Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen

Zusammenfassung

Calciumphosphat-Präzipitation ist eine bequeme und kostengünstige Methode zur Transfektion von kultivierten Zellen. Mit Optimierung ist es möglich, dieses Verfahren auf Fest transfizierbaren Zellen wie primäre Neuronen verwendet werden. Hier beschreiben wir unsere detaillierten Protokoll für die Calciumphosphat-Transfektion von Neuronen im Hippocampus mit Astroglia-Zellen kokultiviert.

Zusammenfassung

Calciumphosphat-Präzipitation ist eine bequeme und kostengünstige Methode zur Transfektion von kultivierten Zellen. Mit Optimierung ist es möglich, dieses Verfahren auf Fest transfizierbaren Zellen wie primäre Neuronen verwendet werden. Hier beschreiben wir unsere detaillierten Protokoll für die Calciumphosphat-Transfektion von Neuronen im Hippocampus mit Astroglia-Zellen kokultiviert.

Einleitung

Primären Neuronen eine der schwierigsten Zelltypen zu transfizieren, wie sie sind postmitotischen und sind sehr empfindlich gegenüber Mikroumweltveränderungen. Es gibt vier häufigsten verwendeten Arten von Verfahren zur Expression von exogenen Genen und Kurzhaarnadel-RNAs (shRNAs) in diesen Zellen ^ein. Jeder hat seine eigenen Vorteile und Nachteile. Zum Beispiel wird in der Regel auf Elektroporation frisch isolierten Neuronen ² durchgeführt, wie Zellen müssen in Küvetten für die Transfektion übertragen werden. Virus-Infektion kann in der Regel sehr hohen Wirkungsgrad erreichen, ^3, ist aber arbeitsintensiv und riskant für die Betreiber. Viele Lipid-vermittelte Transfektion Reagenzien sind kommerziell erhältlich, mit unterschiedlichem Erfolg in Neuronen und verschiedene Ebenen der Zytotoxizität.

Calciumphosphat-Transfektion eine bequeme und kostengünstige Methode zur Einführung von Fremdgenen in Neuronen. Die Methode wurde zuerst verwendet, um Adenovirus-DNA in Säuger cel vorstellenls von Graham und van der Eb (1973) ^4. Transfektion wurde durch Mischen von Calciumchlorid, die mit rekombinanten DNA in einem Phosphatpuffer durchgeführt. Dies ermöglicht die Bildung von DNA / Calciumphosphat-Präzipitate, die, wenn nach und nach auf eine Monoschicht von Zellen gesunken, sich an die Zelloberfläche werden durch Endozytose aufgenommen und schließlich in den Kern ^5. Dieses Verfahren würde die Expression von Fremdgenen eingeführt in der Zielzelle führen. Typische Wirkungsgrade von Calciumphosphat-Transfektion Bereich zwischen 0,5-5% ^6-8. Bei sorgfältiger Optimierung und konsistente Ausführung des experimentellen Protokolls ist es jedoch möglich, eine Transfektionseffizienz von nahezu 50% erreichen. Hier beschreiben wir unsere detaillierten Protokoll für die Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen, die mit Astroglia-Zellen in einem Sandwich-Format ⁹ kokultiviert werden.

Protokoll

1. Vorbereiten Rat Astrocyte Kultur für konditionierte Medien und Astrocyte-Neuron-Kokulturen.

1. Bereiten Dissektion Puffer (BSS, siehe Tabelle 1 für Rezept) und bei 4 ° C bis zur Verwendung.
2. Anesthetize neonatalen Rattenjungen (P0-P2) mit Isofluran in einem 500 ml-Becherglas.
3. Bei Jungtieren sind unbeweglich, Spray mit 70% Ethanol und enthaupten.
4. Entfernen Sie das Gehirn.
   1. Halten Sie den Kopf fest mit einem Paar von Dumont Nr. 5 Pinzette und einer feinen Schere verwenden, um einen Mittelschnitt durch die Haut und Schädel zu machen.
   2. Expose das Gehirn durch die Reflexion der Schädel an den Seiten, und entfernen Sie das Gehirn in eine Schale mit kaltem BSS.
5. Trennen Sie die Gehirnhälften aus dem Zwischenhirn und Hirnstamm unter einem Binokular. Entfernen Sie vorsichtig alle Hirnhäute durch die Stabilisierung des Gewebes mit einer Pinzette und sanft zog sich die Hirnhaut mit einer anderen Pinzette.
6. Sammeln Sie alle Hemisphären in einem 60 mm-Schale. Mit einer kleinen Schere, zerkleinern Gewebe so fein wie möglich. Übertragen Sie anschließend die zerkleinerten Gewebes auf eine 50 ml konischen Röhrchen.
7. 1,5 ml von 1% DNase und 1,5 ml 2,5% Trypsin und 12 ml BSS (Gesamtvolumen 15 ml) zu Gehirnen. Inkubieren in einem Schüttelwasserbad für 15 min bei 37 ° C. Um eine gute Durchmischung zu gewährleisten, ist das Rohr von Hand alle 5 min verwirbelt.
8. Überstand durch eine 70 um Zellsieb über ein neues 50 ml konischen Röhrchen. 3 ml FBS zu dieser Überstand.
9. Auf die verbleibenden Teile, addieren 13,5 ml BSS und 1,5 ml 2,5% Trypsin und Inkubation im Schüttelwasserbad für weitere 15 min.
10. Die restliche Überstand durch die Zelle Sieb und verbinden sich mit dem Überstand aus Schritt 1.8.
11. Zentrifugieren bei 1000 UpM für 5 min, um die Zellen zu pelletieren.
12. Resuspendieren Pellets in 5 ml Gliazellen Medien. Der Überstand kann wieder zentrifugiert werden, um die restlichen Zellen zu pelletieren.
13. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
14. Teller cells in einer Dichte von 1 x 10 ⁷ pro 150 cm ^2-Kolben.
15. Ändern Sie Medien an die frische Gliazellen Medien am Tag nach der Beschichtung. Danach ernähren Zellen zweimal eine Woche mit Glia-Medien.
16. Wenn Zellen> 80% Konfluenz (ca. 10 Tage nach der Beschichtung) erreicht, Gefrierzellen in 90% Pferdeserum und 10% DMSO und halten Aktien in flüssigem Stickstoff. Die Zellen werden mit 2 x 10 ⁶ pro Fläschchen eingefroren. Etwa 5 Fläschchen können aus jedem Kolben eingefroren werden.
17. Über 10-14 Tage vor der Einrichtung des Hippocampus-Kultur werden Gliazellen aus den gefrorenen Aktien plattiert. Wir Platte in der Regel fünf 6-Well-Platten, das ist genug, um das Wachstum von 90 Deckgläser von Hippocampus-Neuronen (drei 15 mm runden Deckgläsern pro Well) zu unterstützen. Wir Platte auch eine zusätzliche acht bis zehn 60-mm-Schalen von Gliazellen, die für Anlage N2.1 Medien für die Transfektion verwendet wird. Am Tag vor der neuronalen Kultur, sollten die Zellen mit NB27 Medien zugeführt werden. Die Astrozyten sollte idealerweise> 90% konfluent sein thist der Punkt. Wir finden, dass das Einfrieren stark verringert die Anzahl der Mikrogliazellen in der Astroglia-Kulturen. Da erhöhte Neurotoxizität beobachtet wird, wenn in den Mikroglia Astroglia Kulturen vorhanden ist, verwenden wir immer Astroglia-Kultur aus gefrorenen Beständen, für Co-Kultur mit den Neuronen hergestellt.

2. Neuronale Kultur

1. Saubere Glas-Deckgläser von ersten Spülen in Milli-Q-Wasser 2x. Sie werden dann in konzentrierte Salpetersäure für 24 Stunden mindestens fünfmal insgesamt 2 h eingeweicht und mit Milli-Q-Wasser gespült. Die Deckgläser werden durch Backen in einem Ofen bei 225 ° C für 6 Stunden getrocknet und sterilisiert.
2. Überdeckgläser bis 60 mm Schalen nach der Sterilisation. Platzieren vier Punkte sterilem Paraffin nahe der Außenkante jedes Deckglas zu halten Neuronen Gliazellen trennen während Kokultur.
3. Deckmantel mit 1 mg / ml Poly-L-Lysin in 0,1 M Borat-Puffer über Nacht bei 37 ° C Inkubator.
4. Am nächsten Tag, spülen Deckgläser zweimal in sterilem milliQ Wasser für jeweils mindestens 15 min. Sie werden dann über Nacht in Plattenmedien in 37 ° C-Inkubator inkubiert.
5. Euthanize schwangere Ratte (E18) von Isofluran-Narkose, gefolgt von Pneumothorax und einschläfern embryonalen Ratten durch Enthauptung. Gehirn entfernen und zerlegen sich die Hirnhälften wie oben beschrieben.
6. Präparieren Sie die hippocampi von der Großhirnhemisphäre. Zeigen alle Hippocampus in eine 15 ml konischen Röhrchen und Verdau mit 0,25% Trypsin (0,5 ml 2,5% Trypsin, 4,5 ml BSS) bei 37 ℃ für 15 min.
7. Aufgeschlossene hippocampi in BSS 3x für jeweils 5 Minuten gespült. Sie werden dann mit einer Glaspasteurpipette zerrieben, und die Zelldichte wird unter Verwendung einer Zählkammer bestimmt. Neuronen werden dann in einer Dichte von 2 x 10 ⁵ Zellen pro 60 mm-Schale ausgesät.
8. Etwa 2-4 Stunden nach der Beschichtung, Transferdeckgläser mit ange Neuronen zu den Schalen, die Astroglia-Zellen mit Nervenzellen in Richtung der Glia nach unten. Bei DIV3, fügen Cytosinarabinosid dieZellen in einer Endkonzentration von 5 &mgr; M bis Glia-Proliferation zu stoppen.

3. Calcium Transfektion

1. Zustand N2.1 Medien auf Glia der Tag vor der Transfektion.
2. Am Tag der Transfektion nehmen Anlage N2.1 Medien aus der Glia und übertragen in eine neue Schüssel. Überdeckgläser mit den Neuronen in der konditionierten Medien N2.1. Lassen Sie ins Gleichgewicht im Inkubator für 10-30 min.
3. Einem Satz von sterilen Röhrchen verbinden 1-4 ug DNA, 12,5 &mgr; l 2 M CaCl ₂ und sterilem H ₂ O für ein Gesamtvolumen von 100 ul. Einem zweiten Satz von Rohren, mit 100 ul 2x HBS.
4. Hinzufügen ⅛ Volumen 2 × HBS (12,5 ul) zu einem Zeitpunkt zu dem Röhrchen mit dem CaCl ₂ / DNA-Mischung, Vortexen für ein paar Sekunden jedesmal. Ermöglichen, dass die Rohre für 15 min stehen.
5. Nach 15 min Inkubation, fügen Sie die Transfektion Mischung tropfenweise zu den Zellen. Inkubieren 1-1,5 Stunden. Eine Schicht aus einem sandartigen Ausfällungen sichtbar sein sollunter dem Mikroskop mit einem 10X-Objektiv.
6. Nach Inkubation spülen Deckgläser zweimal mit warmem HBS Waschpuffer.
7. Zurück zur ursprünglichen Deckschalen mit Glia, fügen Kynurensäure zu einer endgültigen Konzentration von 0,5 mM.
8. Transfizierten Neuronen können live abgebildet oder Immunzytochemie schon am nächsten Tag verarbeitet werden. Neuronen können bis zu drei Wochen nach der Transfektion überleben.

Ergebnisse

Wenn die verschiedenen Parameter der Transfektion optimiert und sorgfältig von Experiment zu Experiment gesteuert, ist es möglich, Transfektionseffizienzen von bis zu 50% zu erhalten. Fig. 1 zeigt ein Feld von Neuronen, die mit GFP auf DIV4 transfiziert sind. Das Feld enthält insgesamt 28 Neuronen, von denen 16 wurden transfiziert. Dies entspricht einem Wirkungsgrad von über 50%. Eine Probenahme von anderen Bereichen auf dem gleichen Deck zeigt den Gesamtwirkungsgrad liegt bei 50% (Daten nicht gezei...

Diskussion

Es gibt mehrere wichtige Parameter, die sorgfältig für konsequent erfolgreiche Transfektionen ^10,11 kontrolliert werden müssen. Der kritischste Parameter zur Calciumphosphat-Transfektion ist der pH-Wert von 2 x HBS, die in unseren Händen variiert üblicherweise zwischen 7,10 bis 7,15. Es wird empfohlen, drei Chargen von Titeln mit pH-Werten in 0,05-Schritten, um die Differenz zwischen den pH-Meter ausmachen. Alternativ stellt die Clontech Säugetier Transfektion Kit 2x HBS, die durchweg guten Wirkungsgrad...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09	straight / sharp 8.5 cm
Vannas-Tubinger spring scissors	Fine Science Tools	15008-08	angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-16
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91401-14	blunt / 14.5 cm
Spring scissors	Fine Science Tools	15006-09	angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge
Isoflurane	Webster Veterinary	14043-225-06
Poly-L-lysine	Sigma	P2636
MEM	Sigma	M2279
100 mM Sodium pyruvate	Sigma	S8636
Glucose	Sigma	G8270
10x HBSS	Sigma	H4385
1 M HEPES, pH 7.3	Gibco/Invitrogen	15630-080
GlutaMAX	Gibco/Invitrogen	35050-061
Neurobasal Media	Gibco/Invitrogen	21130-049
B27 Supplement (50x)	Gibco/Invitrogen	17504-044
N2 Supplement	Gibco/Invitrogen	17502-048
Ovalbumin	Sigma	A5503
Penicillin/Streptomycin	Gibco/Invitrogen	15070-063
2.5% Trypsin	Gibco/Invitrogen	15090-046
DNase I	Sigma	DN-25
Cytosine arabinoside	Calbiochem/EMD Millipore	251010
Kynurenic acid	Sigma	K3375