Primer hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu

Özet

Kalsiyum fosfat çökeltme kültürlenmiş hücrelerin transfeksiyonu için uygun ve ekonomik bir yöntemdir. Optimizasyonu ile, primer nöronlar gibi sert-transfect hücreleri üzerinde bu yöntemi kullanmak mümkündür. Burada astroglial hücreleri ile kültürlenmiş hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu için, detaylı bir protokol açıklar.

Özet

Kalsiyum fosfat çökeltme kültürlenmiş hücrelerin transfeksiyonu için uygun ve ekonomik bir yöntemdir. Optimizasyonu ile, primer nöronlar gibi sert-transfect hücreleri üzerinde bu yöntemi kullanmak mümkündür. Burada astroglial hücreleri ile kültürlenmiş hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu için, detaylı bir protokol açıklar.

Giriş

Birincil nöronlar postmitotic ve mikro çevre değişikliklerine karşı çok hassas olarak transfekte etmek zor hücre türlerinden biridir. Bu hücrelerde ¹ ekzojen genlerin ve kısa saç tokası RNA (shRNAs) ekspresyonu için yöntemler yaygın olarak kullanılan dört tipi vardır. Her biri kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır. Transfeksiyon için hücreler, küvetler içine transfer edilmelidir Örneğin, elektroporasyon, genellikle taze olarak izole edilen nöronlar ² üzerinde gerçekleştirilir. Virüs enfeksiyonu genellikle çok yüksek verim ³ ulaşmak, ancak daha fazla emek-yoğun operatörler için ve riskli olabilir. Birçok lipid-aracılı transfeksiyon reaktifleri nöronlar ve sitotoksisite farklı düzeylerde başarı değişen derecelerde, ticari olarak temin edilebilir.

Kalsiyum fosfat transfeksiyonu, nöronlar içinde yabancı genlerin sokulması için uygun ve ekonomik bir yöntemi temsil eder. Yöntem, ilk memeli hücre içine adenovirüs DNA'nın katılması için kullanılmıştırGraham ve Van Der Eb (1973) tarafından ls ^4. Transfeksiyon, bir fosfat tampon maddesi içinde rekombinant DNA ile kalsiyum klorür karıştırılarak gerçekleştirilmiştir. Bu, yavaş yavaş hücrelerin bir mono-tabakası üzerinde ayrıştırılarak DNA / kalsiyum fosfat oluşumu, hücre yüzeyine bağlı, endositoz ile içeri alınır ve son olarak da çekirdek ⁵ girmektedir, ki çökelir sağlar. Bu işlem, hedef hücre içine yabancı genlerin ekspresyonuna sebep olur. 0.5-5% ^6-8 arasında, kalsiyum fosfat transfeksiyonu aralık tipik verimleri. Bununla birlikte, dikkatli bir optimizasyon ve deneysel protokol sürekli uygulama ile, hemen hemen% 50 bir transfeksiyon verimine ulaşmak mümkündür. Burada bir sandviç biçiminde ⁹ astroglial hücreleri ile kültürlenmiş primer hipokampal nöronlar, kalsiyum fosfat transfeksiyonu için, detaylı bir protokol açıklar.

Protokol

1.. Koúullanmıú Medya ve Astrosit-nöron cocultures Rat Astrosit Kültür hazırlanıyor.

1. (BSS tarifi için bakınız Tablo 1) diseksiyonu tampon hazırlayın ve 4 ° C'de mağaza kullanıma hazır olana kadar.
2. 500 ml beher izofluran ile yenidoğan sıçan yavrular (P0-P2) anestezisi.
3. Yavrular hareketsiz olduğunda,% 70 etanol ile sprey ve başını kesmek.
4. Beyin kaldırmak.
   1. Dumont # 5 forseps bir çift ile sıkıca kafa tutun, ve deri ve kafatası yoluyla bir orta hat kesi yapmak için ince makas kullanın.
   2. Yanlara kafatası yansıtarak beyin Açığa ve soğuk BSS içeren bir çanak içine beyin kaldırmak.
5. Diseksiyon kapsamında diensefalon ve beyin sapından hemisferdeki ayırın. Dikkatle forseps bir çift doku stabilize ve yavaşça forseps başka bir çift ile meninks uzağa çekerek tüm meninksler kaldırmak.
6. Tüm hemisferlerdir toplayın in bir 60 mm çanak. Küçük bir makas, kıyma doku gibi ince mümkün olduğunca kullanma. Daha sonra, 50 ml konik tüp kıyılmış doku aktarın.
7. 1,5 1% DNase I'in ml ve 1.5 ml% 2.5 tripsin ve beyin BSS (15 ml toplam hacim) 12 ml ilave edilir. 37 ° C'de 15 dakika boyunca çalkalanan bir su banyosu içinde inkübe Iyi karışmasını sağlamak için, tüp elle her 5 dakikada girdaplanır.
8. Yeni bir 50 ml konik tüp üzerinde 70 mikron hücre süzgecinden süpernatant aktarın. Bu yüzer 3 ml FBS ekleyin.
9. Kalan parçalar için, BSS 13.5 ml ve 1.5 ml% 2.5 tripsin ekleyin ve 15 dakika boyunca çalkalama su banyosu içinde inkübe edilir.
10. Hücre süzgecinden kalan süpernatan aktarın ve Aşama 1.8 'den süpernatan ile birleştirir.
11. Pelet hücreleri 5 dakika boyunca 1000 rpm'de santrifüj.
12. Glial ortam 5 ml içinde süspanse peletler. Üst faz, geri kalan hücreler pellet haline getirmek için tekrar santrifüj edilebilir.
13. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
14. Plaka cel1 x 10 ⁷ cm başına 150 ² şişesi yoğunluğunda ls.
15. Gün sonra kaplama taze glial medya medya değiştirin. Daha sonra, glial ortamı ile iki kez bir hafta hücreleri besleme.
16. Hücreler>% 80 ortak akışkanlığa (yaklaşık 10 gün sonra kaplama) ulaştığı zaman,% 90 at serumu ve% 10 DMSO içinde hücrelerini dondurma ve sıvı azot içinde stok tutmak. Hücreler 2 flakon başına x 10 ⁶ dondurulur. Yaklaşık olarak 5 şişeler her şişeden dondurulabilir.
17. Yaklaşık 10-14 gün hipokampal kültürünü kurmadan önce, glial hücreler dondurulmuş stoklardan kaplanmıştır. Biz genellikle hipokampalinden 90 lamelleri (kuyu başına üç 15 mm yuvarlak lamelleri) büyümesini destekleyecek kadar beş 6-iyi plakaları, plaka. Ayrıca, transfeksiyon için klima N2.1 ortamı için kullanılır glial hücreler ek bir sekiz ila on 60 mm yemekler, plaka. Bir gün önce kültür nöronal hücreler, NB27 ortam ile beslenmelidir. Astrocytes ideal th de>% 90 birleşen olmalıdırnoktasıdır. Bu büyük ölçüde dondurma astroglial kültürlerde mikroglia sayısını azaltır bulabilirsiniz. Mikroglia Astroglial kültürlerde mevcut olduğunda artan nörotoksisite görülmektedir yana, biz her zaman nöronlar ile kokültür için dondurulmuş stokları hazırlanan Astroglial kültür kullanın.

2. Nöron Kültürü

1. MilliQ su 2x ilk durulayarak temizleyin cam lamelleri. Daha sonra, 2 saatlik bir toplam değerin en az beş kez 24 saat için konsantre nitrik asit ile ıslatılmış ve milliQ su ile durulanır. Lameller, 6 saat boyunca 225 ° C'de bir fırın içinde pişirme ile kurutuldu ve sterilize edilir.
2. Transferi sterilizasyonu sonrasında 60 mm yemekleri lamelleri. Nöronlar kokültür sırasında glial hücrelerden ayrı tutmak için her lamel dış kenarına yakın steril parafin dört nokta yerleştirin.
3. 37 ° C inkübatör içinde bir gece boyunca 0.1 M borat tamponu / ml poli-L-lisin, 1 mg ile kaplayın lamelleri.
4. Ertesi gün, iki kez steril m lamelleri durulamaen az 15 dakika her biri için illiQ su. Daha sonra 37 ° C kuluçka makinesi içinde kaplama ortam içinde gece boyunca inkübe edilir.
5. Pnömotoraks ardından izofluran anestezi ile gebe sıçan (E18) Euthanize ve başı kesilerek embriyonik sıçan euthanize. Beyin çıkarın ve yukarıda tarif edildiği gibi serebral hemisfer teşrih.
6. Serebral yarımkürede hippocampi parçalara ayır. 15 ml konik bir tüp içine tüm hipokampları yerleştirin ve 15 dakika için 37 ℃ da% 0.25 tripsin (0.5 ml% 2.5 tripsin, 4.5 ml BSS) ile sindirmek.
7. Sindirilen hipokampi 5 dakika her biri için BSS 3x durulanır. Daha sonra, bir cam Pasteur pipeti ile tritüre edilir ve hücre yoğunluğu, bir hemositometre kullanılarak belirlenir. Nöronlar, daha sonra 60 mm tabak başına 2 x 10 ⁵ hücre yoğunluğunda tohumlanır.
8. Yaklaşık 2-4 saat sonra kaplama, transfer nöronlar glia doğru aşağı bakacak şekilde, Astroglial hücreleri içeren yemekleri bağlı nöronlar ile lamelleri. DIV3 anda, için sitozin arabinosid ekle5 uM bir nihai konsantrasyonda hücre glia çoğalmasını durdurmak.

3. Kalsiyum Transfection

1. Gliadaki transfeksiyondan önce günde Durumu N2.1 medya.
2. Transfeksiyon gününde, glia kapalı durumunu N2.1 ortamı almak ve yeni bir çanak içine aktarın. Transferi klimalı N2.1 medya içine nöronlar ile lamelleri. 10-30 dakika boyunca kuluçka makinesi içinde dengeye olsun.
3. Steril tüplere bir set için, 1-4 ug DNA, 100 ul toplam hacim için 2 M _CaCI2 12.5 ul, ve steril _H2O birleştirir. Tüpler bir ikinci dizi için, 2 x 100 ul HBS ekleyin.
4. Bir kaç saniye için her girdap, _CaCl2 / DNA karışımını ihtiva eden bir tüp, bir seferde 2x HBS'de ⅛ hacmi (12.5 ul) ilave edin. Tüpler 15 dakika boyunca bekletin.
5. 15 dakika inkübasyondan sonra, hücrelere transfeksiyon karışımı damla damla ilave edildi. 1-1.5 saat boyunca inkübe edin. Kum gibi çökeltilerin tabakası görünür olmalıdır10X objektif kullanılarak mikroskop altında.
6. İnkübasyondan sonra, sıcak HBS yıkama tamponu ile iki defa lamelleri yıkayın.
7. , Glia orijinal yemeklere lamelleri Dönüş 0.5 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar Kynurenic asit ekleyin.
8. Transfekte nöronların canlı görüntüsü ya da erken ertesi gün olarak İmmünositokimya için işlenebilir. Nöronlar transfeksiyonundan sonra üç hafta kadar yaşayabilir.

Sonuçlar

Transfeksiyon, farklı parametreler optimize edilmiş ve dikkatli bir deney için deney kumanda edilir, bu% 50'ye kadar bir transfeksiyon verimi elde etmek mümkündür. 1 Div4 üzerine GFP ile transfekte edilir nöronların bir alanı göstermektedir. Bu alan 16 transfekte edilmiştir, bunlar arasında 28 nöron, bir toplam içerir. Bu% 50'in üzerinde bir verimlilik gösterir. Aynı lamel başka alanların bir örnekleme genel verimlilik (veriler gösterilmemiştir), yaklaşı...

Tartışmalar

Dikkatle sürekli başarılı transfections ^10,11 için kontrol edilmesi gereken birkaç önemli parametre vardır. Kalsiyum fosfat transfeksiyonu için en önemli parametre bizim elimizde genellikle 7,10-7,15 arasında değişmektedir 2x HBS, pH değeridir. Biz pH metre arasındaki farkı açıklamak için 0.05 artışlarla pH değerleri ile hisse senetleri üç toplu yapmanızı öneririz. Seçenek olarak ise, Clontech memeli transfeksiyon kiti sürekli iyi bir verim elde edilir 2x HBS sağlar. Dondurucuda ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09	straight / sharp 8.5 cm
Vannas-Tubinger spring scissors	Fine Science Tools	15008-08	angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-16
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91401-14	blunt / 14.5 cm
Spring scissors	Fine Science Tools	15006-09	angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge
Isoflurane	Webster Veterinary	14043-225-06
Poly-L-lysine	Sigma	P2636
MEM	Sigma	M2279
100 mM Sodium pyruvate	Sigma	S8636
Glucose	Sigma	G8270
10x HBSS	Sigma	H4385
1 M HEPES, pH 7.3	Gibco/Invitrogen	15630-080
GlutaMAX	Gibco/Invitrogen	35050-061
Neurobasal Media	Gibco/Invitrogen	21130-049
B27 Supplement (50x)	Gibco/Invitrogen	17504-044
N2 Supplement	Gibco/Invitrogen	17502-048
Ovalbumin	Sigma	A5503
Penicillin/Streptomycin	Gibco/Invitrogen	15070-063
2.5% Trypsin	Gibco/Invitrogen	15090-046
DNase I	Sigma	DN-25
Cytosine arabinoside	Calbiochem/EMD Millipore	251010
Kynurenic acid	Sigma	K3375