Phosphate de calcium transfection de primaire neurones de l'hippocampe

Résumé

précipitation au phosphate de calcium est une méthode pratique et économique pour la transfection de cellules en culture. Avec l'optimisation, il est possible d'utiliser cette méthode sur des cellules difficiles à transfecter comme les neurones primaires. Ici, nous décrivons notre protocole détaillé pour le phosphate de calcium transfection de neurones de l'hippocampe co-cultivés avec des cellules astrocytes.

Résumé

précipitation au phosphate de calcium est une méthode pratique et économique pour la transfection de cellules en culture. Avec l'optimisation, il est possible d'utiliser cette méthode sur des cellules difficiles à transfecter comme les neurones primaires. Ici, nous décrivons notre protocole détaillé pour le phosphate de calcium transfection de neurones de l'hippocampe co-cultivés avec des cellules astrocytes.

Introduction

Neurones primaires sont l'un des types cellulaires les plus difficiles à transfecter car ils sont post-mitotiques et sont très sensibles aux changements des micro-environnement. Il existe quatre types de méthodes pour l'expression de gènes exogènes et ARN court en épingle à cheveux (shRNA) dans ces cellules ^une couramment utilisés. Chacun a ses propres avantages et inconvénients. Par exemple, l'électroporation est généralement effectuée sur les neurones fraîchement isolés ^2, les cellules doivent être transférés dans des cuvettes pour la transfection. infection par le virus peut généralement atteindre un rendement très élevé ^3, mais il est plus de main-d'œuvre et risqué pour les opérateurs. Beaucoup de réactifs de transfection médiée par un lipide sont disponibles dans le commerce, avec des degrés variables de succès dans les neurones et les différents niveaux de cytotoxicité.

la transfection au phosphate de calcium représente une méthode pratique et économique pour l'introduction de gènes étrangers dans les neurones. La méthode a été utilisée pour la première à introduire de l'ADN de l'adénovirus dans cel mammifèresls par Graham et Van Der Eb (1973) ^4. La transfection a été réalisée en mélangeant du chlorure de calcium avec de l'ADN recombinant dans un tampon de phosphate. Ceci permet la formation de phosphate de l'ADN / de calcium précipite, qui, en cas de chute progressivement sur ​​une monocouche de cellules, d'adhérer à la surface de la cellule, sont repris par endocytose et finalement pénétrer dans le noyau ^5. Ce processus conduirait à l'expression de gènes étrangers introduits dans la cellule cible. Efficacité typiques de calcium gamme de transfection de phosphate entre 0,5-5% ^6-8. Cependant, avec une optimisation soigneuse et constante de l'exécution du protocole expérimental, il est possible d'atteindre une efficacité de transfection de près de 50%. Nous décrivons ici notre protocole détaillé pour la transfection au phosphate de calcium de neurones hippocampiques primaires, qui sont co-cultivées avec des cellules astrogliales dans un format en sandwich ^9.

Protocole

Une. Préparation Rat Astrocyte Culture pour les milieux conditionnés et astrocyte-neurone co-cultures.

1. Préparer dissection tampon (BSS, voir le tableau 1 pour la recette) et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
2. Anesthésier les ratons nouveau-nés (P0-P2) avec de l'isoflurane dans un bécher de 500 ml.
3. Lorsque les chiots sont immobiles, pulvériser avec 70% d'éthanol et décapiter.
4. Retirez le cerveau.
   1. Tenez fermement la tête avec une paire de Dumont # 5 forceps, et utiliser des ciseaux fins de faire une incision médiane à travers la peau et le crâne.
   2. Exposer le cerveau en réfléchissant le crâne sur les côtés, et retirer le cerveau dans un plat contenant BSS froid.
5. Séparer les hémisphères cérébraux du diencéphale et le tronc cérébral sous un microscope à dissection. Retirez soigneusement toutes les méninges en stabilisant le tissu avec une paire de pinces et en tirant doucement les méninges avec une autre paire de pinces.
6. Recueillir tous les hémisphères in une boîte de 60 mm. L'utilisation de petits ciseaux, tissu mince aussi finement que possible. Puis transférer le tissu haché dans un tube conique de 50 ml.
7. Ajouter 1,5 ml de 1% DNase I et 1,5 ml de 2,5% de trypsine et 12 ml de BSS (volume total de 15 ml) de cerveau. Incuber dans un bain d'eau agité pendant 15 min à 37 ° C. Pour assurer un bon mélange, le tube est tourbillonné à la main toutes les 5 min.
8. Transférer le surnageant dans une passoire 70 um de cellule sur un nouveau 50 ml tube conique. Ajouter 3 ml de FBS à ce surnageant.
9. Pour les morceaux restants, ajouter 13,5 ml de BSS et 1,5 ml 2,5% de trypsine et incuber au bain-marie en agitant pendant encore 15 minutes.
10. Transférer le surnageant restant à travers le tamis de la cellule et de combiner avec le surnageant de l'étape 1.8.
11. Centrifuger à 1000 rpm pendant 5 min pour sédimenter les cellules.
12. Remettre en suspension les pastilles dans 5 ml de milieu gliales. Le surnageant peut être de nouveau centrifugé pour sédimenter les cellules restantes.
13. Compter les cellules en utilisant un hématimètre.
14. Plaque cells à une densité de 1 x 10 ⁷ par cm ² flacon 150.
15. Changer de support aux médias gliales frais le jour après l'étalement. Ensuite, nourrir les cellules deux fois par semaine avec les médias gliales.
16. Lorsque les cellules ont atteint> 80% de confluence (environ 10 jours après placage), geler les cellules dans 90% de sérum de cheval et 10% de DMSO et maintenir les stocks dans l'azote liquide. Les cellules sont congelées à 2 x 10 ⁶ par flacon. Environ 5 flacons peuvent être congelés dans chaque flacon.
17. Environ 10-14 jours avant la mise en place de la culture de l'hippocampe, les cellules gliales sont étalées dans les stocks surgelés. Nous plaquons habituellement cinq plaques de 6 puits, ce qui est suffisant pour soutenir la croissance de 90 lamelles de neurones de l'hippocampe (trois lamelles couvre 15 mm rondes par puits). Nous plaquons également une huit à dix plats de 60 mm supplémentaires de cellules gliales, qui est utilisé pour le conditionnement de médias N2.1 pour la transfection. La veille de culture neuronale, les cellules doivent être nourris avec les médias NB27. Les astrocytes devraient idéalement être> 90% de confluence à eest le point. Nous constatons que la congélation réduit considérablement le nombre de cellules microgliales dans des cultures astrocytaires. Etant donné que l'augmentation neurotoxicité est observée lorsque la microglie est présent dans les cultures astrocytaires, on utilise toujours la culture astroglial préparé à partir de stocks congelés de co-culture avec les neurones.

2. Neuronale Culture

1. Nettoyer les lamelles de verre de premier rinçage dans milliQ 2x de l'eau. Elles sont ensuite trempées dans de l'acide nitrique concentré pendant 24 heures, et on les rince avec de l'eau milliQ pendant au moins cinq fois au cours d'un total de 2 heures. Lamelles sont séchées et stérilisées par cuisson dans un four à 225 ° C pendant 6 heures.
2. Transfert des lamelles couvre 60 mm plats après la stérilisation. Placer quatre points de paraffine stérile à proximité du bord extérieur de chaque lamelle afin de maintenir séparés des neurones au cours de la co-culture des cellules gliales.
3. Enduire les lamelles de 1 mg / ml de poly-L-lysine dans un tampon borate 0,1 M pendant une nuit à 37 ° C incubateur.
4. Le lendemain, rincez deux fois en lamelles m stérileilliQ eau pendant au moins 15 minutes à chaque fois. Ils sont ensuite incubés pendant la nuit dans les médias de placage à 37 ° C incubateur.
5. Euthanasier rat enceinte (E18) par l'anesthésie isoflurane suivie par un pneumothorax, et euthanasier les rats embryonnaires par décapitation. Retirer le cerveau et disséquer les hémisphères cérébraux, comme décrit ci-dessus.
6. Disséquer l'hippocampe de l'hémisphère cérébral. Placez tous les hippocampes dans un tube conique de 15 ml, et digérer avec 0,25% de trypsine (0,5 ml 2,5% de trypsine, 4,5 ml BSS) à 37 ℃ pendant 15 min.
7. Hippocampes digérés sont rincées dans BSS 3x pendant 5 minutes chacun. Ils sont ensuite triturés avec une pipette Pasteur en verre, et la densité cellulaire est déterminée en utilisant un hématimètre. Les neurones sont ensuite ensemencées à une densité de 2 x 10 ⁵ cellules par boîte de 60 mm.
8. Environ 2-4 heures après le placage, le transfert des lamelles couvre avec les neurones attachés aux plats contenant des cellules astrocytes, avec les neurones vers le bas vers la glie. Au DIV3, ajouter la cytosine arabinoside à lales cellules à une concentration finale de 5 uM pour arrêter la prolifération des cellules gliales.

3. Calcium transfection

1. Médias condition de N2.1 sur la glie le jour avant la transfection.
2. Le jour de la transfection, les représentants des médias de N2.1 conditionné hors de la glie et transférer dans un nouveau plat. Transfert des lamelles couvre avec les neurones dans les médias de N2.1 conditionné. Laissez s'équilibrer dans l'incubateur pour 10-30 min.
3. Pour une série de tubes stériles, combiner 1-4 ug d'ADN, 12,5 ul de 2 M de CaCl _2, et H ₂ O stérile pour un volume total de 100 pl. À un second ensemble de tubes, ajouter 100 ul de HBS 2x.
4. Ajouter le volume ⅛ de HBS 2x (12,5 pi) à la fois dans le tube contenant le mélange de _CaCl2 / d'ADN, vortex pendant quelques secondes, à chaque fois. Laisser les tubes reposer pendant 15 min.
5. Après 15 min d'incubation, ajouter goutte à goutte le mélange de transfection aux cellules. Incuber pendant 1-1,5 heures. Une couche de précipités de sable-comme doit être visiblesous le microscope en utilisant un objectif 10X.
6. Après incubation, rincer lamelles fois avec du tampon de lavage chaud HBS.
7. Retour à lamelles plats originaux avec des cellules gliales, ajouter de l'acide kynurénique à une concentration finale de 0,5 mM.
8. Neurones transfectées peuvent être visualisés en direct ou traitées pour immunocytochimie dès le lendemain. Les neurones peuvent survivre jusqu'à trois semaines après la transfection.

Résultats

Lorsque les différents paramètres de transfection sont optimisés et contrôlés soigneusement de expérience à l'autre, il est possible d'obtenir des efficacités de transfection allant jusqu'à 50%. Figure 1 montre un domaine de neurones qui sont transfectées avec la GFP sur DIV4. Le champ contient un total de 28 neurones, parmi lesquels 16 ont été transfectées. Cela représente un rendement de plus de 50%. Un échantillon des autres champs de la même lamelle montre le rendement gl...

Discussion

Il ya plusieurs paramètres clés qui doivent être soigneusement contrôlée pour transfections toujours réussies ^10,11. Le paramètre le plus critique pour la transfection au phosphate de calcium est la valeur de pH de 2 x HBS, qui dans nos mains varie habituellement entre 7.10 à 7.15. Nous vous conseillons d'effectuer trois lots de stocks avec des valeurs de pH par pas de 0,05 pour tenir compte de la différence entre les pH-mètres. Autrement, le kit de transfection mammifère Clontech fournit 2x HB...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09	straight / sharp 8.5 cm
Vannas-Tubinger spring scissors	Fine Science Tools	15008-08	angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-16
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91401-14	blunt / 14.5 cm
Spring scissors	Fine Science Tools	15006-09	angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge
Isoflurane	Webster Veterinary	14043-225-06
Poly-L-lysine	Sigma	P2636
MEM	Sigma	M2279
100 mM Sodium pyruvate	Sigma	S8636
Glucose	Sigma	G8270
10x HBSS	Sigma	H4385
1 M HEPES, pH 7.3	Gibco/Invitrogen	15630-080
GlutaMAX	Gibco/Invitrogen	35050-061
Neurobasal Media	Gibco/Invitrogen	21130-049
B27 Supplement (50x)	Gibco/Invitrogen	17504-044
N2 Supplement	Gibco/Invitrogen	17502-048
Ovalbumin	Sigma	A5503
Penicillin/Streptomycin	Gibco/Invitrogen	15070-063
2.5% Trypsin	Gibco/Invitrogen	15090-046
DNase I	Sigma	DN-25
Cytosine arabinoside	Calbiochem/EMD Millipore	251010
Kynurenic acid	Sigma	K3375