במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

Summary

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Abstract

בצמחים ואצות ירוקות, אור הוא נתפס על ידי מתחמי אור הקציר (LHCs), משפחה של חלבוני קרום נפרד שירכזו chlorophylls וקרוטנואידים. בחי, חלבונים אלה מקופלים עם פיגמנטים ליצירת קומפלקסים אשר מוכנסים בקרום thylakoid של הכלורופלסט. הדמיון הגבוה בתכונות כימיות ופיסיות של בני המשפחה, יחד עם העובדה שהם יכולים בקלות לאבד את הפיגמנטים בבידוד, עושה הטיהור שלהם במדינה האם של מאתגרת. גישה חלופית כדי להשיג הכנות הומוגנית של LHCs פותחה על ידי Plumley ושמידט בשנת 1987 ^1, שהראה כי ניתן היה להקים מחדש מתחמים אלה במבחנה החל מפיגמנטים מטוהרים וapoproteins פרש, וכתוצאה מכך מתחמים עם מאפיינים מאוד דומים לזה של ילידים מתחמים. זה פתח את הדרך לשימוש בחלבוני רקומביננטי הביעו חיידקים במבחנה (לדוגמא, אתרי פיגמנט מחייב) או תחום חלבון (למשל, אינטראקציה בין חלבונים, קיפול). שיטה זו כבר מותאמת במספר מעבדות ומוחלת על רוב מתחמי אור הקציר. הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את השיטה של הבנייה מחדש מתחמי אור קציר במבחנה המשמשים כיום במעבדה שלנו, ודוגמאות המתארות יישומים של השיטה מסופקות.

Introduction

מנגנון הפוטוסינתזה של צמחים ואצות כוללים חלבונים נפרד קרום שקושרים כלורופיל (CHL), ב (CHL ב) וקרוטנואידים (מכונית). מתחמי פיגמנט החלבון אלה הם פעילים בקצירת אנרגיית אור ומעביר שאנרגיית העירור למרכזי התגובה, שבו נעשה בו שימוש כדי לקדם את תשלום ההפרדה ^2. הם גם מעורבים במנגנוני משוב רגולציה המגנים על מנגנון הפוטוסינתזה מפני נזק אור הגבוה ^3,4. מתחמי קצירת האור (LHCs) מורכבים ממשפחה גדולה של חלבונים הקשורים בצמחים ואצות ^5.

הטיהור הומוגנית של כל אחד מבני המשפחה כבר מסובכת על ידי התכונות כימיות ופיסיות דומות מאוד של מתחמים. בנוסף, הליכי טיהור לעתים קרובות לגרום לאובדן של פיגמנטים או cofactors הפוטנציאלי האחר כגון שומנים. במבחנה represen הכינון מחדשts שיטה רבת עוצמה כדי להתגבר על בעיות אלה. LHC הקשורים Photosystem II (LHC-II) הוקם מחדש ראשון במבחנה על ידי Plumley ושמידט בשנת 1987 ^1. החוקרים שחולצו חלבון ופיגמנטים delipidated בנפרד מכלורופלסטים מפעל, ולאחר מכן בשילוב חלבון החום מפוגל עם פיגמנטים בנוכחות ליתיום Dodecyl סולפט (LDS), ואחריו שלושה מחזורים של הקפאה להפשרה ^1. הם הראו שהתכונות ספקטרליות של מתחמי LHC מחדש היו מאוד דומות למתחמים מטוהרים מצמחים. קלות מחדש של מתחמי פיגמנט חלבון LHC, סביר להניח בשל כמה תכונת הרכבה עצמית טבועה, יחד עם הקושי בבידוד מתחמים מטוהרים מאורגניזמים, הובילו לאימוץ מהיר של השיטה על ידי חוקרים אחרים. הכינון מחדש של חלבונים פוטוסינתטיים ביתר בEscherichia coli (E. coli) הושג על ידי פאולסן ועמיתים בשנת 1990 ^6. בתוך א 'coli, חלבוני קרום ביטוי יתר כלולים בדרך כלל בגופי הכללה, שמתקני הטיהור שלהם. הכינון מחדש מושגת באמצעות denaturation חום של גופי ההכללה המכילים חלבון רקומביננטי בנוכחות LDS, ואחריו התוספת של פיגמנטים היוזמת את קיפול החלבונים. קיפול של מתחם LHCII הוא תהליך בן שני שלבים: ראשון, כלורופיל כרוך בדקות פחות מ 1; שני, כלורופיל b מאוגדת והתייצבה מעל ⁷ מספר דקות.

בנוסף לאספקת תובנה הדינמיקה מתקפל, בכינון מחדש חוץ גופית בשילוב עם מכוון mutagenesis אתר אפשר זיהוי של חומצות אמינו ספציפיות חשובות ליציבות (לדוגמא, ^8,9) או תיאום פיגמנט (למשל, ^10). גם מניפולציה של קיפול מחדש של תנאים על ידי התאמת פרמטרים כמו הרכב פיגמנט או בדטרגנטים זיהו critica אלמנטיםl לקיפול נכון, כגון הדרישה של Xanthophylls למורכב LHCII (למשל, ^1,11). בנוסף, החקירה של התכונות של פיגמנטים בודדים קשורים למתחמים הייתה אפשרית באמצעות מתחמים מחדש in vivo (למשל, ^10).

השיטה המתוארת כאן מתחילה עם בידוד של פיגמנטים (chlorophylls וקרוטנואידים) מתרד וreinhardtii Chlamydomonas האצה הירוק. הביטוי וטיהור של חלבון LHC מE. coli בצורה של גופי הכללה לאחר מכן מפורט, ואחריו את הכינון מחדש של LHC וטיהור שלאחר מכן לפי עמודה זיקת Ni. בשלב האחרון, מתחמים מחדש הם מטוהרים עוד יותר על ידי צנטריפוגה שיפוע סוכרוז כדי להסיר פיגמנטים חופשיים וapoprotein פרש. פרוטוקול זה מייצג הליך מותאם בשילוב כמה שינויים שהוכנסו על ידי מעבדות שונות על פניזמן ^{1,6,10,12 -14.}

Protocol

.1 סך פיגמנט הפקה מעליי תרד

1. Homogenize קומץ אחד של עליי תרד (~ 20 ז) בקור גריסה מאגר 100 מ"ל (ראה טבלה 1), תוך שימוש בבלנדר ל20 שניות.
2. סנן את הפתרון באמצעות שתי שכבות של בד ניילון עם נקבוביות בקוטר של 20 מיקרומטר ו צנטריפוגות התסנין ב1,500 XG 10 דקות ב 4 ° C..
3. Resuspend גלולה המכילה כלורופלסטים עם אמנים רכים לצייר מברשת ב 1 מ"ל של קרה לשטוף הצפת (ראה טבלה 1). ברגע שהגלולה היא resuspended, להוסיף 50 מ"ל של הצפת לשטוף צנטריפוגות הפתרון ב 10,000 XG 10 דקות ב 4 ° C..
4. הסר את supernatant והעדינות resuspend גלולה (thylakoids) ב50 מ"ל של הצפת לשטוף (ראה טבלה 1).
5. צנטריפוגה הפתרון ב 10,000 XG 10 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant לחלוטין. בשלב זה, לבצע את השלבים הבאים בחושך, כדי למנוע חמצון פיגמנט.
6. להוסיף ~ 20 מ"ל של אצטון 80% שנאגרו עם Na ₂ CO ₃ (ראה טבלה 1) כדי לחלץ את הפיגמנטים. השאר את הפתרון על קרח עבור 10 דקות, vortexing מדי פעם.
7. גלולה המרכיבים התאיים על ידי צנטריפוגה XG ב 12,000 ל15 דקות ב 4 ° C..
   הערה: אם פיגמנטים לא לגמרי חילוץ, גלולה תהיה צבע ירוק וצעד 1.6 יש לחזור.
8. לאסוף את supernatant לתוך משפך separatory. הוספת 0.4 כרכים של diethylether, לנער במרץ ולפתוח את השסתום לפרוק את הגז.
9. הוספת 0.8 כרכים של 0.33 M NaCl וערבב במרץ. לאפשר 10 דקות ~ לשכבות להפריד. שלב האתר על גבי מכיל פיגמנטים שחולצו. הסר את השלב נמוך יותר ברור.
   הערה: אם ההפרדה אינה ברורה, להקפיא ולהפשיר את הפתרון כדי לשפר את ההפרדה פאזות.
10. הסר את האתר על ידי שפיכתו מחלק העליון של משפך separatory לתוך מיכל זכוכית מתאים. יבש על ידי הוספת כפית של גראןנתרן גופרתי נטול מים ular. לערבל את הפתרון ולאפשר ~ 5 דקות לתבושו לספוג מים מהאתר.
    הערה: חזור על שלב זה אם נתרן גופרתי מופיע בכבדות לחלוטין יחד; לא צריך להיות כמה גבישי ריחוף ללא כאשר האתר הוא מיובש מספיק. אם טפסי שכבת מים, להסיר את זה עם pipet פסטר לפני הוספת נתרן גופרתי נטול מים נוספים.
11. למזוג האתר למכל זכוכית חדש, שעזב את נתרן גופרתי מוצק מאחורי.
12. להתאדות האתר בspeedvac סיבובי או תחת זרם של N _2.
13. ממיסים את הפיגמנטים לחלוטין ב10 מ"ל של אצטון 100%.
14. לדלל כמות קטנה (~ 3 μl) ל1 מ"ל של 80 אצטון% ולמדוד את ספקטרום הקליטה ולקבוע / שיעור כלורופיל b וריכוז Chl עם השיטה המתוארת על ידי et Porra אל. (1989) ^15.
15. Aliquot ולייבש את הפיגמנטים בspeedvac סיבובי או תחת N זרם ₂ עד אצטון הואהתאדה לחלוטין. אחסן את הפיגמנטים היבשים ב -80 מעלות צלזיוס.

2 הפקה של הקרוטנואידים מתרד

1. בצע את פעולות 1.1-1.5. בשלב זה, לבצע את השלבים הבאים בחושך, כדי למנוע חמצון פיגמנט.
2. Resuspend גלולה thylakoid ב~ אתנול 50 מ"ל 96% שנאגרו עם Na ₂ CO ₃ (ראה טבלה 1) כדי לחלץ את הפיגמנטים. השאר את הפתרון על קרח למשך 5 דקות.
3. גלולה המרכיבים התאיים על ידי צנטריפוגה XG ב 12,000 ל15 דקות ב 4 ° C..
   הערה: אם פיגמנטים לא לגמרי חילוץ, גלולה תהיה צבע ירוק וצעד 2.2 יש לחזור.
4. לאסוף את supernatant ולהוסיף 0.1 נפח של 80% KOH (w / v) ליזום סבון.
5. השאר את הפתרון על 4 מעלות CO / N, תרים בחוזקה ומוגן מפני האור.
6. לאסוף את הפתרון לתוך משפך separatory. הוסף 1 נפח של אתר diethyl ומערבבים בעדינות.
7. הוספת 0.8 כרךumes של 0.33 M NaCl ומערבבים בעדינות. לאפשר 10 דקות ~ לשכבות להפריד. שלב אתר התפוז על גבי מכיל קרוטנואידים saponified. הסר את השלב התחתון הירוק על ידי ניקוז דרך ברזלים של המשפך.
8. הוסף 3 כרכים של מים ומערבבים בעדינות כדי להסיר את אשלגן הידרוקסידי. לאפשר השכבות להפריד. הערה: במידה והשלב העליון מופיע מעונן, להוסיף כמות קטנה של NaCl (למשל, 3 גרם של NaCl ב200 מ"ל של תמיסה) ולערבל בעדינות כדי לפזר.
9. הסר את השלב נמוך יותר בניקוז דרך ברזלים של המשפך.
10. בצעו את הפעולות 1.10-1.13.
11. לדלל כמות קטנה (~ 3 μl) ל1 מ"ל של 80 אצטון% ולמדוד את ספקטרום הקליטה ב440 ננומטר באצטון 80%. כדי לקבוע את הריכוז, להשתמש בהכחדה מקדם הממוצעת לקרוטנואידים (ε ₄₄₀ = 255) ¹⁶ בנוסחא הבאה: רכב [מ"ג / מ"ל] = x 11 (נתיב אופטי) _{(440 ננומטר} / 225 שרירי הבטן) = 1 סנטימטר.
12. Aliquot ולייבש את carotenoids בspeedvac או תחת N ₂ זרם עד שכל diethylether כבר התאדה. אחסן את הפיגמנטים היבשים ב -80 מעלות צלזיוס.

.3 סה"כ פיגמנט וקרוטנואידים הפקה מChlamydomonas reinhardtii

1. לגדול ג reinhardtii על מדיום TAP מוצק ¹⁷ בצלחת פטרי על ידי הפצת כמות קטנה של תרבות הנוזלית על פני השטח. לגדול תחת שטף תאורה הרציף של 20 μmol מ ^-2 שניות PSA תמונות ^-1 עד שכבה ירוקה של תאים גלויה.
2. באמצעות לולאת inoculating סטרילי, לקצור כמות קטנה של ג reinhardtii ממדיום TAP המוצק ולשים את התאים לתוך 500 מ"ל של מדיום TAP ¹⁷ בבקבוק 1 ליטר. לגדול התרבות ב25 C ° עם 170 תסיסה סל"ד תחת שטף תאורה רציף של 20 μmol תמונות מ ^-2 שניות PSA ^-1.
3. אחרי 5-6 ימים, התרבות צריכה להגיע לסוף של שלב לוגריתמים (6 x 10 ⁶ תאים / מ"לאו 2-2.5 צפיפות אופטית ב 750 ננומטר). צנטריפוגה התרבות ב4,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C..
4. לכלל מיצוי פיגמנט, בצע את פעולות 1.6-1.15.
5. התשואה בסך הכל תמצית פיגמנט החל מ500 מ"ל של תרבות צמיחה מלאה של ג reinhardtii הוא סביב 5 מ"ל של תמיסה בריכוז של 0.5 CHL מ"ג + b / מ"ל.
6. להפקת קרוטנואידים, בצע את פעולות 2.2-2.12.

.4 טיהור של גופי הכללה

1. לשכפל את רצף הקידוד של חלבון LHC עניין לתוך וקטור ביטוי שתוצאתו תג C-מסוף התמזג באמצעות נהלי ביולוגיה מולקולריים סטנדרטיים. להפוך מבנה זה לE. זן coli מארח כגון BL21 (DE3).
2. הכן תמוגה חיץ, חיץ דטרגנט, חיץ טריטון, TE (טבלת 1), 1 M איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ובינוני LB ¹⁸ עם האנטיביוטיקה המתאימה.
3. פיק singlהדואר E. המושבה coli המכילה שיבוט הביטוי מצלחת טרי מפוספסת ל~ 5 מ"ל של מדיום LB עם האנטיביוטיקה המתאימה באמצעות נהלים סטנדרטיים ^6. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה 220 סל"ד לפחות 16 שעות.
4. הוסף 2.5 מ"ל של O / תרבות N לתוך בקבוק 1 ליטר Erlenmeyer עם 250 מ"ל של LB בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה.
5. לגדול התאים ל2-3 שעה (או עד OD ₆₀₀ הוא ~ 0.6) על 37 מעלות צלזיוס ב220 סל"ד.
6. הוספת IPTG לריכוז סופי של 1 מ"מ. תמשיך לגדול תאים על 37 מעלות צלזיוס עם 220 סל"ד 3-4 שעות.
7. צנטריפוגה התרבות 10 דקות ב XG 5,000 על 4 מעלות צלזיוס בצינור צנטריפוגות-שקל מראש. בטל supernatant ביסודיות ולקבוע את המשקל את הכדור על ידי שקילה שוב והפחתת משקל צינור צנטריפוגות.
8. Resuspend E. תא גלולה coli ב0.8 מ"ל / גרם תמוגה חיץ על ידי vortexing הנמרץ.
   הערה: לחלופין, התא גלולה יכול להיות קפוא ב -80C לשימוש מאוחר יותר. אם מתחיל עם גלולה קפוא, תאפשר להפשיר לחלוטין לפני הוספת מאגר תמוגה.
9. הוסף 2 מ"ג של ליזוזים לגרם של תאים, ולדגור על קרח רטוב עם vortexing מזדמן ל30 דקות.
10. הוסף 20 מיקרוגרם / מ"ל DNAse, 10 מ"מ MgCl _2, 1 mM NaCl, 20 מיקרוגרם / מ"ל RNAse. וורטקס ולשים על קרח למשך 30 דקות.
11. הוסף 2 מ"ל של חיץ דטרגנט הקר לגרם של תאים. מערבבים היטב ולשמור על RT במשך 5 דקות.
12. העברה ל2 צינורות מ"ל צנטריפוגות (התפצלה לשני צינורות במידת צורך). צנטריפוגה ל10 דקות ב 12,000 XG ב 4 ° C עד גלולה גופי ההכללה.
13. הוסף 1 מ"ל של טריטון הקר חיץ וresuspend את הכדור על ידי sonification (3 פולסים 5 שניות כוח x 50% x עם 20 מרווחי שניות) לחלוטין. הערה: יש לי הצינור בכוס קטנה המוקפת במי קרח כדי לשמור אותו קר בsonification. במקרה של צינורות מרובים, לשלב את גופי הכללת resuspended לתוך צינור אחד אחרי resuspension.
14. צנטריפוגה ל10 דקות ב 12,000XG ב 4 ° C עד גלולה גופי ההכללה.
15. חזור על שלב 4.13 ו4.14 שתי פעמים.
16. Resuspend גופי ההכללה ב 1 מ"ל של TE הקר עם sonification לשטיפה סופית כדי להסיר את חיץ טריטון. צנטריפוגה ל10 דקות ב 12,000 XG ב 4 ° C עד גלולה גופי ההכללה.
17. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של TE הקר על ידי sonification.
18. להעריך את ריכוז החלבון בשיטות סטנדרטית כגון assay ברדפורד ^19. aliquots חנות של גופי ההכללה ב -20 מעלות צלזיוס.

.5 כינונה מחדש

פרוטוקול זה בדרך כלל תשואות 1-2 מ"ל של חלבון מחדש עם OD של 4 כאשר הספיגה נמדדה באזור QY (600-750 ננומטר). כמות יכולה להיות מותאמת לפי צורך, אם כי יש להקפיד לשמור על היחסים התקינים במהלך ההליך.

1. הכן את הפתרונות הבאים כפי שמתואר בטבלה 1: 2x הכינון המאגר, 20% OG, 2 M KCl, TE. בצע את ים הבאteps באור עמום.
2. Resuspend 800 מיקרוגרם של גופי הכללת LHC בסך של 400 μl TE בצינור microfuge 2 מ"ל. הוספת 400 μl של 2x הכינון הצפת ובקצרה מערבולת.
3. הוספת 0.6 μl של β-mercaptoethanol (M 14.8 המלאי) יש ריכוז סופי של 10 מ"מ. מחממים את החלבון 1 דקות ב98 מעלות צלזיוס. וורטקס בקצרה מקום ב RT במשך 3 דקות.
4. Resuspend 500 מיקרוגרם בסך הכל פיגמנטים כלורופיל מיובש בתוספת 80 מיקרוגרם פיגמנטים קרוטנואידים ב30 μl 100% EtOH ידי נמרצות vortexing דקות 1 או מקום בsonicator אמבטיה ל1-2 דק '.
5. ספין תערובת פיגמנט ~ 30 שניות ב15,800 XG ב 4 מעלות צלזיוס ולאשר כי אין גלולה. אם יש גלולה, לחזור vortexing ו / או sonification. חשוב: לאחר resuspension והספין, להוסיף מייד פיגמנט לחלבון, או שהוא יכול לצבור ויצטרך להיות מושעה שוב.
6. לאט לאט להוסיף את תערובת פיגמנט לחלבון המקורר תוך vortexing. המשך מערבולת 5-10 שלצינור ec ומניחים על קרח רטוב. היזהר שלא המערבולת מדי במרץ, כאשר החלבון יכול לעלות על גדותיו העליונה של הצינור.
7. הוספת 94 μl של 20% β-D-glucopyranoside Octyl (OG) (ריכוז סופי של 2%), בקצרה מערבולת ולשמור על קרח 10 דקות.
8. הוסף 90 μl של KCl 2 M (ריכוז סופי 150-200 מ"מ), בקצרה מערבולת ולשמור על קרח 20 דקות. הערה: הכנת טור (סעיף 6) יכולה להיות יזם בשלב זה.
9. ספין 10 דקות ב 15,800 XG ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה (זירזה LDS) לצינור 10 מ"ל. שמור על קור ומוגן מפני אור.

.6 טיהור טור ניקל

1. הכן את הפתרונות הבאים כפי שמתואר בטבלה 1: חיץ OG, חיץ לשטוף OG, חיץ Elution.
2. חבר עמודה Ni-Sepharose (1 מ"ל) או שווה ערך למשאבת peristaltic להבטיח כי אין אוויר נכנס פנימה הטור בשלב זה והשלבים הבאים.
3. קבע את המהירות של tהוא לשאוב עד 1 מ"ל / דקה ולשטוף את העמודה עם 5-10 מ"ל של מים כדי להסיר את פתרון האחסון.
4. לאזן את העמודה עם 3-4 מ"ל של חיץ OG.
5. להוסיף 3-4 מ"ל של חיץ OG למדגם החלבון והעומס לעמודה. הערה: אם החלבון כבר יושב על קרח ליותר מ 10 דקות לאחר הסרת LDS, ספין שוב ב15,800 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות כדי להסיר כל משקעים LDS נוספים.
6. יש לשטוף את העמודה עם 5 מ"ל של חיץ OG.
7. יש לשטוף את העמודה עם 2 מ"ל של חיץ לשטוף OG.
8. Elute החלבון קשור עם חיץ elution 3 מ"ל. לאסוף elute הירוק המכיל את החלבון מחדש. הערה: זה בדרך כלל על 1 מ"ל בסך הכל.

.7 סוכרוז Gradient צנטריפוגה

1. הכן את הפתרונות הבאים כפי שמתואר בטבלה 1: פתרון סוכרוז, 0.06% β-DM, 0.01 M HEPES, pH 7.6.
2. מלא צינורות ultracentrifuge עם תמיסת סוכרוז וההקפאה ב -20 CO ° / o Nr -80 ° C לשעה לפחות 1.
3. הסר את הצינור מהמקפיא ולאפשר להפשיר באין מפריע ב 4 ° C.. הערה: תהליך ההקפאה / הפשרה יוצר שיפוע 0.1 לסוכרוז 1 M. צינור 15 מ"ל בדרך כלל מפשיר בשעה בערך 3.
4. מוציא בזהירות מהחלק העליון באותו נפח כחלק הירוק eluted מעמודת Sepharose ניקל בשלב 6.8. לאחר מכן טען את המדגם מחדש על גבי לאט כדי להימנע מלהפריע לשיפוע.
5. צינורות איזון וספין ב200,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס בultracentrifuge באמצעות הרוטור SW-41 או SW-60 מתנדנד דלי ל18 שעה, שנקבע כדי להאט האצה ועצירה ללא בלמים.
6. להוציא בזהירות את השיפוע ממחזיק הצינור עם מלקחיים. השתמש במזרק עם מחט ארוכה שיש לה פתיחה בוטה כדי לאסוף את החלק יחסי מהחלק העליון. הערה: לחלופין, לאסוף שברים מהתחתית על ידי פירסינג הצינור עם מחט ואיסוף טיפות.

תוצאות

פרוטוקול זה מפרט שיטה כדי לשקם מחייבים חלבונים / b chorophyll במבחנה. טכניקה זו מאפשרת הקיפול של מתחמים אלה פיגמנט החלבון במבחנה החל מapoprotein, אשר ניתן להשיג על ידי ביטוי יתר במערכת Heterologous, ופיגמנטים המופקים מצמח או אצות. לאחר הכינון מחדש, מורכב פיגמנט החלבון קפל מטוהר מעודף פיגמנטים וapoprotein פרש בשני שלבים. הצעד הראשון (איור 1 AB) מבוסס על הנוכחות שלו התג בC-המסוף של החלבון, המאפשר את הסרת חלק גדול מפיגמנטים מאוגדים. שלב הטיהור השני מנצל צנטריפוגה צפיפות סוכרוז שיפוע, (איור 2) שבו החלבון המקופל בדרך כלל נודד איטי יותר מאשר הלהקה הירוקה המכילה את החלבון מחדש. המטרה של הכינון מחדש במבחנה היא להשיג מתחמים עם אותו ראויקשרים כילידים אלה. כדי להמחיש את התוצאה הזאת, התכונות ספקטרוסקופיות של אור מורכב קציר in vivo היא בהשוואה לאותו מורכב LHC מחדש במבחנה ^13,20,21. ספקטרום הספיגה של LHCs בטווח הנראה לעין (350 ננומטר ו750 ננומטר) תלוי בהרכב פיגמנט של המתחם, כמו גם על הסביבה של פיגמנט (הכולל את החלבון) ומהווה למעשה כלי רגיש כדי לבדוק את האיכות של הכינון מחדש. באיור 3, ספקטרום הספיגה של CP24, כלורופיל / b מחייבת חלבון מthaliana ארבידופסיס, מחדש במבחנה, הוא בהשוואה לספקטרום של אותו מטוהר מורכב מארבידופסיס thylakoids ^21. בספקטרום, זה אפשרי להכיר QY והמעבר Soret של Chl (פסגות ב671 / 439 ננומטר) וChl ב (פסגות ב649 / 466 ננומטר). מתחמי הילידים מחדש ולהראות abso הזההספקטרום rption, מה שמעיד על הרכב פיגמנט כמעט זהה וארגון. ספקטרוסקופיה הקרינה יכולה לשמש כדי להעריך את האיכות של המתחם מחדש. ספקטרום פליטת הקרינה נמדד על עירור באורכי גל שונה, שמרגשים את מעדיף פיגמנטים שונים: Chl ב440 ננומטר, Chl ב ב475 ננומטר, וXanthophylls ב500 ננומטר. בקומפלקס החלבון-פיגמנט מקופל כראוי, Chl ב וXanthophylls להעביר אנרגיית העירור שלהם בעיקר לChl בתוך כמה picoseconds, והקרינה שמקורה במערכת equilibrated תרמית וכתוצאה מכך לשיא יחיד עם אותה הצורה ומקסימום בכל שלושה עירור אורכי גל (4A-B באיור). הנוכחות של Chl ב אינם מתואמת לחלבון יכולה להיות מוכרת על ידי שיא או כתף נוסף סביב 650 ננומטר על עירור 475 ננומטר (איור 4C). הנוכחות של Chl החופשי במקום מובילהלפליטה נוספת סביב 675 ננומטר, אשר מקיים בעיקר על 440 עירור ננומטר. ספקטרום פליטת הקרינה על 475 עירור ננומטר של שני מחדש ומתחמי ילידי CP24 (איור 4D) להראות שיא יחיד ב681 ננומטר, המצביע על כך מורכב מחדש מקופל בצורה נכונה. אישור נוסף שהמורכב פיגמנט-החלבון מחדש בצורה נכונה מגיע מdichroism מעגלי מדידות (CD). אות CD באזור הגלוי תלויה באינטראקציות excitonic בין פיגמנטים ומהווה למעשה רגיש מאוד לשינויים קטנים אפילו בארגון של chromophores ^22. איור 5 מציג את ספקטרום CD של CP24 מחדש וילידים, עם פסגות טביעת האצבע האופייניות ב 681 ננומטר, 650 ננומטר ו481 ננומטר. לסיכום, הדמיון הגבוה בין התכונות ספקטרוסקופיות של ילידים וCP24 מחדש מאשר כי suita מתחמים כמו ילידי תשואות הליך הכינון מחדש Ble למחקר במבחנה של חלבוני אור קצירה.

ייצוג איור 1 של הטיהור של חלבוני LHC רקומביננטי עם התג שלו באמצעות טור ניקל. () במהלך הטיהור, החלבון מתויג, מורכב משני מתחמים מחדש (משושה ירוקה) וחלבון מחדש un / מצטבר (כתומה משושה) חייבת את פני השטח של Ni-Sepharose (נקודה כחולה), ואילו פיגמנטים מאוגדים (נקודות צבעוניות קטנות) לזרום. (ב) כאשר העמודה נשטפה עם חיץ elution המכיל imidazole, החלבונים מחדש ומחדש un נאספים בזרימה דרך.

"Width =" hres.jpg 500 "/>
שיפוע 2 סוכרוז איור של LHCII מחדש לאחר הטיהור ידי טור ניקל. מתחמים מחדש מופרדים מפיגמנט בחינם על ידי שיפוע הצפיפות. הלהקה הירוקה הכהה מייצגת LHCII מחדש והרקע הירוק החיוור מורכב מפיגמנטים חופשיים.

ספקטרום איור 3 קליטה של חלבון מחדש CP24 (rCP24, קו אדום) והאם אחד (nCP24, קו שחור) מבודד מthaliana ארבידופסיס. בשני הספקטרום, ניתן להכיר בQY והמעבר Soret של Chl (פסגות ב671 / 439 ננומטר) וChl ב (פסגות ב649 / 466 ננומטר). נתון זה שונה מאל Passarini et. 2014 ^21.

ther.within-page = "תמיד">
איור 4 ספקטרום פליטת הקרינה. ספקטרום פליטת הקרינה של מתחם מחדש CP24 wildtype () ומנורמל המרבי (B) מראה העברת אנרגיה יעילה מChl ב וXanthophyls לCHL. (C) ספקטרום פליטת הקרינה של CP24 מחדש (rCP24) וילידים מורכבים (nCP24) מבודד מthaliana ארבידופסיס. הספקטרום מנורמל למקסימום של השיא (D). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5 החוזר Dichroism ספקטרה. מחדש CP24 (rCP24, קו אדום) והילידים המורכב (nCP24, קו שחור) מבודד מthaliana ארבידופסיס מציג ספקטרום דומה מאוד.

איור 6 ספקטרום קליטה של סוג CP29 הפראי (CP29_WT) וCP29 (CP29_A2) שעבר מוטציה. הקו הירוק מראה את ההבדלים בין שתי החלקות.

ניתן לאחסן את כל המאגרים על 4 מעלות צלזיוס.
	רכיבים	ריכוז סופי	הערות נוספות
גריסה מאגר	סורביטול	0.4 M
	Tricine	0.1 M	pH 7.8
	NaCl	10 מ"מ
	MgCl 2	5 מ"מ
	אבקת חלב	0.5% w / v
הצפת לשטוף	סורביטול	50 מ"מ
	tricine	5 מ"מ	pH 7.8
	EDTA	10 מ"מ	pH 8
תמוגה הצפת	טריס	50 מ"מ	pH 8
	סוכרוז	2.5% w / v
	EDTA	1 מ"מ	pH 8
חיץ חומר ניקוי	NaCl	200 mM NaCl
	חומצת Deoxycholic	1% w / v
	NONIDET;: t = סגנון "21px גובה" "21" =	1% w / v
	טריס	20 מ"מ	pH 7.5
	EDTA	2 מ"מ	pH 8
	beta-mercaptoethanol	10 מ"מ
טריטון מאגר	טריטון X-100	0.5% w / v
	טריס	20 מ"מ	pH 7.5
	beta-mercaptoethanol	1 מ"מ
המאגר TE	טריס	50 מ"מ	pH 8
	EDTA	1 מ"מ	pH 8
הכינון מחדש הצפת	HEPES	200 מ"מ
	סוכרוז	5% w / v
	Lithiumdodecylsulfate (LDS)	4% w / v
	Benzamidine	2 מ"מ
	Aminocaproic חומצה	10 מ"מ
OG מאגר	Octylglucoside	1% w / v
	12.5% ​​w / v
	NaCl	0.2 M
	HEPES	20 מ"מ
	Imidazole	10 מ"מ
OG לשטוף הצפת	n-Dodecyl-beta-D-Maltoside (β-DM)	0.06% w / v
	HEPES	40 מ"מ	pH 7.5-9
	NaCl	0.2 M
הצפת elution	Imidazole	0.5 M
	n-Dodecyl-beta-D-Maltoside (β-DM)	0.06% w / v
	HEPES	40 מ"מ	pH 8
	NaCl	0.2 M
פתרון סוכרוז	סוכרוז	20% w / v
	n-Dodecyl-beta-D-Maltoside (β-DM)	0.06% w / v
	HEPES	0.01 M	pH 7.6
אצטון שנאגרו 80% עם נתרן קרבונט	אצטון	80% v / v
	סודיום קרבונט	1 M
96% אתנול שנאגרו עם נתרן קרבונט	אתנול	96% v / v
	סודיום קרבונט	1 M

px; "> סוכרוז

רשימת .1 טבלה של מאגרים ופתרונות בשימוש בפרוטוקול זה.

rCP26

	Chla / תערובת b	Chla / b "font6"	CHL	CHL ב	ניאו	ויולה	לאוטה	tot CHL	CHL / רכב
nCP26	-	2.2 ± 0.05	6.2	2.8	0.61	0.38	1.02	9	4.5 ± 0.1
rCP26	8	2.71 ± 0.05	6.57	2.43	0.72	0.32	0.97	3.9 ± 0.04
rCP26	5.5	2.25 ± 0.05	6.23	2.77	0.77	0.3	0.96	9	4.0 ± 0.1
rCP26	3	2.08 ± 0.04	6.08	2.92	0.76	0.3	1.04	9	4.1 ± 0.1
rCP26	1	1.7 ± 0.05	5.7	3.3	0.7	0.3	0.9	9	4.3 ± 0.05
rCP26	0.3	1.11 ± 0.04	4.7	4.28	0.7	0.3	0.9	9	4.2 ± 0.2
0.05	0.23 ± 0.01	1.4	5.6	0.58	0.24	1.11	7	3.1 ± 0.06
rCP26	<0.01	0.11 ± 0.01	0.7	6.3	0.64	0.3	1.08	7	3.06 ± 0.06

"> 9 pt; רוחב: 48pt "width =" 64 ">

לוח 2: תוכן פיגמנט של CP26 ילידים מורכבים בהשוואה לקומפלקסי החלבונים פיגמנט מחדש עם יחסים / b שונים Chl ^39.

Discussion

חלבוני קרום הם לא כל כך קלים ללמוד. בידוד של חלבונים בממברנה ילידים הוא מסובך בשל צורך solubilize bilayer השומנים עם חומרי ניקוי, אשר יכול לגרום נזק לחלבון ולהסיר cofactors החיוני. חלבונים אלו עשויים גם להיות נוכחים ברמות נמוכות בממברנות ביולוגיות, או להיות מעורב עם חלבונים הקשורים באופן הדוק, כמו במקרה של מתחמי קצירת האור, שגורם לטיהור של מתחמים בודדים קשים. ביטוי חלבון Heterologous בE. coli ובכינון מחדש חוץ גופית מציע את האפשרות להימנע מבעיות אלה. במבחנה הכינון מחדש וטיהור של תוצאות חלבונים מקופלות במתחמים שיש להם מאפיינים דומים מאוד לאלו של מתחמי ילידי ^20,21,23 ולכן יכול לשמש כדי לחקור מתחמים שלא יכול להיות מטוהר להומוגניות ^{24 - 27.}

שיטה זו משתמשת בתרד, אשר בקלות attainabבכל ימות שנה le, כמקור לסך הכנות פיגמנט וקרוטנואידים. עבור חלק reconstitutions של חלבונים האם של אצות, שימוש בפיגמנטים מטוהרים מאצות הוא מועדף בשל יצירות פיגמנט שונות. / היחס ב Chl וChl היחס / מכונית נשארים זהה, ללא קשר למקור פיגמנט.

חשוב להבין כי היעילות של הכינון מחדש היא בדרך כלל סביב 35% ^28. לכן יש צורך להסיר את הפיגמנטים שאינם כבולים וapoprotein פרש מהפתרון לאחר הכינון מחדש. פרוטוקול טיהור שני שלבים מוצג בפרוטוקול זה (ראה גם תוצאות). עם זאת, יש לציין כי צעד שיפוע סוכרוז אינו מאפשר הפרדת apo- והולו-חלבון המלאה. עבור רוב הניתוחים זה לא בעיה, כפי שapoprotein אינו מכיל פיגמנטים ולכן אינו מפריע למדידות פונקציונליות. עם זאת, במקרה זה יש צורך להסיר apoprotein באופן מלא מfrפעולה המכילה את הקומפלקס מחדש (לדוגמא, כדי לחשב את הפיגמנט לstoichiometry חלבון), ניתן להשתמש בעמודת מטבע אניוני (ראה Passarini et al. 2009 ²⁹ לפרטים נוספים).

היכולת לקפל חלבוני קצירת אור רקומביננטי עם פיגמנטים מבודדים במבחנה מספק הזדמנות "לתמרן" מתחמים על ידי שינוי "הסביבה" הכינון מחדש בדרכים שונות, וכך לשנות את המאפיינים של המתחם וכתוצאה מכך. לדוגמא, שינוי בהרכב פיגמנט במהלך הכינון מחדש יכול לגרום מורכב עם הרכב פיגמנט שונה. תכונה זו יכולה להיות מנוצלת כדי ללמוד את ההשפעה שיש לי פיגמנטים שונים על המבנה והיציבות של המתחם. בדרך כלל הכנת פיגמנט המתקבלת מתרד יש שיעור כלורופיל / b של 3: 1 וChl יחס / מכונית של 2.9: 1. יחס זה בדרך כלל מייצר חלבון מחדש עם אותם המאפיינים כמו nיצירתי אחד. עם זאת, התאמה של היחס / b Chl על ידי התוספת של Chl מטוהר או ב יכולה להשפיע על הכריכה של פיגמנטים שונים בשל שונה הסלקטיביות של אתרי הקישור ^30-33. זה אפשרי משום שרוב אתרי פיגמנט מחייבים הם לא לגמרי סלקטיבית לChl או Chl ב, אבל יכול להכיל את שניהם, אם כי עם זיקה שונה ^10,30,34. באופן דומה, אתרי קישור קרוטנואידים הוצגו גם להיות מסוגל להכיל מיני Xanthophyll יותר מאחד ^{8,35 - 38.} reconstitutions שונה של CP26, אחר מורכב פיגמנט חלבון של צמחים גבוהים יותר, תוך שימוש ביצירות פיגמנט שונים מוצג בטבלה 2 ^39. reconstitutions אלה שמשו כדי להעריך את הזיקה של אתרי קישור לפיגמנטים מסוימים ^39. זה מעניין לציין כי על מנת להשיג מורכב עם אותו ג פיגמנטomposition כילידים אחד, Chl היחס / b של תערובת פיגמנט חייב להיות 3: 1. זה נראה להיות מקרה לכל מתחמי LHC של צמחים גבוהים יותר ^20,40.

השילוב של ביולוגיה מולקולרית עם טכניקת הכינון מחדש מאפשר את התכונות של מורכב Chl מחייב להיחקר ביתר פירוט. החשיבות של תחומים חלבון שונים על היציבות וקיפול של מתחמים, או מעורבותם באינטראקציות בין חלבונים, נקבעה על ידי מקצץ apoprotein או ביצוע mutagenesis האקראי ^{8,41 - 44.} ניתן לשנות שאריות חומצת אמינו בודדת חשובות לתיאום של פיגמנטים שונים דרך מכוון mutagenesis אתר על מנת לנתח את המאפיינים של פיגמנטים בודדים או להעריך את תרומתם לתפקוד והיציבות של ^10,28,29,45 המורכבים ^{- 52.} איור 6 מראה מחדש Lhcb4 (CP29) עםמוטציה של היסטידין בעמדת 216 ^53. השוואה של הרכב הפיגמנט של wildtype ומתחמי מוטציה מראה כי המוטציה גורמת לאובדן של אחד Chl מולקולה, המצביע על כך באתר הממוקד להכיל Chl במתחם WT. ההבדלים של ספקטרום הקליטה של ​​WT ומוטציה, על נורמליזציה לתוכן פיגמנט, גם מציג את מאפייני הקליטה של ​​פיגמנט שאבד. במקרה זה, ההבדל שניתן לראות בשיא העיקרי ב680 ננומטר, המצביע על כך Chl מתואם על ידי His216 סופג באורך גל זה (לפרטים נוספים על מוטציה זו והתכונות ספקטרוסקופיות לראות Mozzo et al. 2008 ^53). גם ניתוח מוטציה יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעה של הסביבה על התכונות ספקטרוסקופיות של פיגמנטים ^54.

לסיכום, יכולים בקלות להיות משוחזר חלבוני קצירת אור במבחנה וכתוצאה מכך פיגמנט-proteiמתחמי n עם מאפיינים דומים מאוד למתחמי ילידים. בדרך זו, את הקשיים של בידוד חלבוני ילידים בוטלו, גם בעת מתן הכנת חלבון עם תשואה גבוהה וטוהר למחקר נוסף. חשיבותו של יחס 3: / b Chl 1 בהפקת מורכבת אותנטי יודגש, ודוגמאות של wildtype מחדש וLHCs מוטציה ניתנות להמחשת יישומים של הטכניקה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HisTrap HP	GE Healthcare	17-5247-01
Nylon cloth			20 μm pores
Soft artists paint brush
NONIDET P-40	Sigma	74385
Beta-DM	Sigma	D4641
DNAase	ThermoScientific	EN0525
Milk Powders
RNAase	ThermoScientific	EN0531
Sonicator
Octyl β-D-glucopyranoside	Sigma	O8001
Ultracentrifuge XL	Beckman-Coulter
TAP medium			see reference 17
LB medium			see reference 19