JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

nucleases מעצב כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וnucleases מפעיל כמו activator-שעתוק (TALENs) יכול לשמש כדי לשנות את הגנום של עוברי preimplantation עכבר על ידי מפעילה שני סוף nonhomologous להצטרף (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית מסלולים (HR). מקדמות אלה לאפשר את הדור המהיר של עכברים עם שינויים גנטיים מדויקים.

Abstract

עכברים הטרנסגניים ביצוע שינויים ספציפי באתר הגנום (נוקאאוט, לדפוק ב) הם בעלי חשיבות חיונית ללנתח מערכות ביולוגיות מורכבות, כמו גם לדוגמנות מחל אנושיות ובדיקת אסטרטגיות טיפוליות. ההתקדמות שחלה באחרונה בשימוש בnucleases המעצב כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs), nucleases מפעיל כמו activator-שעתוק (TALENs), וחוזר palindromic הקצר interspaced באופן קבוע באשכולות (CRISPR) / מערכת (CAS) הקשורים CRISPR 9 לאתר הנדסת הגנום ספציפית לפתוח את האפשרות לבצע שינוי הגנום ממוקד מהיר כמעט בכל מיני מעבדה, ללא הצורך להסתמך על גזע עוברי טכנולוגיית תא (ES). ניסוי עריכת הגנום בדרך כלל מתחיל עם זיהוי של אתרי יעד nuclease מעצב בתוך גן של עניין ואחרי הבנייה של תחומים-DNA מחייבת מותאמים אישית כדי לכוון את פעילות nuclease למוקד גנומית המוגדר על ידי החוקר. פלסמידים nuclease מעצב הם במבחנה </ Em> עיבד ליצירת ה-mRNA לmicroinjection של ביציות מופרות בעכבר. כאן, אנו מספקים פרוטוקול להשגת שינוי הגנום ממוקד על ידי הזרקה ישירה של Talen mRNA לביציות מופרות בעכבר.

Introduction

עכברים הם ללא ספק הפלטפורמה הפופולרית ביותר ליצירת מודלים של בעלי חיים מהונדסים. ארגז הכלים תכליתיים להנדסה גנטית של עובר עכבר 1-3 הורחב לאחרונה על ידי גישות עריכת הגנום מבוססות על nucleases מעצב כגון nucleases אצבע אבץ (ZFN) 4-6, nucleases שעתוק כמו activator-מפעיל (Talen) 7,8, וחוזר התקבצו interspaced באופן קבוע הקצר palindromic (CRISPR) / מערכת (CAS) 9 הקשורים CRISPR 9. ZFN ותפקוד Talen כזוגות של שני תחומים מותאמים במיוחד המבוסס על חלבון קושר DNA (מערכים של חלבוני אצבע אבץ וחזור משתנה di-שאריות (RVDs), בהתאמה), שכל אחד מהם מצמידים את endonuclease FokI 10-12. לעומת זאת, את הספציפיות של מחשוף ה-DNA בתיווך Cas9 מסופקת על ידי transactivating RNAs CRISPR (crRNA וtracrRNA, אשר יכול גם להיות משולב לתוך מולקולת RNA chimeric בודדת RNA מדריך כינה) 11 הפועלים בקומפלקס עםחלבון CRISPR.

TALENs עם רצף מוגדר של RVDs ניתן לבנות במהירות על ידי הנסיינים בודדים עם שפע של אסטרטגיות הרכבה לבחירה 13-17. CRISPR/Cas9 מבטיח דור עתיר עבודה אפילו פחות מnucleases המעצב, לעומת זאת את הספציפיות של מדריך RNA-DNA מחייב עדיין לא נפתרו לחלוטין 18,19. דור של ZFNs המותאם אישית עד כה היה מוגבל למעבדות אקדמיות ומקצועיות לספקים מסחריים כגון Sangamo Biosciences ושירות Sigma CompoZr.

באופן כללי, הגנום עריכה עם nucleases מעצב מטרתו החדרת הפסקות גדיל כפולים (DSB) בלוקוסים הגנומי מוגדרים, אשר לאחר מכן למשוך סוף nonhomologous להצטרף (NHEJ) או רקומבינציה הומולוגית מנגנונים 10,12 (HR) תיקון DNA. תיקון תיווך NHEJ של DSB לעתים קרובות תוצאות במבוא של הוספות ומחיקות בסמיכות לאתר של תיקון. תיקון ג וכך NHEJניתן לנצל ללדפוק את הפונקציה של גן מטרה על ידי החדרת מוטציה מסגרת משמרת בתוך 4,7,9 רצף מקודד חלבוני גנים. לחלופין, תוספת או החלפה של מידע גנטי מוגדרים יכולה להיות מושגת על ידי מתן תורם DNA ביחד עם nucleases המעצב. תורם ה-DNA מורכב מרצפי DNA-נועד חוקר מוקף אזורים של הומולוגיה עם מוקד היעד, ובכך משמשים כתבנית לתיקון DSB על ידי משאבי אנוש. פלסמידים שני 5,6,20 וoligonucleotides חד גדילי 8,9,21 שימשו בהצלחה כתורמים. לא NHEJ-ולא עריכת הגנום בתיווך משאבי אנוש דורש את ההקדמה של סמן לבחירה לתוך הגנום של עובר העכבר, מה שהופך את האסטרטגיות האלה גם מתאימות במיוחד ליצירת שינויים קטנים ברצף נוקליאוטידים מבלי להפריע הארכיטקטורה הגנטית בכללותה.

בפרוטוקול זה אנו מתארים את כל הליכים החיוניים לעריכת הגנום בעובר עכבר באמצעות TALENs. אלה כוללים 1) זיהוי של אתר יעד Talen 22, 2) הבנייה של TALENs ידי שיבוט שער זהב 13, 3) סינתזה במבחנה של Talen-mRNA, 4) microinjection של Talen mRNA לביציות מופרות עכבר, 5) ניתוחים לעוברים , וניתוח של mutagenesis-Induced Talen בבעלי חיים מייסד 6). אנו מתמקדים בmicroinjection Talen mRNA והקרנה של מייסדים להוספות / מחיקות-Induced NHEJ. לשם כך יש לנו שנוצרו מבני Talen bifunctional המאפשרים גם ביטוי בתאי יונקים כאשר transfected כפלסמידים ובסינתזת מבחנה של Talen mRNA עבור microinjection לעוברי עכבר. מבנים אלה מהווים את עמוד השדרה לסיפור קטוע 23 התמזגו FokI heterodimeric תחומים 24,25 לעריכת הגנום אופטימלית בתאי יונקים. פרוטוקול זה גם יכול להיות מאומץ לmicroinjection של nucleases מעצב האחר, או לזריקות בשילוב של nucleases המעצבומבנים תורמים (עיצוב של תורמי DNA תואר בפרסומים טכניים מעולים על ידי Wefers et al. 26,27).

הצהרה אתית

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות של משרד וטרינרית Cantonal של קנטון ציריך.

Protocol

1. זיהוי של אתרי יעד Talen

  1. בקר באתר האינטרנט של TAL Effector נוקלאוטיד להשגת יעד 2.0 (http://tale-nt.cac.cornell.edu) ובחר "Talen להשגת יעד".
  2. הזן את הרצף של גן המטרה. אם ביטוי pCAG-T7-Talen בונה נמצא בשימוש (איור 1 ג) לבחור "מילר et al., 2011" תחת "השתמש בארכיטקטורה קבועה מראש" על מנת לחזות באתרי יעד שיכול להיות ממוקד עם אורך spacer האופטימלי (15-20 נ"ב) ומספרים של RVDs הסיפור (15-20) לאדריכלות Talen זה.
  3. בחר "NN" תחת "תחליף G" (RVDs NH Guanosine הספציפי זמינים גם אך עדיין לא נבחן בהרחבה להרכבת Talen).
  4. אופציונאלי: להגדרות ואפשרויות אחרות אנא עקוב אחר ההוראות באתר והקישורים הניתנים שם.
  5. קובץ טקסט עם יעד אתרים פוטנציאליים שנוצר, שבו יכול להיות מיובא לתכנית גיליון אלקטרוני לצורך הצפייה נוחה יותר. בחר זוג Talen (ים) להרכבת שער זהב.
  6. אופציונאלי: רצף האזור הגנומי של עניין בזן העכבר שישמש עבור microinjection לזהות פולימורפיזם אפשרי נוקלאוטיד בודד (SNPs) שעשוי להיות לא היווה במאגרי מידע ציבוריים ועלול מניעת nuclease מחייב.
  7. אופציונאלי: עיין בטבלה 3 למשאבי מעצב נוספים הקשורות לnucleases באינטרנט.
  8. ניתן להשיג ביותר פלסמידים הנדרשים לבניית ZFN וTalen מAddgene:
    http://www.addgene.org/special-collections/
    Addgene מזהים לערכת שער זהב Talen ובונת ביטוי Talen יונקים מסופקים בטבלה 2.
    לחלופין, ניתן להזמין במודולים פונקציונליים מסוימים, כגון תחומים אצבע אבץ מספק שירותי סינתזת גן.

"Jove_title"> 2. שער זהב עצרת Talen

סעיף זה מתאר את ההרכבה של TALENs באמצעות פרוטוקול שפרסם צ'רמאק et al. 13 TALENs באורך מלא נבנים באמצעות שני שלבי שיבוט שער הזהב הבאים (איור 1). גישה זו מאפשרת שילוב של כל מספר של RVDs בין 12 ויום 31 לבונת הביטוי הסופי. פרוטוקול האסיפה הותאם לוקטורי יעד מיועדים לmRNAs יצירה (איור 1 ג) שמבטאים TALENs פעיל מאוד הבא microinjection ביצית. נא להתייחס גם לפרוטוקול המקוון של ערכת שער זהב Talen להקמה ותחזוקת ספריית פלסמיד (http://www.addgene.org/TALeffector/goldengateV2/).

  1. יום 1 - תגובת # 1 שער זהב - אסיפה של מערכי RVD לוקטורי pFUS
    1. אופציונאלי: לכל זוג Talen תוכנן בProtocol 1, הזן את רצף ה-DNA של שני אתרי היעד (כולל T הראשוני, 5 'ל 3') לתוך הגיליון האלקטרוני TALEN_Voytas_Pipetting ליצור ערכת pipetting עבור כל תגובת שער זהב (גם להזין ריכוזים של כל פלסמידים משמשים לאסיפות ). הגיליון האלקטרוני מספק גם את רצף ה-DNA הצפוי של כל RVDs שיכול לשמש ליישור של תוצאות רצף בסעיף 2.5.2.
    2. לכל Talen הייחודי שנועד ב1 פרוטוקול:
      אם אורך Talen הוא 12-21 (סטנדרטי), di-שאריות משתנים חוזר בחרו (RVDs) 1-10 וpFUS_A וקטור יעד. בחר RVDs שנותר ווקטור יעד pFUS_B, למשל עבור Talen עם 15 RVDs (כולל חוזר שעבר, אשר יתווסף להרכבה הסופית בסעיף 2.3.3, RVDs בחר 11-14 וpFUS_B4 וקטור יעד (איור 1 א).
      אם אורך Talen הוא 22-31, RVDs השימוש 1-10 ויעד vector pFUS_A30A. פיק RVDs 11-20 וpFUS_A30B וקטור יעד. בחר RVDs שנותר ווקטור pFUS_Bdestination, למשל עבור Talen עם 24 RVDs להרים RVDs 21-23 וpFUS_B3 וקטור יעד.
    3. הגדרת תגובת # 1 שער זהב עבור כל pFUS + שילוב RVD בנפרד, כלומר 1-10 + pFUS_A וRVDs שנותר + וקטור pFUS_B המתאים או לTalen זמן רב יותר מאשר 21 RVDs, 1-10 + pFUS_A30A, 11-20 pFUS_A30B, וRVDs שנותר + וקטור pFUS_B בהתאמה. השתמש 150 ננוגרם של כל וקטור RVD, 150 ננוגרם של וקטור pFUS, 1 μl BsaI, האנזים T4 DNA μl 1, 2 חיץ μl האנזים DNA 10x T4, ו-H 2 O ל 20 μl סך נפח תגובה. (שימוש aliquots טריים של חיץ האנזים T4 לכל סיבוב של מכלולי שער הזהב מומלץ מאז חזרתי הפשרה / הקפאה של חיץ האנזים T4 יכולה להפחית את היעילות של התגובות.)
    4. הנח תגובות שער הזהב בCycler תרמו.
      בתכנית:
      37 מעלות צלזיוס 5 דקות
      16 ° C 10 דקות
      10 מחזורים
      50 מעלות צלזיוס 5 דקות
      80 מעלות צלזיוס 5 דקות
    5. הוספת μl 1 10 מ"מ ATP וnuclease פלסמיד-Safe μl 1 לכל תערובת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. טיפול זה יסיר את מוצרי קשירה חלקיים ליניארי שניתן משובטים לתוך וקטורי יעד על ידי רקומבינציה הומולוגית in vivo בחיידקים הפכו.
    6. להפוך את ה coli עם תגובות בודדות קשירה (electrocompetent או החיידק כימי מוסמך המאפשרות α-שלמה כגון XL1 כחול או DH5α ניתן להשתמש כאן ובתמורות שלאחר מכן).
    7. צלחות חיידקי צלחת על spectinomycin (50 מיקרוגרם / מיליליטר) עם X-גל וIPTG (40 מיקרוגרם / מיליליטר כל אחד) לבחירת מושבה כחולה / לבן.
  2. יום 2 - אישור של אסיפת pFUS-RVDs הנכונה
    1. מסך באמצעות המושבה PCR עם פריימרים pCR8_F1 וpCR8_R1 (ראה לוח 1 לרצפי פריימר) 1-3 לבןמושבות מכל צלחת. מכלולי pFUS-RVDs נכונים בדרך כלל יופיעו להקה המקבילה לאורך המשולב של כל משובט RVDs (למשל סביב 1.1 kb ל10 RVDs) ו" סולם "של להקות קטנות יותר פחות בולטות (איור 1).
      תכנית ה-PCR:
      95 C ° 3 דקות
      30 שניות 95 מעלות צלזיוס
      30 שניות 55 ° C
      שניות 45 1 דקות 72 C °
      30-35 מחזורים
      72 ° C 10 דקות
    2. שימוש אישר שיבוטים להתחיל תרבות הלילה (2-5 מיליליטר LB עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר spectinomycin).
  3. יום 3 - תגובה # שער זהב 2 - מערכי RVD לוקטורי ביטוי Talen
    1. מבצע "minipreps" לבודד מכלולי pFUS-RVD (תלוי במספר RVDs או pFUS_A וpFUS_B או pFUS_A30A, pFUS_A30B, וpFUS_B).
    2. אופציונאלי: וקטורי pFUS בודדים רצף באמצעות פריימרים pCR8_F1, pCR8_R1 (ר 'טבלה 1 עבור רצפי פריימר). רצף יכול גם להתבצע על final Talen בונה (סעיף 2.5.2); עם זאת, עד להשלמה מלאה TALENs עוד קורא לכל RVDs לא יכול להיות אפשרי באמצעות סנגר רצף.
    3. הגדרת תגובה # שער זהב 2 עבור כל Talen אחת. 150 ננוגרם של כל וקטור pFUS, 150 ננוגרם של PLR-HD, PLR-NG, PLR-NI, PLR-NN (האחרון "חצי חוזר") על פי התכנון של רצף RVD ולEFT l Talen להשתמש 75 ng של pCAG-T7-Talen-ELD-יעד ולTalen הנכון להשתמש 75 ng pCAG-T7-Talen-KKR-יעד (או להיפך). הוספת μl Esp3I 1, האנזים T4 DNA μl 1, 2 μl חיץ האנזים DNA 10x T4, 2 O ל 20 μl H סך נפח תגובה.
    4. הנח תגובות שער הזהב בCycler תרמו.
      בתכנית:
      37 מעלות צלזיוס 5 דקות
      16 ° C 10 דקות
      10 מחזורים
      דקות 15 37 מעלות צלזיוס
      80 מעלות צלזיוס 5 דקות
    5. השתמש בתגובות מסעיף 2.3.4 להפוך E. coli.
  4. <אישור של אסיפת Talen קורקט - strong> יום 4
    1. מסך 1-3 מושבות לבנים מכל צלחת על ידי המושבה PCR עם פריימרים TAL_F1 וTAL_R2 (ראו טבלת מס '1 לרצפי פריימר). TALENs הורכב בצורה נכונה להראות מוצר ה-PCR באורך מתאים למספר הכולל של RVDs המשולב (1D איור, הלהקה הזו היא לפעמים קשה לזהות בזמן "אפקט הסולם" מייצג אינדיקטור חזק של הרכבה מוצלחת).
      תכנית ה-PCR:
      95 C ° 3 דקות
      30 שניות 95 מעלות צלזיוס
      30 שניות 55 ° C
      72 C ° 3 דקות
      30-35 מחזורים
      72 ° C 10 דקות
    2. שימוש אישר שיבוטים נכונים להתחיל תרבויות חיידקי לילה (2-5 מיליליטר LB עם 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין).
  5. יום 5 - אישור של אסיפת Talen הנכונה
    1. מבצע "minipreps" לבודד פלסמידים pCAG-T7-Talen.
    2. אם רצף לא בוצע בsection 2.3.2, פריימרים שימוש TAL_Seq_5-1 וTAL_R2 (ראה טבלת מס '1 לרצפי פריימר) כדי לקבוע הרכבה RVD נכונה באורך מלא Talen.

3. Nuclease mRNA סינתזה

  1. דור של ה-DNA תבנית
    1. הכן פוליפוני איכות גבוהה או maxipreps של פלסמידים pCAG-T7-Talen עבור סינתזת ה-mRNA.
    2. Linearize 10 מיקרוגרם של פלסמיד סינתזת Talen או ZFN-mRNA באמצעות אנזים הגבלה שמעדיפים דבק במורד הזרם ובסמיכות לקודון STOP nuclease (לוקטורי pCAG-T7-Talen להשתמש SACI). פלסמידים סינתזת mRNA כוללים בדרך כלל T7 או אמרגן הפאג SP6 במעלה הזרם של רצף קידוד nuclease.
    3. הפעל 200-500 ng של פלסמיד מתעכל על ג'ל agarose 0.7-1% לבדוק לעיכול מלא.
    4. סילוק מלחים מפלסמיד לעכל ידי מזרז DNA עם אצטט 0.1 נתרן הנפח ואתנול 3 כרכים לשעה 1 בtemperatur החדרדואר. גלולה ה-DNA על ידי צנטריפוגה ב14,000 XG או יותר עבור 10 דקות, לשטוף את הכדור עם 200 μl 70% אתנול, ספין למשך 5 דקות נוספות, להסיר אתנול, האוויר יבש גלולה ו resuspend בנפח מתאים של מים RNase חינם. טיהור של פלסמיד לינארית ניתן גם באמצעות מערכת מבוססת עמודה, למשל ערכת טיהור QIAquick ה-PCR.
    5. קבע את הריכוז של התבנית ליניארית ולהשתמש 1 מיקרוגרם להקים בשעתוק במבחנה.
  2. mRNA סינתזה וpolyadenylation
    1. לשעתוק במבחנה של pCAG-T7-Talen פלסמידים להשתמש בערכת Ultra mMESSAGEmMACHINE T7. להגדיר את תגובת השעתוק עבור כל Talen על קרח: ל20 μl עם nuclease ללא מים, 10 μl T7 2x NTP / ARCA, 2 μl תגובת T7 10x הצפת, 1 מיקרוגרם של תבנית ה-DNA, 2 תערובת אנזים T7 μl. מערבבים את התגובה ו דגירה של 1-2 שעות ב 37 ° C.
    2. השתמש transcrip 20 μl המלאלערבב תגובת tion כדי להגדיר את תגובת polyadenylation על קרח: 36 μl מים nuclease חינם, 20 μl חיץ 5x EPAP, 10 μl 25 מ"מ MnCl2, 10 μl 10 מ"מ ה-ATP. לערבב ולהסיר 2.5 μl של תערובת התגובה כדגימות בקרת L1 ו-R1 (לnuclease ימין ועל השמאל, בהתאמה). הוסף 4 μl של אנזים E-PAP ודגירת התגובה ל45-60 דקות ב 37 ° C. הסר עוד 2.5 μl של תערובת תגובה כדגימות בקרת L2 ו R2.
  3. mRNA טיהור
    1. השתמש עמודות ספין NucAway לטיהור mRNA (חילופי חיץ והסרה של נוקלאוטידים מאוגדים). הקש עמודות להתיישב ג'ל היבש בחלק התחתון של העמודה. טור מימה עם 650 μl של חיץ RNAse ללא microinjection (1 מ"מ טריס-Cl, 0.1 EDTA, pH 7.5). כובע, מערבולת, הקש החוצה בועות אוויר מימה במשך 5-15 דקות בטמפרטורת חדר.
    2. מניחים את הטור בצינור איסוף וספיןב750 XG, 4 ° C למשך 2 דקות כדי להסיר נוזל ביניים עודף. מחק עמודת צינור איסוף ומקום בצינור elution 1.5 מיליליטר.
    3. החל תערובת תגובה מלאה מסעיף 3.2.2 לעמודת ספין על 750 XG, 4 ° C למשך 2 דקות. Nuclease mRNA עכשיו יהיה מומס חיץ microinjection. הסר 2.5 μl של דגימות מטוהרים L3 ו R3.
    4. mRNA החנות ב -80 ° C עד aliquots microinjection מוכנים.
  4. mRNA ג'ל אלקטרופורזה
    1. יש לנקות את חדר ג'ל להסרת זיהומי RNAse באמצעות 10% פתרון SDS או RNaseZAP.
    2. הכן 1% agarose ג'ל במאגר פועל 1xTBE.
    3. מערבבים את כל L1/R1 מדגם RNA, L2/R2, L3/R3 עם 3 כרכים של דאי טען NorthernMax פורמלדהיד ודגירה של 15 דקות ב 65 ° C.
    4. דגימות עומס וסולם גודל RNA (סמן גודל למשל RNA Millennium) על הג'לולהפעיל את הג'ל על 10V ל/ סנטימטר בTBE 1x עד צבע טעינה מגיע לסוף של הג'ל.
    5. כתם ג'ל באמצעות פתרון SYBR ירוק (Invitrogen) דקות 30-60 עם תסיסה בטמפרטורת חדר.
    6. תמונת ג'ל ולהשוות גדלים של L1/R1 עם L2/R2 וL3/R3. דוגמאות L2/R2 וL3/R3 צריך להראות להקות של גודל גדל ביחס לL1/R1 המציין polyadenylation המוצלח ב( איור 2).
    7. לקבוע את ריכוז ה-mRNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
    8. הכן aliquots mRNA לmicroinjections ידי ערבוב nuclease השמאל וmRNA nuclease ממש ביחס של 1:1. אנו ממליצים הכנת aliquots עם ריכוז מוחלט של 200 ng / μl (100 ng / μl של כל nuclease) על ידי דילול עם חיץ microinjection. aliquots mRNA החנות ב -80 ° C.

4. בידוד עובר וMicroinjection

  1. בידוד עובר. פרוטוקול זה נוצל בעבר בהצלחה עם C57BL/6J ומתח BDF1ים ויכול כנראה להיות מותאם לזנים אחרים המשמשים בדרך כלל בניסויי microinjection כגון FVB או CBF1. העכברים הם שוכנו תחת מחזור אור בחושך שעה HR-12 12 ובטמפרטורת מתקן לחות מבוקרת במזון ובמים כהרצון.
    1. נקבות תורם Superovulate כדי להגדיל את התשואה של עוברים. 16 נקבות (4 שבועות) superovulated בזריקה (IP) intraperitoneal של גונדוטרופין 5 של הסוסה בהריון IU הסרום (PMSG), ואחרי הזרקת ה-IP של 5 IU גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) 48 שעות מאוחר יותר.
    2. Mate 16 נקבות superovulated גיל 16 רבייה (2-8 חודשים) זכרים מייד לאחר הזרקת hCG.
    3. להקריב את הנקבות באמצעות פרוטוקול המתת חסד אושר כגון CO משאיפת 2.
    4. לשחזר את הביציות המופרות. ביציות נאספות מoviducts למחרת בבוקר ולאחר מכן משוחררת מכל תאי קומולוס שנותרו על ידי טיפול 3-5 דקות ב0.1% hyaluronidase שור מומס במדיום M2. בהתאם לביצועי ההזדווגות והזן המשמש תשואת העובר עשויה להשתנות. 16 נקבות C57BL/6J בדרך כלל לייצר 150-250, ואילו BDF1 להניב 300-400 ביציות מופרות, בהתאמה.
  2. Microinjection עובר
    1. הזרק את ה-mRNA nuclease. ביציות שלב Pronuclear מוזרקות בדרך כלל בשעתי אחר הצהריים המוקדמים. microinjection mRNA cytoplasmic מתבצע במדיום M2 תחת שמן מינרלים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת בNomarski דסק"ש באמצעות אובייקטיבי 20X ועם micromanipulators עוברים, וגם יחידת הזרקה. אנו ממליצים החל מהזריקות של Talen mRNA בריכוז של 10 ng / μl (20 ng / μl בסך הכל).
    2. לשאוב את הביצית עם נימי אחזקה ולהזריק את ה-mRNA nuclease בציטופלסמה של עובר הימנעות ממגע עם pronuclei. ההזרקה צריכה להיות רדודה, קרוב לקרום הפלזמה. נפח ההזרקה צריך להישמר נמוך ומחט microinjection צריכה להיות שנינותhdrawn עם הסימן הראשון של התנפחות cytoplasmic. סדרת microinjection בדרך כלל תהיה מורכבת מ100-300 ביציות. בדרך כלל, לפחות 80-90% מהעוברים צריכים לשרוד את ההזרקה ללא תמוגה מיידית.
    3. בעקבות microinjection, למקם את העוברים לשעת 1 במדיום M16 (Sigma) ב 37 ° C ו 5% CO 2 ולהעביר את העוברים ששרדו לאמהות אומנה pseudopregnant.

5. חזרת עוברי כירורגי

  1. הכן נמעני pseudopregnant עובר (אמהות אומנת) יום לפני microinjection mRNA. נקבות בוגרות (3-6 חודשים ישנים) של זן outbred חזק, כגון CD-1, מתאים גם לתפקיד. לגרום pseudopregnancy ידי הזדווגות הנקבות ביום קודם עם זכרים או בניתוח או גנטי שעוקרו 28. רק 0.5 נקבות DPC עם תקע הזדווגות ברור משמשות כמקבלי עוברים. אצל נשים שאינן בשימוש pseudopregnancy נעלם לאחר כ 3 קטןKS המאפשר שימוש החוזר שלהם.
  2. לטשטש 0.5 נקבות אם אומנת DPC ידי הזרקת ה-IP של קטמין, xylazine (120 מ"ג / קילוגרם ו16 מ"ג / קילוגרם, בהתאמה). ערבויות ניסוח זה ~ 30V זמן סובלנות כירורגית דקות היא יותר ממספיק לזמן פעולה הצפוי של 5-10 דק '.
  3. מקם את החיה המורדמת על הבטן שלה על משטח חם ולחטא את האזור של חתך עם חומר חיטוי מתאים כגון אתנול 70% או כלורהקסידין ותערובת אלכוהול.
  4. לחתוך את העור על הגב של בעלי החיים ולפתוח את חלל הצפק עם מספריים סטריליים.
  5. דמיין ולהחצין את קרן הרחם על ידי משיכת כרית השומן מחוברת לשחלה. שמור את האיברים לחים באמצעות 0.9% פתרון NaCl חם. זכור כי האתר כירורגית עשוי להיות עטוף ברוטב סטרילי או מגולח על מנת להתאים להנחיות וטרינרים מקומיות.
  6. לשתק את איברי הרבייה על ידי חיתוך כרית שומן השחלה עם מהדק בולדוג.
  7. בעדינות לתפוס oviduct רק נגד הזרם של ampulla עם מלקחיים שען ולהשתמש במחט מזרק 30 G כדי ליצור חור קטן בקיר oviduct.
  8. למשוך את המחט והכנס נימי זכוכית דקות המכילות את העוברים לתוך החור המאפשר את המיקום של העוברים בampulla בעדינות על ידי הנשיפה אל תוך שופרו של בעל נימים. למשוך את נימי פעם אחת את העוברים מופקדים בampulla ולהחליף איברי הרבייה בחזרה בחלל הגוף.
  9. סגור את חלל הצפק עם סדרה של תפרים סטריליים (Prolene 6-0).
  10. סגור את העור באמצעות 1-2 קליפים פצע (Autoclip 9 מ"מ) בהתאם לגודל של הפתח.
  11. בעקבות הפעולה להחזיר את בעלי החיים לכלוב בבית שלהם ולפקח עליהם, עד שהשפעת ההרדמה להתפוגג.
  12. על מנת למזער את הלחץ, לשכן את העכברים בקבוצות חברתיות יציבים (2-4 חיות / סוג III כלוב) בכל הזדמנות אפשרית.
  13. החל משכך כאבים שלאחר ניתוחים בצורה של Dafalgan הוסיף למי השתייה (אקמול 200 מ"ג / קילוגרם BW) במשך 3 ימים לאחר הניתוח.

6. ניתוח של מייסדים על ידי PCR וT7 endonuclease או הגבלת אנזימים עיכול

  1. פריימרים עיצוב כדי להגביר אזור בין 200-700 נ"ב סביב האתר מחייב nuclease. מרחקי האזור קדימה פריימר-nuclease spacer ופריימר לאזור הפוך spacer nuclease צריכים להיות שונים במידה מספקת כדי לאפשר זיהוי של שתי להקות נפרדות עבור מוצרים מתעכלים על ג'ל agarose (ראה איורים 3 ו -4 לדוגמאות).
  2. הפעל PCR עם תנאים אופטימליים. בדוק גודל amplicon PCR על ג'ל agarose.
  3. אופציונאלי: מוצרים לטהר PCR, למשל עם ערכת טיהור QIAquick PCR לסילוק מלחים ונוקלאוטידים מתערובת ה-PCR. אנזימי הגבלה רבים פעילים בדגימות ה-PCR השלימו עם חיץ אנזים ההגבלה המתאים וטיהור אין צורך. יש לנו גם successfuendonuclease T7 משמשת lly במאגר QiagenTaq PCR השלימה עם NEBuffer 2.
    1. assay endonuclease T7. מערבבים 17 μl של מוצר ה-PCR עם 2 μl של NEBuffer 2 ולהפעיל היווצרות heteroduplex (איור 3 ב) תכנית בthermocycler:
      95 C ° 2 דקות
      ל85 ° C (-2 ° C / sec) 95 C °
      85 C ° 25 ° C (-0.1 ° C / sec)
      4 ° C אחיזה.
      הוסף 1 μl של endonuclease T7 לכל דגימה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. (Assay המודד (Transgenomic), אשר מסתמך על nuclease CEL 1, יכול לשמש גם כאן. אנא עיין בהוראות היצרן.)
    2. הגבלה לעכל של המוצר ה-PCR. מערבבים 17 μl של מוצר ה-PCR עם 2 μl של 10x חיץ אנזים הגבלה וμl 1 של אנזים הגבלה. לעכל בטמפרטורה מתאימה ל1 שעות או יותר.
  5. להוסיף צבע טעינת ה-DNA לדגימות ולרוץ על ג'ל agarose 2% כדי לזהות עיכול שונהדפוסי חיות פראי מסוג והמייסדים נשאו אללים שעברו מוטציה. ראה איורים 3 ו -4 לתוצאות צפויות.
  6. מוצרי השיבוט PCR של מייסדים חיוביים עבור אללים שעברו מוטציה לסנגרו רצף (למשל על ידי ת"א שיבוט לpGEM-T Easyor ישירות רצף תערובות של מוצרי ה-PCR באמצעות רצף של הדור הבא.

תוצאות

אנו נבנו פלסמידים יעד תואמים את ההרכבה גולדן GateTALEN פורסמה על ידי צ'רמאק et al. 13 המאפשרים ביטוי של TALENs בתאי יונקים, כמו גם סינתזת ה-mRNA במבחנה מאמרגן הפאג T7 (תרשים 1C). פלסמידים אלה נושאים תחומים heterodimeric FokI (מוטציות ELD או KKR) אשר הוכחו כדי להפחית את ההשפעות מחוץ היעד ביחס לhomodimers FokI וכדי לשפר את פעילות מחשוף בהשוואה לדור הראשון FokI heterodimers 25,29. תגובת הרכבה שער זהב # 1 # 2 הם בדרך כלל יעיל מאוד וכל לבן מושבה, כאשר נותח על ידי המושבה PCR, מציגה את הדפוס הצפוי למספר המסוים של RVDs המשובט (איורים 1B ו 1D).

ניתוח של ג'ל במבחנה mRNA מסונתז (איור 2) צריך לחשוף להקה להבחין יחידה עם כתם קטן או לא עבור כל מדגם ניתח. לא צריך להיות שינוי בגודל ברור בין דגימות L1/R1 וL2/R2, L3/R3, אשר מציין polyadenylation המוצלח.

בעלי חיים מייסד יכולים להיות מוקרנים ל- Induced NHEJ אללים מוטציה באמצעות גנוטיפ PCR ואחריו גם עיכול endonuclease T7 (איור 3) או לעכל הגבלה באמצעות אנזים המסלק את הרצף מהסוג בר בתוך אזור spacer של צמד nuclease (איור 4). Assay endonuclease T7 הוא ישים לכל סוג של מוטציה ללא התחשבות ברצף הגנומי הספציפי בתוך אזור spacer של צמד nuclease הזריק; עם זאת, הוא מזהה חוסר התאמה רק בין גדילי דנ"א במוצרי ה-PCR heteroduplex. לפיכך, במקרה הנדיר שמייסד נושא שני אללים מוטציה זהה, מוצרי ה-PCR לא מראים שום דפוס עיכול T7. הבחנה כזו היא, לעומת זאת, תמיד אפשרית כאשר אתר הגבלה ספציפי ממוקם בתוך אזור spacer nuclease שיבוטל על ידי NHEJמושרה הוספות / מחיקות (איור 5). הנה, להקות מעוכלים להעיד על הנוכחות של מוטציות, והעדר כל מוצרים מתעכלים מצביע בצורה חזקה מייסד נושא מוטציות בשני אללים של הגן הממוקד (מסומן בכוכביות באיור 4).

figure-results-2056
איור 1. שיבוט שער זהב של RVDs Talen לתוך וקטורי pCAG-T7-יעד heterodimeric.) אסיפה של מערכי RVD לוקטורי pFUS. כאן מוצגת דוגמא לזוג Talen עם מערכים לסיפור אישיים הכוללים 15 RVDs ו17 RVDs, בהתאמה (עבור מערכים לסיפור ארוכים יותר מ21 RVDs, שלוש אסיפות pFUS-RVDs נדרשות, לא מוצגות). חצים מצביעים על פריימרים לpFUS ספציפי PCR תגובות המושבה. מוצרי B) PCRמוגבר של מכלולי pFUS נכונים בדרך כלל יופיע להקה מקבילה לאורך המשולב של כל משובט RVDs (למשל סביב 1.1 kb ל10 RVDs) וC "הסולם" של להקות פחות בולטות קטנות יותר בשל האופי חוזר ונשנה של מערכי RVD.) הרכבה סופית של מערכי pFUS-RVD ופלסמיד המכיל חוזר האחרון (PLR) לוקטורי ביטוי heterodimeric Talen עם גרסאות FokIELD וFokIKKR, בהתאמה. עמוד השדרה Talen (המבואר כN ו-C) דומה לארכיטקטורה שפורסמה על ידי מילר ואח'. 23 אמרגן CAG (אלמנט משפר מוקדם CMV / עוף ביתא אקטין) מבטיח רמות ביטוי גבוה בתאי יונקים transfected, בעוד אמרגן הפאג T7 מאפשר ב סינתזת המבחנה mRNA (להשתמש SACI לינאריזציה של הווקטור במורד הזרם של קודון STOP nuclease). ד) המושבה PCR באמצעות פריימרים מסומנים על ידי חצים בC) מאפשר זיהוי של TALENs התאסף בצורה נכונה. מלא lengtמוצרי h-PCR הם לעתים קרובות פחות בולטים בזמן "אפקט הסולם" מייצג אינדיקטור חזק של הרכבה מוצלחת. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-3751
איור 2. . בקרת איכות nuclease mRNA בסינתזת מבחנה באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose mRNAs ZFN מוצג כדוגמא (L, עזב ZFN; R, ZFN מימין). דוגמאות L1/R1 להראות mRNA לפני polyadenylation, דגימות מופע L2/R2 polyadenylated mRNA וL3/R3 להראות mRNA polyadenylated מטוהר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-4434 alt = "איור 3" עבור: תוכן width = "6in" עבור: רוחב src = "/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg" = "600" />
איור 3. דוגמא של assay endonuclease T7 המשמש לזיהוי של בעלי חיים מייסד נושאים מוטציות הנגרם nuclease של מוקד היעד. א) זוג Talen נועד לבקע בתוך אזור הקידוד של גן חלבון פריון העכבר (Prnp, רצף יעד Talen יכול להיות מסופק על פי דרישה). מוצר ה-PCR מופק באמצעות פריימר קדימה (F) ממוקם 110 נ"ב במעלה הזרם ופריימר הפוכה (R) 250 נ"ב במורד הזרם של אתר המחשוף Talen. ב ') המוצר ה-PCR הוא נתון בהמשך לheteroduplex היווצרות ועיכול endonuclease T7. C) mutagenesis-Induced Talen בתוך אזור גנומי הממוקד של מייסדים אחת מתגלה על ידי הנוכחות של מוצר ה-PCR באורך מלא עם מוצרי עיכול של 250 ו110 bps.50930/50930fig3highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-5444
איור 4. דוגמא לתקציר הגבלה של מוצרי ה-PCR משמשים לזיהוי של בעלי חיים מייסד נושאים מוטציות הנגרם nuclease של מוקד היעד. ספציפי ZFN למוקד היעד 29 העכבר Rosa26 אתר הגבלת XbaI בתוך אינטרון 1. מייסדים) הוקרנו על ידי genotyping-PCR באמצעות פריימר קדימה (F) ממוקם 500 נ"ב במעלה הזרם ופריימר הפוכה (R) 250 נ"ב במורד הזרם של אתר המחשוף. ב ') עיכול של מוצרי ה-PCR עם XbaI מגלה דפוסי עיכול מצביעים על עכברים עם מוטציות דו allelic (מסומנים בכוכביות), מונו -Allelic מוטציות (להקות מעוכלות והבלתי מעוכלים, למשל בעלי חיים 2)סידור ועכברי WT (עיכול שלם, למשל בעלי החיים 21). C) של עכברים עם שינויים דו allelic פוטנציאל מראה עד 3 (בעלי חיים 24 הוספות / מחיקות) מובחנות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

שמו של פריימר רצף 5 'ל 3'
pCR8_F1 ttgatgcctggcagttccct
pCR8_R1 cgaaccgaacaggcttatgt
TAL_F1 ttggcgtcggcaaacagtgg
TAL_R2 ggcgacgaggtggtcgttgg
TAL_Seq_5-1 catcgcgcaatgcactgac

טבלת 1. רצפים של צבעי יסוד המשמש לPCRs מושבה ורצף בתוך מכלול שער זהב Talenפרוטוקול.

פלסמיד / אוסף תורם Addgene מזהה תגובות
שער זהב Talen וטל Effector ערכת 2.0 מעבדה Voytas 1000000024 מכיל את כל פלסמידים הדרושים להרכבת שער זהב Talen
וקטורי יעד pCAG-T7-Talen -KKR/ELD מעבדה פלזר 40,131, 40132 Add-on פלסמידים לביטוי Talen בתאי יונקים ובסינתזת ה-mRNA במבחנה

טבלה 2. ניתן להשיג פלסמידים ואוספי פלסמיד הנדרשים להרכבת שער זהב Talen מAddgene (www.addgene.org).

באינטרנטמשאב תגובות
http://tale-nt.cac.cornell.edu עיצוב של Talen; תחזית מחוץ יעד Talen
http://zifit.partners.org/ZiFiT/ עיצוב של Talen, OPEN ZFN, קודה ZFN, CRISPR/Cas9
http://www.genome-engineering.org עיצוב של Talen, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cas9 חיזוי מחוץ היעד
http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html הרכבה של Talen רצפים לאישור תוצאות רצף
http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html עיצוב של ההרכבה מודולרי ZFN
www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware עיצוב של ההרכבה מודולרי ZFN

לוח 3. משאבים מקוונים לעיצוב ZFN, Talen, וCRISPR/Cas9.

Discussion

גישות עריכת מעצב מונע nuclease הגנום הרחיבו באופן משמעותי את מגוון מינים ניתנים לשינויים ממוקדים של הגנום שלהם 10,12. בעכברים, בתאי גזע עובריים גן המיקוד כבר טכניקה סטנדרטית ליותר משני עשורים; עם זאת, היא הוכיחה קשה להסתגל לתאי גזע עובריים ממינים אחרים מאשר העכבר, למרות שיש כבר כמה הצלחה האחרונה בתאי גזע עובריים חולדה. אפילו עם הזמינות של שיבוטים "ה-off-המדף" ממוקד גן העכבר ES תא הניתנים על ידי קונסורציומים כגון EUCOMM, KOMP, או 3 NorCOMM עריכת הגנום ידי ZFN וTalen מספק דיוק וגמישות בנושא הספקטרום של שינויים שיכולים להיות גבוהים יותר הציג לתוך גנום העכבר. נראות חיות מייסד נושאות מוטציות בתיווך nuclease להיות ניבט קו מאוד 4-6,20,21 המוסמכים, וזה לא תמיד במקרה של מפלצות שמקורם זריקות הבלסטוציסט של תאי גזע עובריים. לפיכך, במקרים מסוים של microinjection desnucleases igner יכול לגרום לדור מהיר יותר באופן משמעותי של קווי עכבר רומן עם שינויי הגנום ממוקדים.

הדור המוצלח של עכברים בנוקאאוט על ידי הזרקה של ZFN וTalen תלוי במידה רבה על פעילותם של זוג nuclease המוזרק. TALENs הוכחו יש שיעור הצלחה גבוה במיקוד מגוון רחב של גנים במספר אורגניזמים; עם זאת, מחקרים שנערך לאחרונה מצביעים על כך שTalen מחייב רגיש למתילציה ציטוזין 30,31. לכן, זוגות nuclease שנוצרו זה עתה, למשל TALENs משובטים לתוך וקטורי pCAG-T7, ניתן transfected transiently לקו תא עכבר כגון NIH-3T3 או נוירו -2a, המחקה את מצב הכרומטין של עובר העכבר במידה מסוימת. כאן, פעילות nuclease ניתן להעריך באמצעות assay endonuclease T7 או לעכל הגבלה של המוצר ה-PCR כאמור בסעיף 5 לפני סינתזת ה-mRNA וmicroinjection. אנו ממליצים רצף של האזור הגנומי של עניין בכבודive קו סלולרי וזן העכבר המשמש לניסויי microinjection.

בzygotes עכבר, זוגות Talen או ZFN שונים יעבדו בצורה אופטימלית בריכוזים ה-mRNA שונים, ולכן ריכוז העבודה האופטימלי של ה-mRNA nuclease microinjected יצטרך להיקבע באופן ניסיוני. בהתאם לזוג nuclease, נמוך מדי ריכוז יגרום שום מחשוף ואילו גבוהים מדי יכול לגרום הקטלניות עובר. בהתאם לזוג nuclease, יש לנו הצלחה באמצעות ריכוזי mRNA כולל נמוכים כמו 2 ng / μl וגבוה ככל 200 מיקרוגרם / ul. תופעות אלה הן קשות לחיזוי מניסויים בתרבית תאים והריכוז האופטימלי nuclease עבור שתי הישרדות העובר ושיעור שינוי של מוקד היעד צריך להיקבע באופן אמפירי.

ZFN מאוד פעיל או Talen יכול לבקע רצף היעד שלהם מעבר לשלב אחד התא של עובר microinjected ובכך לגרום דפוסים מורכבים של mutagenesisפסיפס ד במקימים. אנו ואחרים 4 הבחנו שלושה או יותר אללים מוטציה מובחנים במייסד יחיד (איור 5 ג). לכן, כאשר הקמת קו עכבר חדש ממייסדים אלה, צאצאים צריכים להיות מוקרנים בזהירות על ידי רצף לנוכחות של המוטציה החיובית מאז מבחני עיכול לספק ראיות היחידה שמוטציה לא מוגדרת היא הווה.

אחת הביקורות שהושמע נגד לעתים קרובות מערכות ZFN וTalen היא האפשרות כי nucleases אלה הם גם מסוגל ביקוע רצפי הווה במקום אחר בגנום הדומים לאתרי היעד. כגון השפעות מחוץ היעד כבר נצפו עם ריאגנטים דור מוקדם באמצעות תחום FokI homodimeric, ומבני heterodimer נועדו להקל על תופעות מחוץ יעד 25. ניתן לחזות באתרים מחוץ היעד פוטנציאליים במידה מסוימת בסיליקו 32,33 והוקרנו על ידי PCR וסדר. O יתרון ברורו באמצעות ZFNs וTALENs ליצירת עכברים ולא שורות תאים הוא האפשרות של הסרת ממוטציות היעד לא צמודות לשינוי הגנום רצוי על ידי ביצוע כמה הכלאות לאחור לזן פראי סוג של בחירה. לניתוח של מספר רב של עכברי מייסד, רצף עמוק של הדור הבא של מוצרי ה-PCR שנוצרו מהלוקוס ממוקד nuclease וסיליקו חזו מחוץ יעד לוקוסים עשויים להציע קריאת נתונים איכותיות וכמותית חלופה למבחני העיכול של מוצרי ה-PCR.

טכניקות רבייה בסיוע מתוארות בפרוטוקול זה מותאמות לזני עכבר סטנדרטיים המשמשים לניסויי microinjection כגון C57BL/6J או B6D2F1. עכברים של מקורות שונים, כגון זני outbred, יכולים בעיקרון לשמש לגישות עריכת הגנום ועשויים לספק רקע גנטי מתאים יותר לשאלות מחקר ספציפיות. הביצועים של טכניקות רבייה בסיוע כגון superovulation יכולים להיות predicted למספר הזנים 34-36 אבל עשוי לדרוש אופטימיזציה נוספת לזנים סטנדרטיים על מנת לקבל מספר מספיק של עוברים לmicroinjection nuclease.

חוץ מZFN וTalen, nucleases המעצב החדש כגון מערכת CRISPR/Cas9 מודרך RNA 9,37,38 יש עכשיו כבר הציג עבור יישומי עריכת הגנום. כל השיטות לmicroinjection וניתוח של בעלי החיים מייסד המתוארים כאן תקפות גם לCRISPR/Cas9 ומצבים עתידיים של עריכת הגנום.

Disclosures

המחברים מצהירים שום אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

ברצוננו להודות למוניקה Tarnowska, קורנליה אלברכט, והאווה Skoczylas לקבלת סיוע טכני מעולה. מחקר זה מומן על ידי CRSI33-125,073 מענק SNF Sinergia לPP.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BsaINEBR0535S or L
Esp3IThermo ScientificER0451
T4 LigaseNEBM0202S or L
SpectinomycinSigmaS0692-1ML
Ampicillin SigmaA0166
X-GalSigmaB4252
IPTGSigmaI6758
Plasmid-Safe nucleaseEpicentreE3101K
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
QIAGEN Plasmid Midi KitQiagen12143
QIAquick PCR Purification KitQiagen28106
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra KitInvitrogenAM1345
NucAway Spin ColumnsInvitrogenAM10070
RNaseZAPSigmaR2020-250ML
NorthernMax Formaldyde Load DyeInvitrogenAM8552
RNA Millennium MarkersInvitrogenAM7150
10x TBE bufferThermo ScientificB52
T7 endonucleaseNEBM0302S or L
pGEM-T EasyVector System IPromegaA3600
SYBR Green I Nucleic Acid Gel StainInvitrogenS-7563
pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG)SigmaG4877
human chorionic gonadotropin (hCG)SigmaCG5
M2 embryo culture mediumSigmaM7167
M16 embryo culture mediumSigmaM7292
Mineral oil, embryo testedSigmaM8410
KetamineCentraVetKet 201
XylazineSigma Aldrich46995
Equipment/Tools
Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200)Nikon
Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF)Narishige
Embryo holding capillariesSutter InstrumentsB100-75-10
Embryo injection capillariesNarishigeGD-1
Capillary puller (for example Sutter P97)Sutter Instruments
Microforge (for example Narishige MF-900)Narishige
Walton skin scissorsFST14077-10
Surgical scissorsFST14041-10
Surgical probeFST10140-03
Reflex wound clip system (9 mm)FST12031-09
Reflex wound clips (9 mm)FST12032-09
Dumont fine forceps 5FST11254-20
Moria curved forcepsFST11370-31
Moria fine forcepsFST11399-80
Dietrich bulldog clampFST18038-45
C57BL/6J miceJackson Labsstrain code 000664
CD-1 miceCharles Riverstrain code 000664

References

  1. Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat. Rev. Genetics. 6, 507-512 (2005).
  2. Johansson, T., et al. Building a zoo of mice for genetic analyses: a comprehensive protocol for the rapid generation of BAC transgenic mice. Genesis. 48, 264-280 (2010).
  3. Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
  4. Carbery, I. D., et al. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetics. 186, 451-459 (2010).
  5. Meyer, M., de Angelis, M. H., Wurst, W., Kuhn, R. Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022-15026 (2010).
  6. Cui, X., et al. Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 29, 64-67 (2011).
  7. Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
  8. Wefers, B., et al. Direct production of mouse disease models by embryo microinjection of TALENs and oligodeoxynucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 3782-3787 (2013).
  9. Wang, H., et al. One-Step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  10. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genetics. 11, 636-646 (2010).
  11. ZFN, T. A. L. E. N. CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
  12. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14, 49-55 (2013).
  13. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
  14. Reyon, D., et al. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat. Biotechnol. 30, 460-465 (2012).
  15. Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nat. Protoc. 7, 171-192 (2012).
  16. Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nat. Biotechnol. 31, 251-258 (2013).
  17. Schmid-Burgk, J. L., Schmidt, T., Kaiser, V., Honing, K., Hornung, V. A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator-like effector genes. Nat. Biotechnol. 31, 76-81 (2013).
  18. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
  19. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat. Biotechnol. 31, 822-826 (2013).
  20. Hermann, M., et al. Evaluation of OPEN zinc finger nucleases for direct gene targeting of the ROSA26 locus in mouse embryos. PLoS ONE. 7, (2012).
  21. Meyer, M., Ortiz, O., Hrabe de Angelis, M., Wurst, W., Kuhn, R. Modeling disease mutations by gene targeting in one-cell mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 9354-9359 (2012).
  22. Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).
  23. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29, 143-148 (2011).
  24. Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
  25. Doyon, Y., et al. Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures. Nat. Methods. 8, 74-79 (2011).
  26. Wefers, B., et al. . Current Protocols in Mouse Biology. , (2011).
  27. Wefers, B., Wurst, W., Kühn, R. . Current Protocols in Mouse Biology. , (2011).
  28. Haueter, S., et al. Genetic vasectomy-overexpression of Prm1-EGFP fusion protein in elongating spermatids causes dominant male sterility in mice. Genesis. 48, 151-160 (2010).
  29. Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Brown, M. T., Gersbach, C. A. Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases. Nucleic Acids Res. 40, 3741-3752 (2012).
  30. Bultmann, S., et al. Targeted transcriptional activation of silent oct4 pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition of epigenetic modifiers. Nucleic Acids Res. 40, 5368-5377 (2012).
  31. Valton, J., et al. Overcoming TALE DNA binding domain sensitivity to cytosine methylation. J. Biol. Chem. 287, 38427-38432 (2012).
  32. Cradick, T. J., Ambrosini, G., Iseli, C., Bucher, P., McCaffrey, A. P. ZFN-Site searches genomes for zinc finger nuclease target sites and off-target sites. BMC Bioinform. 12, (2011).
  33. Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).
  34. Byers, S. L., Payson, S. J., Taft, R. A. Performance of ten inbred mouse strains following assisted reproductive technologies (ARTs). Theriogenology. 65, 1716-1726 (2006).
  35. Luo, C., et al. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains. J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 50, 471-478 (2011).
  36. Pease, S., Saunders, T. L. . International Society for Transgenic Technologies. Advanced protocols for animal transgenesis : an ISTT manual. , (2011).
  37. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
  38. Mali, P., et al. RNA-Guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

ZFNTalen86microinjectionnucleases

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved