차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

요약

인산 칼슘 침전은 배양 된 세포의 형질 전환을위한 편리하고 경제적 인 방법입니다. 최적화로, 일차 뉴런 같은 어려운 형질 세포에이 방법을 사용하는 것이 가능하다. 여기에서 우리는 astroglial 세포와 공 배양 된 해마 신경 세포의 칼슘 형질 전환을위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명합니다.

초록

인산 칼슘 침전은 배양 된 세포의 형질 전환을위한 편리하고 경제적 인 방법입니다. 최적화로, 일차 뉴런 같은 어려운 형질 세포에이 방법을 사용하는 것이 가능하다. 여기에서 우리는 astroglial 세포와 공 배양 된 해마 신경 세포의 칼슘 형질 전환을위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명합니다.

서문

차 뉴런들이 postmitotic이며 마이크로 환경 변화에 매우 민감하다 같이 트랜 어려운 세포 유형의 하나이다. 이러한 세포 ¹ 외인성 유전자와 짧은 헤어핀 RNA를 (shRNAs)의 표현 방법의 네 가지 일반적으로 사용되는 유형이있다. 각각은 자신의 장점과 단점이 있습니다. 세포 형질 감염을위한 큐벳에 전송해야 예를 들어, 전기 천공은 일반적 갓 절연 ^뉴런이 수행된다. 바이러스 감염은 일반적으로 매우 높은 효율 ^3를 달성하지만, 더 노동 집약적 인 운영과 위험하다 할 수 있습니다. 많은 지질 매개 형질 전환 시약은 신경 세포와 세포 독성의 다른 수준에있는 성공의 학위를 변화와 함께, 상업적으로 이용 가능하다.

인산 칼슘 형질 감염은 뉴런에 외래 유전자를 도입하기위한 편리하고 경제적 인 방법을 나타낸다. 첫번째 방법은 포유 동물 CEL에 아데노 바이러스 DNA를 도입하기 위해 사용 하였다그레이엄과 반 데르 EB를 (1973)에 의해 LS ^4. 형질 포스페이트 완충액에서의 재조합 DNA와 염화 칼슘을 혼합함으로써 수행되었다. 이것은 서서히 세포 단층 상에 떨어질 때 DNA / 칼슘 포스페이트의 형성은 세포 표면에 부착, 엔도 사이토 시스에 의해 다루어 최종적 핵 ^5를 입력되며, 이는 석출물 허용한다. 이 과정은 표적 세포에 도입 된 외래 유전자의 발현을 초래할 것이다. 0.5-5 % ^6-8 사이 인산 칼슘 형질 범위의 전형적인 효율성. 그러나, 조심 최적화 실험 프로토콜의 일관된 실행을, 거의 50 %의 형질 감염 효율에 도달 할 수있다. 여기에서 우리는 샌드위치 형식 ⁹ astroglial 세포와 공 배양하는 기본 해마 신경 세포의 칼슘 형질 전환을위한 우리의 상세한 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

1. 에어컨 미디어 및 성상 세포 신경 세포 공 배양에 쥐 성상 세포 문화를 준비합니다.

1. (BSS 레시피 표 1 참조) 해부 버퍼를 준비하고 4 ° C에서 보관 사용 준비가 될 때까지.
2. 500 ㎖ 비이커에 이소 플루 란과 신생아 쥐 새끼 (P0-P2)를 마취.
3. 강아지가 움직 인 경우, 70 % 에탄올로 스프레이 목을 베다.
4. 뇌를 제거합니다.
   1. 뒤몽 # 5 포셉 한 쌍의 단단히 머리를 잡아, 피부와 두개골을 통해 중간 선 절개를 만들기 위해 미세 가위를 사용합니다.
   2. 측면에 두개골을 반영하여 뇌를 노출, 차가운 BSS를 포함하는 접시에 두뇌를 제거합니다.
5. 해부 범위에서 간뇌와 뇌간에서 대뇌 반구를 분리합니다. 조심스럽게 집게 일쌍과 조직을 안정화하고 부드럽게 포셉의 다른 쌍의 수막을 떼어 모든 수막을 제거합니다.
6. 모든 반구를 수집 IN 개의 60mm 접시. 작은 가위, 다진 조직과 같은 미세 가능한 한 사용. 그런 다음 50 ML 원뿔 튜브에 다진 조직을 전송합니다.
7. 1.5 1 % DNA 분해 효소 I ㎖ 및 1.5 ㎖의 2.5 % 트립신과 두뇌에 BSS (15ML의 총 부피)의 12 ML을 추가합니다. 37 ℃에서 15 분 동안 진탕 수조에서 부화 좋은 혼합을 보장하기 위해, 튜브는 손으로 5 분마다 소용돌이된다.
8. 새로운 50 ML 원뿔 관에 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 뜨는을 전송합니다. 이 상층에 3 ㎖의 FBS를 추가합니다.
9. 나머지 조각, 13.5 BSS ㎖ 및 1.5 ㎖의 2.5 % 트립신을 추가하고 또 다른 15 분 동안 진탕 수조에서 배양한다.
10. 셀 스트레이너를 통해 나머지 뜨는을 전송하고 단계 1.8에서 뜨는 결합.
11. 펠릿 세포 5 분 1,000 RPM에서 원심 분리기.
12. 아교 미디어 5 ㎖에 재현 탁 펠렛. 상청액 나머지 세포 펠렛을 다시 원심 분리 할 수​​있다.
13. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
14. 플레이트 CEL1 × 10 ⁷ 150cm 당 ² 플라스크의 밀도로 LS.
15. 하루 도금 후 신선한 아교 미디어에 미디어를 변경합니다. 그 후, 아교 미디어 일주일에 두 번 세포를 공급.
16. 세포가> 80 % 컨 플루 (약 십일 도금 후)에 도달했을 때, 90 % 말 혈청과 10 % DMSO에서 세포를 동결 액체 질소에 주식을 계속. 세포는 2 바이알 당 X 10 ⁶ 동결됩니다. 약 5 병 각 플라스크에서 고정 할 수 있습니다.
17. 대략 10-14 일 해마 문화를 설정하기 전에, glial 세포는 냉동 주식에서 도금된다. 우리는 일반적으로 해마 신경 세포의 90 커버 슬립 (물론 당 세 개의 15mm 라운드 커버 슬립)의 성장을 지원하기에 충분하다 다섯 6 - 웰 플레이트를, 접시. 우리는 또한 형질에 대한 조절 N2.1 매체에 사용되는 glial 세포의 추가 8 ~ 10 60mm의 요리를 접시. 하루는 신경 세포의 배양하기 전에, 세포 NB27 미디어가 공급되어야한다. 성상 세포는 이상적 일에서> 90 % 합류해야한다지점입니다. 우리는 크게 동결하면 astroglial 문화에서 미세 아교 세포의 수를 줄일 것을 찾을 수 있습니다. 미세 아교 세포가 astroglial 문화에 존재하는 경우 증가 된 신경 독성이 관찰되기 때문에, 우리는 항상 신경 세포와 공 배양 냉동 주식에서 준비 astroglial 문화를 사용합니다.

2. 신경 세포 문화

1. 를 MilliQ 물 2 배 첫 번째 린스로 청소 유리 커버 슬립. 그 후, 2 시간의 전체에 걸쳐 적어도 5 회 24 시간 동안 진한 질산에 침지하고을 MilliQ 물 세정된다. coverslips는 6 시간 동안 225 ° C의 오븐에 굽고 건조 및 살균된다.
2. 전송 멸균 60mm 요리에 커버 슬립. 신경 세포 공 배양시 glial 세포에서 분리 유지하기 위해 각 coverslip에의 외부 가장자리 근처에 멸균 파라핀의 네 점을 놓습니다.
3. 37 ° C 배양기에서 하룻밤 0.1 M 붕산 버퍼 / ㎖ 폴리-L-라이신 1 MG와 코트 커버 슬립.
4. 다음 날, 멸균 m에 두 번 coverslips를 씻어적어도 15 분마다 illiQ 물. 그들은 다음 37 ° C 배양기에서 도금 미디어에서 하룻밤 배양된다.
5. 기흉 다음에 이소 플루 란 마취에 의해 임신 한 쥐 (E18)를 안락사, 그리고 잘린 배아 쥐를 안락사. 머리를 제거하고 상기 한 바와 같이 대뇌 반구를 해부하다.
6. 대뇌 반구에서 해마를 해부하다. 15 ML 원뿔 튜브에 모든 해마를 놓고 15 분 동안 37 ℃에서 0.25 % 트립신 (0.5 ml의 2.5 % 트립신, 4.5 ml의 BSS)과 소화.
7. 소화 해마는 5 분마다 BSS 배에 씻어서. 이들은이어서 유리 파스퇴르 피펫으로 분쇄하고, 세포 밀도는 혈구 계를 사용하여 결정된다. 뉴런이어서 60mm 디쉬 당 2 × ¹⁰⁵ 세포의 밀도로 시딩 하였다.
8. 대략 2-4 시간 도금 후, 전송이 신경 교세포으로 아래를 향하도록, astroglial 세포를 포함하는 요리에 연결된 뉴런의 coverslips. DIV3에서에 시토신 아라 비노 시드를 추가5 μM의 최종 농도에서 세포 glia의 증식을 정지합니다.

3. 칼슘 형질

1. glia의 형질 전날의 조건 N2.1 미디어.
2. 형질의 날, 아교 오프 에어컨 N2.1 미디어를 가지고 새로운 요리로 전송할 수 있습니다. 전송 에어컨 N2.1 미디어에 뉴런의 coverslips. 10 ~ 30 분 동안 인큐베이터에서 평형을 보자.
3. 멸균 튜브의 한 세트로, DNA의 1-4 μg, 100 μL의 총 볼륨에 대한 2 M _염화칼슘 12.5 μL, 멸균 H ₂ O를 결합. 튜브의 두 번째 세트에 2 배 HBS 100 μl를 추가합니다.
4. 몇 초마다 볼 텍싱, _염화칼슘 / DNA 혼합물을 포함하는 튜브에 한번에 2X HBS의 ⅛ 체적 (12.5 μL)을 추가한다. 튜브가 15 분 동안 앉아 수 있습니다.
5. 15 분 배양 후, 세포에 형질 감염 혼합물 적가. 1.5 시간 동안 배양한다. 모래 같은 침전물 층이 볼 수 있어야합니다10X 목표를 사용하여 현미경.
6. 배양 후, 따뜻한 HBS 세척 버퍼로 두 번 커버 슬립을 씻어.
7. , 아교와 창작 요리로 커버 슬립을 반환 0.5 mm의 최종 농도 kynurenic 산을 추가합니다.
8. 형질 전환 된 뉴런의 이미지를 생성하거나 이미 다음 날 같은 면역 세포에 처리 할 수​​ 있습니다. 신경 세포는 형질 전환 후 3 주까지 살아남을 수 있습니다.

결과

형질의 다른 매개 변수를 최적화하고 신중하게 실험 실험에서 제어하는 경우, 최대 50 %의 형질 전환 효율을 얻을 수있다. 1 DIV4에 GFP 형질 전환 된 뉴런의 필드를 보여줍니다. 필드 (16)가 형​​질 전환 된 가운데 28 뉴런의 전체를 포함한다. 이것은 50 %의 효율을 나타냅니다. 동일한 커버 슬립에 다른 필드의 샘플링은 전체적인 효율 (데이터 미도시) 주변의 50 %이다. astroglia...

토론

주의 깊게 지속적으로 성공적인 형질 ^{(10, 11)에} 대해 제어 할 필요가 몇 가지 주요 매개 변수가 있습니다. 칼슘 포스페이트 형질 감염에 대한 가장 중요한 매개 변수는 우리 손에 보통 7.10-7.15 사이에서 변화 2X HBS의 pH 값이다. 우리는 산도 미터 사이의 차이를 설명 할 수는 0.05 단위로 pH 값과 주식의 세 가지 배치를하는 것이 좋습니다. 또한, 클론 테크 포유류의 형질 전환 키트는 지속적으로...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09	straight / sharp 8.5 cm
Vannas-Tubinger spring scissors	Fine Science Tools	15008-08	angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-16
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91401-14	blunt / 14.5 cm
Spring scissors	Fine Science Tools	15006-09	angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge
Isoflurane	Webster Veterinary	14043-225-06
Poly-L-lysine	Sigma	P2636
MEM	Sigma	M2279
100 mM Sodium pyruvate	Sigma	S8636
Glucose	Sigma	G8270
10x HBSS	Sigma	H4385
1 M HEPES, pH 7.3	Gibco/Invitrogen	15630-080
GlutaMAX	Gibco/Invitrogen	35050-061
Neurobasal Media	Gibco/Invitrogen	21130-049
B27 Supplement (50x)	Gibco/Invitrogen	17504-044
N2 Supplement	Gibco/Invitrogen	17502-048
Ovalbumin	Sigma	A5503
Penicillin/Streptomycin	Gibco/Invitrogen	15070-063
2.5% Trypsin	Gibco/Invitrogen	15090-046
DNase I	Sigma	DN-25
Cytosine arabinoside	Calbiochem/EMD Millipore	251010
Kynurenic acid	Sigma	K3375