Fosfato di calcio trasfezione di primaria neuroni dell'ippocampo

Riepilogo

Precipitazione di fosfato di calcio è un metodo conveniente ed economico per la trasfezione di cellule in coltura. Con ottimizzazione, è possibile usare questo metodo su cellule di difficile trasfezione come neuroni primari. Qui descriviamo il nostro protocollo dettagliato per fosfato di calcio trasfezione di neuroni dell'ippocampo co-coltivate con le cellule astrogliali.

Abstract

Precipitazione di fosfato di calcio è un metodo conveniente ed economico per la trasfezione di cellule in coltura. Con ottimizzazione, è possibile usare questo metodo su cellule di difficile trasfezione come neuroni primari. Qui descriviamo il nostro protocollo dettagliato per fosfato di calcio trasfezione di neuroni dell'ippocampo co-coltivate con le cellule astrogliali.

Introduzione

Neuroni primari sono uno dei tipi di cellule più difficili da trasfettare come sono postmitotico e sono molto sensibili alle variazioni microambientali. Ci sono quattro tipi comunemente usati di metodi per l'espressione di geni esogeni e RNA breve tornante (shRNAs) in queste cellule ^1. Ognuno ha i suoi vantaggi e svantaggi. Ad esempio, elettroporazione viene di solito effettuata su neuroni appena isolate ^2, come le cellule devono essere trasferiti in cuvette per trasfezione. Infezione da virus di solito può raggiungere un grado elevato di efficienza ^3, ma è sempre rischiosa per gli operatori-intensità di lavoro. Molti reagenti di transfezione lipidi mediata sono disponibili in commercio, con vari gradi di successo nei neuroni e diversi livelli di citotossicità.

Fosfato di calcio trasfezione rappresenta un metodo conveniente ed economico per l'introduzione di geni estranei in neuroni. Il metodo è stato usato per la prima a introdurre adenovirus DNA in cel mammiferiLS di Graham e Van Der Eb (1973) ^4. La trasfezione è stata eseguita miscelando cloruro di calcio con il DNA ricombinante in un tampone fosfato. Questo permette la formazione di fosfato di DNA / calcio precipitati che, quando gradualmente lasciato cadere su un monostrato di cellule, aderire alla superficie cellulare, sono assorbite per endocitosi e finalmente entrare nel nucleo ^5. Questo processo porterebbe alla espressione di geni estranei introdotti nella cellula bersaglio. Tipiche efficienze di fosfato di calcio serie trasfezione tra il 0.5-5% ^6-8. Tuttavia, con un'attenta ottimizzazione e coerente attuazione del protocollo sperimentale, è possibile raggiungere una efficienza di trasfezione di quasi il 50%. Qui descriviamo il nostro protocollo dettagliato per fosfato di calcio trasfezione di neuroni primari, che sono co-coltivate con le cellule astrogliali in un formato panino ^9.

Protocollo

1. Preparazione Rat astrociti Cultura per Media condizionata e astrociti-neuroni co-colture.

1. Preparare buffer di dissezione (BSS, vedi Tabella 1 per ricetta) e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
2. Anestetizzare cuccioli di ratto neonatale (P0-P2) con isoflurano in un bicchiere da 500 ml.
3. Quando cuccioli sono immobili, spruzzare con il 70% di etanolo e decapitare.
4. Rimuovere il cervello.
   1. Tenere la testa saldamente con un paio di Dumont # 5 pinze e usare le forbici pregiati per fare un'incisione mediana attraverso la pelle e il cranio.
   2. Esporre il cervello, riflettendo il cranio ai lati, e rimuovere il cervello in un piatto contenente freddo BSS.
5. Separare gli emisferi cerebrali dal diencefalo e il tronco cerebrale in un ambito di dissezione. Rimuovere con cura tutte le meningi stabilizzando il tessuto con un paio di pinze e tirando delicatamente le meningi con un altro paio di pinze.
6. Raccogliere tutti i emisferin un 60 millimetri piatto. Utilizzando piccole forbici, tessuti trita più finemente possibile. Poi trasferire il tessuto tritato in una provetta conica da 50 ml.
7. Aggiungere 1,5 ml di 1% DNasi I e 1,5 ml di 2,5% tripsina e 12 ml di BSS (volume totale di 15 ml) al cervello. Incubare in un bagno d'acqua per 15 minuti a 37 ° C. Per garantire una buona miscelazione, il tubo viene agitato a mano ogni 5 min.
8. Trasferire il surnatante attraverso un filtro 70 micron cella su un nuovo tubo conico da 50 ml. Aggiungere 3 ml FBS a questo surnatante.
9. Per i pezzi rimanenti, aggiungere 13,5 ml di BSS e 1,5 ml 2,5% tripsina e incubare nel bagnomaria agitazione per altri 15 min.
10. Trasferire il supernatante residuo attraverso il filtro cella e si combinano con il supernatante dal passo 1,8.
11. Centrifugare a 1000 rpm per 5 minuti per far sedimentare le cellule.
12. Risospendere pellet in 5 ml di media gliali. Surnatante può essere nuovamente centrifugato per far sedimentare le cellule rimanenti.
13. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
14. Piatto cells ad una densità di 1 x 10 ⁷ ogni 150 cm ² matraccio.
15. Cambiare media per mezzi freschi gliali il giorno dopo la placcatura. Successivamente, mangimi cellule due volte alla settimana con i media gliale.
16. Quando le cellule hanno raggiunto> 80% di confluenza (circa 10 giorni dopo placcatura), congelare le cellule dal siero di cavallo 90% e 10% DMSO e mantenere scorte in azoto liquido. Le cellule sono congelati a 2 x 10 ⁶ per flaconcino. Circa 5 fiale possono essere congelati da ciascun flacone.
17. Circa 10-14 giorni prima di impostare la cultura dell'ippocampo, cellule gliali sono placcati dalle scorte congelate. Noi di solito piatto di cinque piastre da 6 pozzetti, il che è sufficiente a sostenere la crescita di 90 vetrini di neuroni dell'ippocampo (tre coprioggetto 15 millimetri rotondi per pozzetto). Abbiamo anche piastra ulteriori otto a dieci 60 millimetri piatti a base di cellule gliali, che viene utilizzato per i media condizionata N2.1 per la trasfezione. Il giorno prima colture neuronali, cellule dovrebbe essere alimentato con i media NB27. Gli astrociti dovrebbero idealmente essere> 90% confluenti al secoloè il punto. Troviamo che il congelamento riduce notevolmente il numero di microglia nelle culture astrogliali. Dal momento che una maggiore neurotossicità si osserva quando la microglia è presente nelle culture astrogliali, usiamo sempre la cultura astrogliale preparato da scorte congelate per co-coltura con i neuroni.

2. Cultura neuronale

1. Pulire i vetrini per primo risciacquo in acqua MilliQ 2x. Essi vengono quindi immersi in acido nitrico concentrato per 24 ore, e risciacquati con acqua milliQ per almeno cinque volte per un totale di 2 ore. Coprioggetto vengono essiccati e sterilizzati mediante cottura in un forno a 225 ° C per 6 ore.
2. Trasferimento coprioggetto di 60 millimetri piatti dopo la sterilizzazione. Posizionare quattro punti di paraffina sterile vicino al bordo esterno di ogni coprioggetto per mantenere separati i neuroni da cellule gliali durante co-coltura.
3. Coprioggetto cappotto con 1 mg / ml di poli-L-lisina in 0.1 M tampone borato pernottamento a 37 ° C incubatore.
4. Il giorno dopo, lavare vetrini due volte in m sterileilliQ acqua per almeno 15 minuti ciascuno. Essi vengono poi incubate durante la notte nei media placcatura in 37 ° C incubatore.
5. Euthanize ratto gravide (E18) da anestesia isoflurano seguita da pneumotorace, e eutanasia topi embrionali per decapitazione. Rimuovere il cervello e sezionare i emisferi cerebrali come descritto sopra.
6. Sezionare il ippocampi dall'emisfero cerebrale. Mettere tutti ippocampi in una provetta conica da 15 ml, e digerire con tripsina 0,25% (0,5 ml 2,5% tripsina, 4,5 ml BSS) a 37 ℃ per 15 min.
7. Ippocampi digeriti vengono risciacquati in BSS 3x per 5 minuti ciascuno. Vengono poi triturato con una pipetta Pasteur di vetro, e la densità cellulare è determinato utilizzando un emocitometro. I neuroni sono poi seminate ad una densità di 2 x 10 ⁵ cellule ogni 60 mm senza coperchio.
8. Circa 2-4 ore dopo la placcatura, il trasferimento coprioggetto con i neuroni collegati ai piatti contenenti cellule astrogliali, con i neuroni rivolto verso la glia. A DIV3, aggiungere citosina arabinoside alcellule ad una concentrazione finale di 5 mM per fermare glia proliferazione.

3. Calcio Transfezione

1. Supporti Condizione N2.1 sulla glia il giorno prima trasfezione.
2. Il giorno della trasfezione, adottare mezzi N2.1 condizionata fuori della glia e trasferire in un nuovo piatto. Trasferimento coprioggetto con i neuroni nel supporto N2.1 condizionato. Lasciare equilibrare in incubatrice per 10-30 min.
3. Per una serie di provette sterili, combinare 1-4 mg di DNA, 12,5 ml di 2 M CaCl ₂ e H ₂ O sterile per un volume totale di 100 microlitri. Per un secondo gruppo di tubi, aggiungere 100 ml di 2x HBS.
4. Aggiungere ⅛ volume di 2x HBS (12,5 mL) alla volta alla provetta contenente la miscela CaCl ₂ / DNA, vortex per pochi secondi ogni volta. Lasciare le provette a sedere per 15 min.
5. Dopo 15 minuti di incubazione, aggiungere goccia a goccia la miscela di trasfezione per le cellule. Incubare per 1-1,5 ore. Uno strato di precipitati sabbia come dovrebbe essere visibilesotto il microscopio usando un obiettivo 10X.
6. Dopo l'incubazione, lavare vetrini due volte con caldo tampone di lavaggio HBS.
7. Coprioggetti Ritorno a piatti originali con glia, aggiungere acido kynurenic ad una concentrazione finale di 0,5 mm.
8. Neuroni trasfettati possono essere esposte in diretta o trattati per immunocitochimica già a partire dal giorno successivo. I neuroni possono sopravvivere fino a tre settimane dopo la trasfezione.

Risultati

Quando i diversi parametri della trasfezione sono ottimizzati e accuratamente controllati da esperimento per sperimentare, è possibile avere efficienze di trasfezione fino al 50%. Figura 1 mostra un campo di neuroni che sono trasfettate con GFP su DIV4. Il campo contiene un totale di 28 neuroni, tra cui 16 sono state trasfettate. Ciò rappresenta un rendimento di oltre il 50%. Un campione di altri campi sullo stesso vetrino mostra l'efficienza complessiva è di circa il 50% (dati non mostrati). Con...

Discussione

Ci sono diversi parametri chiave che devono essere attentamente controllata per trasfezioni costantemente successo ^10,11. Il parametro più critico per il fosfato di calcio trasfezione è il valore di pH 2x HBS, che nelle nostre mani solito varia tra 7,10-7,15. Si consiglia di fare tre lotti di titoli con valori di pH in 0.05 incrementi per spiegare la differenza tra pH-metri. In alternativa, il kit di transfezione mammiferi Clontech fornisce 2x HBS che produce costantemente buona efficienza. Tenere presente ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09	straight / sharp 8.5 cm
Vannas-Tubinger spring scissors	Fine Science Tools	15008-08	angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-16
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91401-14	blunt / 14.5 cm
Spring scissors	Fine Science Tools	15006-09	angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge
Isoflurane	Webster Veterinary	14043-225-06
Poly-L-lysine	Sigma	P2636
MEM	Sigma	M2279
100 mM Sodium pyruvate	Sigma	S8636
Glucose	Sigma	G8270
10x HBSS	Sigma	H4385
1 M HEPES, pH 7.3	Gibco/Invitrogen	15630-080
GlutaMAX	Gibco/Invitrogen	35050-061
Neurobasal Media	Gibco/Invitrogen	21130-049
B27 Supplement (50x)	Gibco/Invitrogen	17504-044
N2 Supplement	Gibco/Invitrogen	17502-048
Ovalbumin	Sigma	A5503
Penicillin/Streptomycin	Gibco/Invitrogen	15070-063
2.5% Trypsin	Gibco/Invitrogen	15090-046
DNase I	Sigma	DN-25
Cytosine arabinoside	Calbiochem/EMD Millipore	251010
Kynurenic acid	Sigma	K3375