Фосфат кальция Трансфекцию первичной нейронов гиппокампа

Резюме

Фосфат кальция осадков удобный и экономичный способ для трансфекции культивируемых клеток. С оптимизации, можно использовать этот метод на труднодоступных трансфекции клеток, как первичных нейронов. Здесь мы опишем наш подробный протокол для кальций-фосфатного трансфекции нейронов гиппокампа совместно культивировали с астроглиальных клеток.

Аннотация

Фосфат кальция осадков удобный и экономичный способ для трансфекции культивируемых клеток. При оптимизации, можно использовать этот метод на труднодоступных трансфекции клеток, как первичных нейронов. Здесь мы опишем наш подробный протокол для кальций-фосфатного трансфекции нейронов гиппокампа совместно культивировали с астроглиальных клеток.

Введение

Первичные нейроны являются одним из самых сложных типов клеток для трансфекции, как они постмитотическими и очень чувствительны к микро-экологических изменений. Есть четыре наиболее часто используемые типы из методов экспрессии экзогенных генов и короткого шпильки РНК (shRNAs) в этих клетках ^1. Каждый имеет свои преимущества и недостатки. Например, электропорацию обычно выполняется на свежеизолированных нейронов ^2, как клетки должны быть переданы в кюветы для трансфекции. Вирус инфекция, как правило, добиться очень высокой эффективности ^3, но более трудоемким и рискованным для операторов. Многие липидов-опосредованной трансфекции реагенты коммерчески доступны, с разной степенью успеха в нейронах и на разных уровнях цитотоксичности.

Фосфат кальция трансфекции представляет собой удобный и экономичный способ введения чужеродных генов в нейронах. Этот метод был впервые использован ввести аденовируса ДНК в чел млекопитающихлс по Грэм и Ван Дер Eb (1973) ^4. Трансфекцию проводили путем смешивания хлорида кальция с рекомбинантной ДНК в фосфатном буфере. Это позволяет формирование фосфат ДНК / кальция выпадает в осадок, который при постепенно падает на монослой клеток, прилипают к поверхности клетки, принимаются к эндоцитоза и, наконец, проникает в ядро ^5. Этот процесс приведет к экспрессии чужеродных генов, введенных в клетки-мишени. Типичные КПД фосфата кальция диапазоне трансфекции между 0,5-5% ^6-8. Тем не менее, с тщательной оптимизации и последовательного выполнения экспериментального протокола, можно достичь эффективности трансфекции почти на 50%. Здесь мы опишем наш подробный протокол для кальций-фосфатного трансфекции первичных нейронов гиппокампа, которые совместно культивировали с астроглиальных клеток в сэндвич формате ^9.

протокол

1. Подготовка Rat астроцитов культуры для кондиционированной среды и астроцитов нейронов совместных культурах.

1. Приготовить рассечение буфера (BSS, см. таблицу 1 для рецепта) и хранить при температуре 4 ° С до готовности к использованию.
2. Обезболить новорожденных крысят (P0-P2) изофлураном в стакан емкостью 500 мл.
3. Когда щенки неподвижны, спрей с 70% этанола и обезглавить.
4. Снимите мозг.
   1. Держите голову твердо с парой Дюмон # 5 щипцами, и использовать тонких ножниц сделать срединный разрез через кожу и черепа.
   2. Expose мозг, отражая череп в стороны, и удалить мозг в блюдо с холодной BSS.
5. Отделите полушария от промежуточного мозга и ствола мозга при вскрытии рамки. Осторожно снимите все мозговые оболочки путем стабилизации ткани с одной парой щипцов и аккуратно отстраняясь мозговых оболочек с другой парой щипцов.
6. Соберите все полушария ян один 60 мм блюдо. Использование маленькие ножницы, фарш ткани как мелко, насколько это возможно. Затем трансфер фарш ткани на 50 мл коническую трубку.
7. Добавить 1,5 мл 1% ДНКазы I и 1,5 мл 2,5% трипсина и 12 мл BSS (общий объем 15 мл) в мозгах. Выдержите в встряхивании на водяной бане в течение 15 мин при 37 ° С Чтобы обеспечить хорошее перемешивание, трубка вращают рукой каждые 5 мин.
8. Передача супернатант через 70 мкм ячейки фильтра над новым 50 мл коническую трубку. Добавьте 3 мл FBS к этому супернатанта.
9. Для остальных частей, добавить 13,5 мл ПБС и 1,5 мл 2,5% трипсина и инкубировали в водяной бане встряхивания в течение еще 15 мин.
10. Передача оставшегося супернатанта через клеточный фильтр и в сочетании с надосадочной жидкости со стадии 1.8.
11. Центрифуге при 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут для осаждения клеток.
12. Ресуспендируют гранулы в 5 мл глиальных информации. Супернатант может быть снова центрифугируют для осаждения остальные клетки.
13. Граф клеток с помощью гемоцитометра.
14. Тарелка челлс при плотности 1 х 10 ⁷ на 150 см ² колбы.
15. Изменение средств массовой информации для свежих глиальных СМИ на следующий день после посева. Впоследствии, кормить клетки два раза в неделю с глиальных СМИ.
16. Когда клетки достигли> 80% слияния (примерно 10 дней после посева), замораживание клеток вниз в 90% лошадиной сыворотки и 10% ДМСО и держать запасы в жидком азоте. Клетки замораживают при 2 х 10 ⁶ на флакон. Примерно 5 флаконов могут быть заморожены из каждой колбы.
17. О 10-14 дней перед настройкой гиппокампа культуры, глиальные клетки высевают из замороженных запасов. Мы обычно пластины пять 6-луночных, что достаточно, чтобы поддерживать рост 90 покровные нейронов гиппокампа (три 15 мм круглые покровные на лунку). Мы также пластины дополнительно от восьми до десяти 60 мм блюда глиальных клеток, который используется для кондиционирования N2.1 средств массовой информации для трансфекции. Накануне нейронов культуры, клетки должны быть поданы с NB27 СМИ. Астроциты в идеале должно быть> 90% сливной в гоявляется точка. Мы считаем, что значительно замораживание уменьшает количество микроглии в астроглиальных культур. Поскольку увеличивается нейротоксичность наблюдается при микроглии присутствует в астроглиальных культур, мы всегда используем астроглиальную культуру, приготовленный из замороженных запасов для совместного культивирования с нейронами.

2. Нейронов Культура

1. Чистые покровные стекла по первой промывки в MilliQ воды 2x. Они затем замачивают в концентрированной азотной кислоте в течение 24 часов, и промывают MilliQ водой в течение не менее пяти раз в течение в общей сложности 2 часа. Покровные стекла высушивают и стерилизуют путем выпечки в печи при 225 ° С в течение 6 часов.
2. Передача покровные до 60 мм блюд после стерилизации. Поместите четыре точки стерильного парафина вблизи внешней кромки каждого покровного стекла, чтобы сохранить нейроны отдельно от глиальных клеток в течение сокультивирования.
3. Coat покровные с 1 мг / мл поли-L-лизина в 0,1 М боратного буфера в течение ночи в 37 ° C инкубаторе.
4. На следующий день, промыть покровные дважды в стерильной мilliQ воды не менее 15 минут каждый. Затем они инкубировали в течение ночи в металлизации СМИ в 37 ° С инкубатор.
5. Усыпить беременную крысу (E18) на изофлурановой анестезии, после чего пневмоторакса и эвтаназии эмбрионов крыс путем обезглавливания. Удалить мозги и рассекать из полушарий, как описано выше.
6. Рассеките из гиппокампа от полушария головного мозга. Поместите все гиппокампе в 15 мл коническую пробирку и переварить с 0,25% трипсина (0,5 мл 2,5% трипсин, 4,5 мл ПБС) при 37 ℃ в течение 15 мин.
7. Переваривается гиппокамп промыть в BSS 3x в течение 5 минут каждый. Они затем растирали со стеклянной пипетки Пастера и плотность клеток определяется с помощью гемоцитометра. Нейроны затем высевали при плотности 2 × 10 ⁵ клеток на 60 мм чашку.
8. О 2-4 ч после посева, передача покровные с прикрепленными нейронов на блюдах, содержащих астроглиальных клеток, с нейроны вниз к глии. В DIV3, добавить цитозинарабинозид кклетки в конечной концентрации 5 мкМ, чтобы остановить глии пролиферацию.

3. Кальций Трансфекцию

1. Состояние N2.1 СМИ на глии день до трансфекции.
2. В день трансфекции взять условный N2.1 СМИ прочь глии и передачи в новое блюдо. Передача покровные с нейронами в кондиционированной N2.1 СМИ. Пусть равновесие в инкубаторе в течение 10-30 мин.
3. Для одного набора стерильные пробирки, объединить 1-4 мкг ДНК, 12,5 мкл 2 М CaCl _2, и стерильной H ₂ O при общем объеме 100 мкл. Для второго набора труб, добавьте 100 мкл 2х HBS.
4. Добавить ⅛ объем 2x HBS (12,5 мкл) в то время, в пробирку, содержащую смесь CaCl ₂ / ДНК, встряхиванием в течение нескольких секунд каждый раз. Разрешить трубы, чтобы сидеть в течение 15 мин.
5. После 15 мин инкубации, добавить по каплям смесь трансфекции в клетки. Выдержите в течение 1-1,5 часов. Слой песка, как выделений должна быть виднапод микроскопом с использованием объектива 10х.
6. После инкубации промыть покровные дважды теплой HBS промывочного буфера.
7. Возврат к покровные оригинальных блюд с глии, добавьте кинуреновой кислоту до конечной концентрации 0,5 мМ.
8. Трансфицированные нейроны могут быть отображены в прямом эфире или обработанные для иммуноцитохимии уже в течение следующего дня. Нейроны могут выживать до трех недель после трансфекции.

Результаты

Когда различные параметры трансфекции оптимизированы и тщательно контролировать от эксперимента к эксперименту, можно получить эффективность трансфекции до 50%. Фиг.1 показывает поле нейронов, которые трансфицированных GFP на DIV4. Поле содержит в общей сложности 28 нейронов, сре?...

Обсуждение

Есть несколько ключевых параметров, которые должны быть тщательно контролируется для последовательно успешных трансфекций ^10,11. Наиболее важным параметром для фосфата кальция трансфекции является значение рН 2х HBS, которые в наших руках, как правило, колеблется в пределах 7,10-7,15. М...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09	straight / sharp 8.5 cm
Vannas-Tubinger spring scissors	Fine Science Tools	15008-08	angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-16
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91401-14	blunt / 14.5 cm
Spring scissors	Fine Science Tools	15006-09	angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge
Isoflurane	Webster Veterinary	14043-225-06
Poly-L-lysine	Sigma	P2636
MEM	Sigma	M2279
100 mM Sodium pyruvate	Sigma	S8636
Glucose	Sigma	G8270
10x HBSS	Sigma	H4385
1 M HEPES, pH 7.3	Gibco/Invitrogen	15630-080
GlutaMAX	Gibco/Invitrogen	35050-061
Neurobasal Media	Gibco/Invitrogen	21130-049
B27 Supplement (50x)	Gibco/Invitrogen	17504-044
N2 Supplement	Gibco/Invitrogen	17502-048
Ovalbumin	Sigma	A5503
Penicillin/Streptomycin	Gibco/Invitrogen	15070-063
2.5% Trypsin	Gibco/Invitrogen	15090-046
DNase I	Sigma	DN-25
Cytosine arabinoside	Calbiochem/EMD Millipore	251010
Kynurenic acid	Sigma	K3375