M2279
100 mM Sodium pyruvate	Sigma	S8636
Glucose	Sigma	G8270
10x HBSS	Sigma	H4385
1 M HEPES, pH 7.3	Gibco/Invitrogen	15630-080
GlutaMAX	Gibco/Invitrogen	35050-061
Neurobasal Media	Gibco/Invitrogen	21130-049
B27 Supplement (50x)	Gibco/Invitrogen	17504-044
N2 Supplement	Gibco/Invitrogen	17502-048
Ovalbumin	Sigma	A5503
Penicillin/Streptomycin	Gibco/Invitrogen	15070-063
2.5% Trypsin	Gibco/Invitrogen	15090-046
DNase I	Sigma	DN-25
Cytosine arabinoside	Calbiochem/EMD Millipore	251010
Kynurenic acid	Sigma	K3375