初代海馬ニューロンのリン酸カルシウムトランスフェクション

要約

リン酸カルシウム沈殿法は、培養細胞のトランスフェクションのため便利で経済的な方法である。最適化により、一次ニューロンのような困難なトランスフェ細胞上で、この方法を使用することが可能である。ここでは、アストログリア細胞と共培養した海馬神経細胞のリン酸カルシウムトランスフェクションのための私達の詳細なプロトコルを記述します。

要約

リン酸カルシウム沈殿法は、培養細胞のトランスフェクションのため便利で経済的な方法である。最適化により、一次ニューロンのような困難なトランスフェ細胞上で、この方法を使用することが可能である。ここでは、アストログリア細胞と共培養した海馬神経細胞のリン酸カルシウムトランスフェクションのための私達の詳細なプロトコルを記述します。

概要

一次ニューロンは、それらが有糸分裂後で、微小環境の変化に非常に敏感であるようにトランスフェクトする最も困難な細胞タイプの一つである。これらの細胞¹における外来遺伝子および短期ヘアピンRNA（shRNAの）の発現のための方法の4一般的に使用されるタイプがあります。それぞれ独自の長所と短所があります。細胞はトランスフェクションのためのキュベットに移しなければならないので、例えば、エレクトロポレーションは、通常、新たに単離されたニューロン²上で実行される。ウイルス感染は通常、非常に高い効率^3を達成するが、事業者のためのより多くの労働集約的で危険であることができます。多くの脂質媒介トランスフェクション試薬は、ニューロンおよび細胞毒性の異なるレベルにおける成功の度合いは様々で、市販されている。

リン酸カルシウムトランスフェクションは、神経細胞に外来遺伝子を導入するための、便利で経済的な方法を表す。方法は、第一の哺乳類セルへのアデノウイルスDNAを導入するために使用されたグラハムとファンデEB（1973）によるLS ^4。トランスフェクションは、リン酸緩衝液中の組換えDNAと塩化カルシウムを混合することにより行った。これは、徐々に細胞の単層上に滴下したとき、細胞表面に付着し、DNA /リン酸カルシウム沈殿物の形成は、エンドサイトーシスによって取り込まれることができ、最終的に核に^5を入力してください。このプロセスは、標的細胞における導入外来遺伝子の発現につながる。 ^{0.5〜5％、6〜8}の間のリン酸カルシウムトランスフェクション範囲の典型的な効率。しかしながら、慎重な最適化お​​よび実験プロトコルの一貫性のある実行と、それは約50％のトランスフェクション効率を達成することができる。ここでは、サンドイッチフォーマット⁹にアストログリア細胞と共培養された初代海馬ニューロンのリン酸カルシウムトランスフェクション、私たちの詳細なプロトコルを記述します。

プロトコル

1。馴化培地およびアストロサイトニューロン共培養ラットアストロサイト培養物を調製。

1. （BSSレシピについては表1を参照）解剖バッファを用意し、4℃で保存し、使用直前まで。
2. 500ミリリットルのビーカー内のイソフルランで新生ラットの仔（P0-P2）を麻酔。
3. 子犬が動かないときは、70％エタノールでスプレーし、首を切る。
4. 脳を削除します。
   1. デュモン＃5ピンセットでしっかりと頭を保持し、皮膚や頭蓋骨を通して正中切開を作るために細かいハサミを使用しています。
   2. 側面に頭蓋骨を反射することによって、脳を公開、冷BSSを含む皿に脳を削除します。
5. 解剖スコープの下で間脳および脳幹から大脳半球を分離する。慎重にピンセットの1組で組織を安定化させ、静かに鉗子の別のペアで髄膜を離れて引っ張ることで、すべての髄膜を除去します。
6. すべての半球を収集IN 1 60mmディッシュ。できる限り細かく、ミンチ組織を小さなハサミを使用して。その後、50ミリリットルコニカルチューブにみじん切りの組織を移す。
7. 脳に1％のDNase Iと2.5％トリプシンとBSSの12ミリリットル（15ミリリットルの全容量）の1.5ミリリットルの1.5ミリリットルを追加します。 37℃で15分間、振盪水浴中でインキュベート良好な混合を確実にするために、チューブを手で5分毎に旋回される。
8. 新しい50ミリリットルコニカルチューブの上に70μmの細胞濾過器上清を移す。この上清に3ミリリットルFBSを追加します。
9. 残りの部分に、13.5 BSSミリリットルと1.5ミリリットル、2.5％トリプシンを追加し、さらに15分間揺れ水浴中でインキュベートする。
10. セルストレーナーを通して残りの上清を移し、ステップ1.8から上清を兼ね備えています。
11. 細胞をペレットに5分間1,000 rpmで遠心分離します。
12. グリアメディアの5ミリリットルに再懸濁ペレット。上清を残りの細胞をペレット化し、再び遠心分離することができる。
13. 血球計数器を用いて細胞を数える。
14. プレートCEL1×10 ⁷センチあたり150 ²フラスコの密度でLS。
15. めっき後の新鮮なグリアメディアデーにメディアを変更します。その後、グリアメディアで週二回、細胞を養う。
16. 細胞が> 80％の集密度（めっき後約10日）に達したときに、90％ウマ血清および10％DMSO中で細胞をダウン凍結し、液体窒素中で株式を保つ。細胞は、バイアル当たり2×10 ⁶で凍結されています。約5バイアルを各フラスコから凍結することができる。
17. 約10〜14日間の海馬の文化を設定する前に、グリア細胞は、凍結ストックから播種する。私たちは通常、海馬ニューロンの90カバーグラス（ウェル当たり3 15ミリメートルラウンドカバーガラス）の成長をサポートするのに十分である5 6ウェルプレートを、プレート。我々はまた、トランスフェクションのためのコンディショニングN2.1のメディアに使用されるグリア細胞の追加の八から十60ミリメートル料理をプレート。神経培養前日に、細胞がNB27の培地を供給する必要があります。アストロサイトは、理想的に目で> 90％コンフルエントであるべきポイントです。大幅に凍結するとアストログリア培養におけるミクログリアの数が減少していることを、私たちを見つける。ミクログリアは、アストログリア培養物中に存在する場合に増加した神経毒性が観察されているので、私たちは常に神経細胞との共培養のために凍結ストックから調製したアストログリアの文化を使用しています。

2。神経培養

1. ミリQ水2Xの最初すすぐことによって清浄なガラス製カバースリップ。次いで、これらを24時間、濃硝酸に浸漬し、2時間の合計よりも少なくとも5回milliQ水ですすぐ。カバーガラスを6時間225℃のオーブンで焼成して乾燥し、滅菌する。
2. 転送は、滅菌後60ミリメートル皿にカバースリップ。共培養の際にグリア細胞とは別の神経細胞を維持するために、各カバースリップの外側のエッジ付近の滅菌パラフィンの4ドットを配置します。
3. 1ミリグラム/ 37℃インキュベーター内の0.1 Mホウ酸緩衝溶液中で一晩、ポリ-L-リシンでコートしたカバー。
4. 次の日、無菌メートルで二度カバース​​リップを洗う少なくとも15分間ずつilliQ水。次いで、これらを37℃のインキュベーター中でプレート培地中で一晩インキュベートする。
5. 気胸が続くイソフルラン麻酔による妊娠ラット（E18）を安楽死させると、断頭により胚性ラットを安楽死させる。脳を取り出して、上記のように大脳半球を解剖する。
6. 大脳半球から海馬を解剖する。 15ミリリットルコニカルチューブにすべての海馬を置き、15分間37℃で0.25％トリプシン（0.5ミリリットル、2.5％トリプシン、4.5ミリリットルBSS）で消化する。
7. 消化された海馬は、5分間ずつ、BSS 3Xですすぐ。次いで、それらをガラスパスツールピペットで磨砕し、細胞密度を血球計を用いて決定される。ニューロンを60 mmディッシュ当たり2×10 ⁵細胞の密度で播種する。
8. めっき後約2〜4時間後、転送がニューロンはグリアに向けて下向きにして、アストログリア細胞を含むディッシュに装着ニューロンとカバースリップ。 DIV3で、シトシンアラビノシドを追加5μmの最終濃度で細胞はグリア増殖を停止します。

3。カルシウムトランスフェクション

1. グリアトランスフェクションの前日に、条件N2.1メディア。
2. トランスフェクションの日に、グリアのオフエアコンN2.1メディアを取り、新たな皿に移す。転送はエアコンN2.1メディアへのニューロンとカバースリップ。 10月30日分間インキュベーター内で平衡化してみましょう。
3. 滅菌チューブの1に設定するには、DNAの1-4μgを全量100μlのための2MのCaCl ₂の12.5μL、及び滅菌H ₂ Oを兼ね備えています。チューブの第二のセットに、2X HBSを100μlを加える。
4. 数秒間毎回ボルテックス、 _塩化カルシウム/ DNA混合物を含むチューブに一度2X HBSの⅛量（12.5μL）を追加します。チューブは15分間座ってすることができます。
5. 15分のインキュベーション後、細胞にトランスフェクション混合物を滴下する。 1〜1.5時間インキュベートする。砂のような沈殿物の層が見えるはずです10×対物レンズを用いて顕微鏡下で。
6. インキュベーション後、温かいHBS洗浄緩衝液で2回カバースリップをすすぐ。
7. グリアとオリジナル料理にカバースリップを返し、最終濃度0.5mMにキヌレン酸を追加します。
8. トランスフェクションしたニューロンは、ライブ画像化や、早くも次の日などの免疫細胞化学のために処理することができる。ニューロンは、トランスフェクション後3週間まで生き残ることができる。

結果

トランスフェクションの異なるパラメータを最適化し、注意深く実験毎に制御される場合には、50％までのトランスフェクション効率を得ることができる。 図1は DIV4でGFPでトランスフェクトされたニューロンのフィールドを示している。フィールドが16をトランスフェクトした、そのうち28ニューロンの合計が含まれています。これは、50％以上の効率を表しています。同じカバ?...

ディスカッション

慎重に、一貫して成功したトランスフェクション^10,11のために制御する必要があるいくつかの重要なパラメータがあります。リン酸カルシウムトランスフェクションのための最も重要なパラメータは、我々の手で、通常7.10から7.15の間で変化する2×HBS、pH値である。私たちは、pH計との違いを説明するために0.05刻みでpH値を有する株式の3つのバッチを作るお勧めします。別の方法とし?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09	straight / sharp 8.5 cm
Vannas-Tubinger spring scissors	Fine Science Tools	15008-08	angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-16
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91401-14	blunt / 14.5 cm
Spring scissors	Fine Science Tools	15006-09	angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge
Isoflurane	Webster Veterinary	14043-225-06
Poly-L-lysine	Sigma	P2636
MEM	Sigma	M2279
100 mM Sodium pyruvate	Sigma	S8636
Glucose	Sigma	G8270
10x HBSS	Sigma	H4385
1 M HEPES, pH 7.3	Gibco/Invitrogen	15630-080
GlutaMAX	Gibco/Invitrogen	35050-061
Neurobasal Media	Gibco/Invitrogen	21130-049
B27 Supplement (50x)	Gibco/Invitrogen	17504-044
N2 Supplement	Gibco/Invitrogen	17502-048
Ovalbumin	Sigma	A5503
Penicillin/Streptomycin	Gibco/Invitrogen	15070-063
2.5% Trypsin	Gibco/Invitrogen	15090-046
DNase I	Sigma	DN-25
Cytosine arabinoside	Calbiochem/EMD Millipore	251010
Kynurenic acid	Sigma	K3375