Bitkiler ve Yeşil Alg Işık hasat Kompleksleri İn Vitro Sulandırma içinde

Özet

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Özet

Bitkiler ve yeşil algler, ışık, ışık hasat kompleksleri (LHCs), klorofiller ve karotenoidler koordinat bütün zar proteinlerinin, bir ailesi tarafından yakalanır. In vivo olarak, bu proteinler Tilakoid zarının eklenir kompleksler oluşturmak üzere pigmentler içeren katlanır kloroplastın. Birlikte kolayca izolasyonu sırasında pigmentler kaybedebilir gerçeği ile ailenin üyeleri, kimyasal ve fiziksel özellikleri, yüksek benzerlik, bir doğal halde saflaştırılması zor hale getirir. LHCs arasında homojen terkiplerinin elde edilmesi için alternatif bir yaklaşım, bu natif çok benzer özelliklere sahip kompleksler sonuçlanan saflaştırılmış pigmentler ve katlanmamış, apolar başlayarak bu in vitro kompleksleri tekrar oluşturmak için mümkün olduğunu gösterdi, 1987 ¹ Plumley ve Schmidt geliştirilmiştir kompleksleri. Bu in vitro bakteriyel eksprese edilen rekombinant proteinlerin kullanımına yol açtı (örneğin, pigment bağlama bölgeleri) veya protein domaini (örneğin protein-protein etkileşimi, katlama) rolü. Bu yöntem, çeşitli laboratuvarlarda optimize edilmiş ve ışık hasat kompleksi en uygulanmıştır. Burada açıklanan protokol, şu anda laboratuvarda kullanılan in vitro ışık hasat kompleksleri yeniden yapılandırma yöntemi ayrıntıları ve yöntem uygulamaları açıklayan örnekler verilmektedir.

Giriş

Bitki ve alglerin fotosentez cihazı integral membran (chl a) klorofil a bağlayan proteinleri b (chl b) ve karotenoidler (araba) bulunmaktadır. Bu pigment-protein kompleksleri hasat ışık enerjisi ve şarj ayırma ² teşvik etmek için kullanılan reaksiyon merkezleri, bu uyarım enerji aktarmak aktiftir. Bunlar ayrıca, yüksek ışık hasarına ^{3,4 'den} fotosentetik düzenek korumak düzenleyici geri besleme mekanizmalarının katılmaktadırlar. Işık hasat kompleksi (LHCs) bitkiler ve yosun ⁵ ilişkili proteinlerin büyük bir ailenin oluşmaktadır.

Ailenin her bir üyesinin öznel homojen saflaştırma komplekslerinin çok benzer kimyasal ve fiziksel özellikleri daha karmaşık hale gelmiştir. Buna ek olarak, saflaştırma işlemleri çoğu zaman, lipidler, pigment ya da başka yardımcı faktörler potansiyel kaybı ile sonuçlanabilir. In vitro yeniden oluşum Represents güçlü bir yöntem bu sorunların üstesinden gelmek için. Fotositem II'nin (BHÇ-II) ile bağlantılı LHC ilk araştırmacılar bitki kloroplast ayrı delipide protein ve pigment ekstre edilmiştir. 1987 ¹ Plumley ve Schmidt in vitro yeniden ve daha sonra lityum mevcudiyetinde pigmentler ile ısıyla denatüre proteini birleştirildi dondurma ve eritme ¹ üç döngü izledi dodesil sülfat (LDS). Bunlar, yeniden oluşturulmuş LHC komplekslerinin spektral özellikleri bitkilerden arıtıldı kompleksleri çok benzer olduğunu gösterdi. Organizmalardan saflaştırılmış komplekslerini izole edilmesindeki güçlük, birlikte, bağlı bazı içsel kendi kendine bağlanma özelliği BHÇ pigment protein kompleksleri, muhtemelen yeniden yapılandırma kolaylığı, başka araştırmacılar tarafından, yöntemin pratik kabul edilmesine yol açmıştır. Escherichia coli (E. coli) aşın fotosentetik proteinlerin yeniden oluşturma ⁶ Paulsen 1990 ve meslektaşları tarafından elde edilmiştir. E'deE. coli, aşın zar proteinleri, genellikle, inklüzyon cisimcikleri içinde yer alır tesisleri için saflaştırma. Sulandırma, protein katlanmasını başlatır pigmentlerin ilave edildi LDS varlığında yeniden birleştirici protein içeren inklüzyon gövdelerinin yalıtılması, ısıl denatürasyonu ile elde edilir. LHCII kompleksinin katlanması, iki aşamalı bir işlemdir: ilk olarak, klorofil a 1 dakikadan daha az olarak bağlanmıştır; ikinci, klorofil b birkaç dakika ⁷ üzerine bağlanmış ve stabilize edilir.

Katlama dinamikleri ilişkin bilgi temin edilmesine ilave olarak, yer yönelimli mutagenez ile kombine tüpte yeniden spesifik amino asitlerin stabilitesi için önemlidir (örneğin, ^8,9) ya da pigment koordinasyon tanımlanmasını sağladı (örneğin, ^10). Böyle pigment kompozisyon ya da deterjan gibi parametreleri ayarlayarak tekrar katlama koşulları Manipülasyon da unsurları Critica belirledikBöyle LHCII kompleksi için Ksantofiller gereği olarak doğru katlanması, l (örneğin, ^1,11). Buna ek olarak, komplekslerine bağlanmış bireysel pigmentlerin özelliklerinin incelenmesi, in vivo olarak yeniden kompleksleri kullanılarak mümkün olmuştur (örneğin, ^10).

Burada açıklanan yöntem pigmentler izolasyonu (klorofil ve karotenoid) ıspanaktan ve yeşil deniz yosunu Chlamydomonas reinhardtii ile başlar. E. LHC proteinin ifadesi ve saflaştırılması inklüzyon cisimcikleri formunda Coli sonra Ni afinite kolonu ile LHC'in yeniden oluşturulması ve daha sonra, ardından arıtma için, ayrıntılı olarak verilmiştir. Son aşamada, yeniden oluşturulmuş kompleksleri ayrıca serbest pigmentler ve katlanmamış apoprotein kaldırmak için sukroz gradyanlı santrifüjleme vasıtasıyla saflandırılır. Bu protokol üzerinde farklı laboratuvarlar tarafından tanıtıldı çeşitli değişiklikler içeren bir optimize prosedürünü temsilzaman ^{1,6,10,12 -14.}

Protokol

Ispanak Yapraklarından 1. Toplam Pigment Ekstraksiyon

1. Öğütme soğuk tampon 100 ml ıspanak yaprağı (~ 20 g), homojen bir avuç 20 saniye boyunca bir karıştırıcı kullanılarak (Tablo 1 e bakınız).
2. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1500 x g'de 20 um ve santrifüj filtre ürünü bir gözenek çapına sahip naylon kumaş iki katmanı boyunca solüsyonu filtre.
3. Yumuşak bir sanatçı ile kloroplast içeren topak soğutulmuş Yıkama Tamponu, 1 ml boya fırçası süspanse (Tablo 1 e bakınız). Topak tekrar askıda bırakılmıştır sonra, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj Yıkama Tamponu ve 50 ml solüsyon ilave edin.
4. Yıkama Tamponu 50 ml pelet (tilakoidler) tekrar süspansiyon yavaşça Süpernatantı ve (Tablo 1 e bakınız).
5. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj ve çözelti tamamen supernatant çıkarın. Bu noktada, boya oksidasyonu önlemek için karanlıkta aşağıdaki adımları gerçekleştirmek.
6. Na ₂ CO ₃ ile tamponlanmış% 80 aseton, 20 ml pigmentleri elde etmek için (Tablo 1 e bakınız) ~ ekleyin. Bazen vorteks, 10 dakika boyunca buz üzerinde çözeltisi bırakın.
7. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüj ile hücresel bileşenlerini Pelet.
   Not: pigmentler tamamen ekstre değil ise, topak yeşil bir renge sahip olabilir ve 1,6 tekrar edilmelidir adım olacaktır.
8. Bir ayırma hunisi içine supernatant toplamak. Dietiletere 0.4 birimler eklemek şiddetle sarsmak ve gazın boşaltılması vanasını açın.
9. 0.33 M NaCl 0.8 hacimlerini ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. Fazların ayrılması için ~ 10 dakika bekleyin. Üst Eter fazı ekstre pigmentler içerir. Berrak bir alt faz çıkarın.
   Not: Ayırma açık değilse, dondurma ve faz ayrışmasını geliştirmek için bir çözüm eritin.
10. Uygun bir cam kap içine, ayırıcı bir huniye üstten dökülerek eter çıkarın. Gran bir kaşık ekleyerek Kurunitlerin susuz sodyum sülfat. Çözeltisi girdap ve eterden su absorbe kurutucu için ~ 5 dakika izin verir.
    NOT: sodyum sülfat tamamen kümeleştiler görünüyorsa bu adımı tekrarlayın; Eter yeterince kurutulur, bazı serbest yüzen kristaller olmalıdır. Bir su tabakası oluşması durumunda, ilave susuz sodyum sülfat ilave edilmeden önce bir yeniden süspanse ile çıkarın.
11. Arkasından, sodyum sülfat katı bırakarak yeni bir cam kaba eter süzün.
12. Döner bir speedvac ya da _N2 akışı altında eter buharlaştırın.
13. % 100 aseton, 10 ml tamamen pigmentler çözülür.
14. % 80 aseton, 1 ml içine az miktarda (~ 3 ul) seyreltin ve soğurma spektrumunu ölçmek ve Porra ve arkadaşları tarafından tarif edilen yöntem ile Chl a / b oranı ve Chl konsantrasyonunu belirler. (1989) ^15.
15. Aseton kadar kısım ve döner bir speedvac ya da _N2 akışı altında kuru pigmentlertamamen buharlaştırıldı. -80 ° C de kurutuldu pigmentler saklayın.

Ispanak gelen Karotenoidler 2. Ekstraksiyon

1. Adımları 1,1-1,5 izleyin. Bu noktada, boya oksidasyonu önlemek için karanlıkta aşağıdaki adımları gerçekleştirmek.
2. Pigmentleri elde etmek için, Na ₂ CO ₃ (Tablo 1 e bakınız) ile tamponlanmış ~ 50 ml% 96 etanol içinde Tilakoid pelletini. 5 dakika boyunca buz üzerinde çözeltisi bırakın.
3. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüj ile hücresel bileşenlerini Pelet.
   Not: pigmentler tamamen ekstre değil ise, topak yeşil bir renge sahip olabilir ve 2,2 tekrar edilmelidir adım olacaktır.
4. Supernatant toplamak ve (w / v) sabunlaştırılmasını başlatmak için% 80 KOH ve 0.1 hacim ekleyin.
5. 4 ° CO / N de çözümü bırakın, sıkıca kapatılmış ve ışıktan korunmalıdır.
6. Bir ayırma hunisi içine çözeltisi toplayın. Dietil eter 1 hacim ekleyin ve hafifçe karıştırın.
7. 0.8 vol Ekle0.33 M NaCl Umes ve hafifçe karıştırın. Fazların ayrılması için ~ 10 dakika bekleyin. Üstünde turuncu eter fazı sabunlaştırılmış karotenoidler içerir. Huninin vana içinden boşaltılmasını tarafından yeşil alt faz çıkarın.
8. 3 hacim su ilave edin ve potasyum hidroksit çıkarmak için yavaşça karıştırın. Katmanlar ayrılmaya bırakılır. Not: üst faz bulutlu görünürse, NaCI, az miktarda ilave (örneğin, 3 çözeltisi 200 ml NaCI g) ve yavaşça girdap eritin.
9. Huninin vana ile süzülmesiyle alt faz çıkarın.
10. Takip 1,10-1,13 adımları.
11. % 80 aseton, 1 ml içine az miktarda (~ 3 ul) seyreltin ve% 80 aseton içinde 440 nm'deki absorpsiyon spektrumları ölçer. Konsantrasyonunu belirlemek için, karotenoidler için ortalama yok olma katsayısı kullanılan aşağıdaki formül ¹⁶ ₍₄₄₀ ε = 255): Araba [mg / ml] = (Abs, _{440 nm} / 225) x 11 (optik yol) = 1 cm.
12. Kısım ve kuru carotenoibir speedvac veya tüm dietileter kadar _N2 akışı altında buharlaştırılmıştır DS edilmiştir. -80 ° C de kurutuldu pigmentler saklayın.

Chlamydomonas 3. Toplam Pigment ve Karotenoit Ekstraksiyon reinhardtiinin

1. C büyütün yüzey üzerine sıvı kültür az miktarda yayılması ile bir petri çanağı içinde katı ortam TAP ¹⁷ reinhardtii. 20 ľmol fotoğraflar PSA m ^-2 sn sürekli aydınlatma akı altında büyümeye ^-1 hücre yeşil tabaka görünür oluncaya kadar.
2. Steril bir aşılama döngü kullanılarak C arasında bir miktar hasat Katı TAP ortamından reinhardtii bir 1 L şişe TAP ortamı ¹⁷ 500 ml hücreleri koydu. 20 umol ^m-2 resimleri, PSA sn'lik bir sürekli aydınlatma akışı altında 170 rpm'de çalkalanarak 25 ° C'de kültür büyütün ^-1.
3. 5-6 gün sonra, kültür logaritmik fazın sonuna ulaşmalıdır (6 x 10 ⁶ hücre / mLya da 750 nm'de optik yoğunluk 2-2.5). 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüje kültürü.
4. Toplam pigment çıkarımı için, adımları 1,6-1,15 izleyin.
5. C. tam büyüme kültürü 500 ml başlayarak toplam pigment ekstresinin verim reinhardtii + b / mL, 0.5 mg a CHL bir konsantrasyon ile çözelti yaklaşık 5 ml'dir.
6. Karotenoidler çıkarımı için, adımları 2,2-2,12 izleyin.

İçerme Kuruluşlarının 4. saflaştırılması

1. Standart moleküler biyoloji prosedürleri kullanılarak bir kaynaşmış bir C-terminal His etiketi ile sonuçlanan bir ekspresyon vektörü içine ilgi LHC'in proteininin kodlama dizisi klonu. E. içine bu yapı Dönüşümü örneğin, BL21 (DE3) gibi E.coli host suşu.
2. Hazırlama Liziz tamponu, deterjan tamponu, Triton tamponu TE (Tablo 1), 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile, uygun antibiyotik ile LB ortamı ^18.
3. Bir SINGL seçinE E. Standart prosedürler kullanılarak, uygun ⁶ antibiyotiklerle LB ortamının ~ 5 ml yeni boyanmış bir plakaya ekspresyon klonu içeren E. coli kolonisi. En az 16 saat boyunca 220 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de büyütülmüştür.
4. O 2.5 ml /, uygun antibiyotik ile takviye edilmiş LB 250 ml bir 1 L'lik Erlenmeyen şişesi içine K kültürü.
5. 2-3 saat boyunca hücrelerin büyümesine 220 ​​rpm'de 37 ° C'de (ya da O.D. oluşana kadar ₆₀₀ ~ 0.6).
6. 1 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar IPTG ilave edin. 220 rpm'de 3-4 saat 37 ° C'de hücreler büyümeye devam etmektedir.
7. Önceden tartılmış bir santrifüj tüpüne 4 ° C'de 5000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj kültür. Iyice Süpernatantı atın ve yeniden tartma ve santrifüj tüpü ağırlığı çıkarılarak ağırlık pelet belirler.
8. E. süspanse 0.8 ml / güçlü döndürülerek liziz tamponu g E. coli hücre topağı.
   Not: Alternatif olarak, hücre topağı -80 ° C'de dondurulabilirDaha sonra kullanılmak üzere ° C. Dondurulmuş bir pelet ile başlanırsa, liziz tamponu ilave edilmeden önce tam olarak çözünmesine izin.
9. Hücrelerin gramı başına 2 mg lisozim ekleyin ve 30 dakika boyunca arada sırada burgaç gibi ıslak buz üzerinde inkübe edilir.
10. 20 ug / ml DNAz, 10 mM _MgCl2, 1 mM NaCI, 20 ug / ml RNAse ekleyin. Karıştırın ve 30 dakika için buz üzerine yerleştirilmiştir.
11. Hücre gramı başına soğuk Deterjan tampon maddesinin 2 ml ilave edilir. İyice karıştırın ve 5 dakika boyunca oda tutun.
12. 2 ml santrifüj tüplerine transfer (gerekirse iki tüp içine bölünmüş). 4 ° C'de 12,000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüje cisimciği: pelet.
13. Tampon soğuk Triton 1 ml ekleyin ve tamamen sonification tarafından pelet (20 sn aralıklarla 3 bakliyat x 5 sn x% 50 güç) tekrar süspansiyon. NOT: sonification sırasında soğuk tutmak için buzlu su ile çevrili küçük bir beher tüp var. Birden fazla tüp durumunda, yeniden süspansiyon haline getirilmesi sonra bir tüp içine yeniden süspansiyon haline getirilmiş cisimciği birleştirir.
14. 12,000 10 dakika boyunca santrifüj4 ° C'de xg cisimciği: pelet.
15. Adımı tekrarlayın 4.13 ve 4.14 iki kez.
16. Triton tampon kaldırmak için bir yıkama için sonifikasyon soğuk TE 1 ml cisimciği yeniden süspanse edin. 4 ° C'de 12,000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüje cisimciği: pelet.
17. Sonifikasyon soğuk TE 1 ml pelletini.
18. Bu Bradford tahlili ¹⁹ gibi standart yöntemler ile protein konsantrasyonu değerlendirin. -20 ° C'de saklayın inklüzyon cisimleri alikotları.

5. Sulandırma

Absorbans Qy bölgesine (600-750 nm) olarak ölçülür, bu protokol, genellikle 4 OD'ye ile yeniden protein 1-2 ml verir. Bakım işlemi sırasında uygun oranlarının muhafaza edilmesi için gereken miktarı, ancak, istendiği gibi ayarlanabilir.

1. 2x Sulandırma Tamponu,% 20 RG, 2M KCI, TE, Tablo 1 'de tarif edildiği gibi aşağıdaki çözümleri hazırlayın. Aşağıdaki s gerçekleştirinloş ışıkta Teps'in.
2. 2 ml mikrofuge'de tüp 400 ul TE toplam LHC Eklenmesi Organları 800 mikrogram süspanse. 2x Sulandırma Tampon ve vorteks kısaca 400 ul ekleyin.
3. 10 mM'lik bir son konsantrasyon için β-merkaptoetanol (14.8 M stok), 0.6 ul ekleyin. 98 ° C'de 1 dakika boyunca proteini ısıtın. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında Vortex kısa ve yer.
4. 1-2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde bir banyo sonikatörü içinde 1 dakika ya da bir yer girdaplanarak 30 ul% 100 EtOH toplam kurutulmuş klorofil pigmentlerin 500 ug ve 80 ug karotenoid pigmentler yeniden süspanse edin.
5. 4 ° C'de 15,800 xg ~ 30 sn pigment karışımı Spin ve hiçbir pelet olduğunu onaylayın. Pelet varsa, vorteksleme ve / veya sonifikasyon tekrarlayın. ÖNEMLİ: yeniden süspansiyon ve spin sonra, hemen proteine ​​pigment eklemek veya toparlayıp tekrar yeniden süspanse gerekecektir.
6. Vorteks edilirken yavaşça soğutuldu proteine ​​pigment karışımı ekleyin. Girdabına 5-10 s DevamIslak buz üzerinde ec ve yer tüpü. Protein tüpün üst taşabilir de dinç bir şekilde vorteks için dikkatli olun.
7. % 20 Octyl β-D-glukopiranozide (OG) (son konsantrasyon% 2), vorteks kısaca 94 ul ekleyin ve buz 10 dakika devam.
8. Kısaca M KCI 2 (nihai konsantrasyon 150-200 mM) girdap 90 ul ilave edin ve 20 dakika buz üzerinde tutun. NOT: kolon hazırlama (Bölüm 6) şu anda başlatılabilir.
9. 4 ° C'de 15,800 x g'de 10 dakika boyunca spin. 10 ml tüp (LDS çöktürülmüş) pelet bozmadan süpernatantı. Soğuk ve ışıktan korumalı tutun.

6. Nikel Kolonu Saflaştırması

1. RG tamponu, RG durulama tamponu Ayrıştırma Tamponu: Tablo 1 de tarif edildiği gibi aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
2. Bu aşama hava ve aşağıdaki aşamaları esnasında, kolonun iç alır sağlayan bir peristaltik pompa, bir Ni-Sefaroz sütunu (1 mi) ya da eşdeğer bağlayın.
3. T hızını ayarlamaO, 1 ml / dak pompa ve depolama çözeltinin çıkarılması için su ile 5-10 ml sütunu yıkayın.
4. OG tamponu 3-4 ml sütun dengelenmesi.
5. Kolona protein örnek ve yük OG tampon 3-4 ml ilave edilir. Not: protein LDS çıkarılmasından sonra daha uzun bir süre 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka süresi edilmiş ise 1 dakika ilave LDS çökelmesini kaldırmak için, 4 ° C'de 15,800 x g hızında tekrar dönerler.
6. OG tamponu, 5 ml ile sütun durulayın.
7. RG durulama tamponu 2 ml ile sütun durulayın.
8. 3 mi tampon maddesi ile bağlanmış proteininin elüt edilmesi. Yeniden oluşturulmuş protein içeren yeşil eluteye toplayın. NOT: Bu genellikle toplam olarak yaklaşık 1 ml olmuştur.

7. Sükroz Gradyan Santrifüjü Geri

1. Sakroz çözeltisi,% 0.06 β-DM 0.01 M HEPES, pH 7.6: Tablo 1 de tarif edildiği gibi aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
2. -20 ° CO / N o da sukroz çözeltisi ve dondurulması ile ultrasantrifüjdeki tüpleri doldurmakR, -80 ° C'de en az 1 saat.
3. Dondurucudan tüp çıkarın ve 4 ° C'de dokunulmadan çözülme sağlar. Not: donma / çözülme işlemi 0.1 ila 1 M sukroz ile bir gradyan oluşturur. Bir 15 ml tüp, tipik olarak yaklaşık 3 saat içinde çözülür.
4. Dikkatli bir şekilde üst aşama 6.8 'de nikel Sefaroz sütunundan elüt yeşil fraksiyon olarak aynı hacimde çıkarın. Daha sonra gradyanı rahatsız etmemek için yavaş yavaş üstüne yeniden örnek yüklemek.
5. Hızlanma ve fren olmayan durdurma yavaşlaması, 18 saat boyunca, SW-41 ya da SW-60 sallanan kepçeli rotor kullanılarak bir ultrasantrifüjdeki Tüpleri dengeleyin, ve 4 ° C sıcaklıkta 200,000 x g'de santrifüj.
6. Dikkatlice forseps ile tüp sahibinden degrade çıkar. Üst kısmını toplamak için bir kör deliğe sahiptir uzun bir iğne ile bir şırınga kullanın. Not: Alternatif olarak, bir iğne ile delme ve tüp damla toplayarak alttan fraksiyonlarım toplamak.

Sonuçlar

Bu protokol, in vitro chorophyll a / b bağlayıcı protein tekrar oluşturmak için bir yöntem göstermektedir. Bu teknik, bitki ya da yosun ekstre bu pigment protein, bir heterolog sistemde aşırı ekspresyonu ile elde edilebilir apoprotein başlayarak in vitro kompleksleri ve pigmentlerin katlanmasına izin verir. Sulandırıldıktan sonra tekrar katlanmış protein kompleksi pigment pigmentler fazla iki adımda katlanmamış apoprotein saflaştırılır. İlk adım, (Şekil 1 AB) bağlanmamış pigmentlerin büyük bir kısmının bertaraf edilmesine imkan sağladığı proteinin C-terminalinde His-etiketinin varlığına dayanmaktadır. Ikinci bir saflaştırma aşaması olarak, katlanmamış protein çoğunlukla yeniden proteini içeren yeşil bir bant daha yavaş göç sükroz yoğunluklu santrifüjleme (Şekil 2) kullanılmaktadır. In vitro yeniden kurulması amacı, aynı uygun kompleksler elde etmektiryerli olanlar gibi kravatlar. Bu sonucu göstermek için, bir in vivo ışık hasat kompleksi spektroskopik özellikleri in vitro ^13,20,21 içinde yeniden aynı LHC kompleksi ile karşılaştırılır. Görünür aralık (350 nm ve 750 nm) 'de LHCs absorbsiyon spektrumu, pigment ortamına yanı sıra kompleks pigment bileşimine bağlı (protein içeren) ve bu nedenle de kalite kontrol etmek için hassas bir araçtır Yeniden oluşturma. Şekil 3, CP24 emilim spektrumunda bir klorofil a / b, in vitro yeniden Arabidopsis thaliana, ikinci protein bağlama Arabidopsis tilakoidler ²¹ aynı kompleks saflaştırılmış spektrumu ile karşılaştırılır. Spektrumları olarak, kı ve (tepe 671/439 nm'de) Chl arasında Soret geçiş ve Chl b (649/466 nm tepe değeri) görmek mümkündür. Yerli ve yeniden kompleksleri aynı abso göstermekbir hemen hemen aynı bir pigment bileşimi ve organizasyonunu gösteren rption spektrumu. Floresans spektroskopisi yeniden kompleksinin kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir. Floresans emisyon spektrumları tercihen farklı pigmentlerin heyecanlandırmak farklı dalga boylarında uyarım üzerine ölçülür: Chl bir 440 nm, Chl 475 nm b ve 500 nm'de Ksantofiller de. Doğru bir şekilde katlanmış bir protein kompleksi içinde pigment, Chl B ve ksantofiller birkaç piko içinde esas Chl a kendi uyarım enerji transferi ve floresan, aynı şekilde ve azami her üç uyarım ile tek bir tepe noktası ile sonuçlanan, termal dengeye sistemden kaynaklanır dalga boyu (Şekil 4A-B). Proteine ​​koordine olmayan B Chl mevcudiyeti, 475 nm eksitasyon (Şekil 4C) üzerine 650 nm civarında ilave bir tepe ya da omuz tarafından kabul edilebilir. Serbest Chl varlığı yerine açar440 nm uyarım üzerine, esasen 675 nm, emisyon etrafında ek. 475 yeniden hem nm'de uyarma ve doğal CP24 kompleksleri (Şekil 4D) üzerine floresans emisyon spektrumu yeniden oluşturulmuş bir kompleksi doğru katlanmış gösteren 681 nm, tek bir pik gösterir. Pigment-protein kompleksi doğru yeniden bir ek onay dairesel dikroizm (CD) ölçümleri geliyor. Görülebilir bölgedeki CD sinyali pigmentleri arasında Eksitonik etkileşimlerine bağlıdır ve bu nedenle de ²² kromoforların organizasyonunda hatta küçük değişikliklere karşı çok hassastır. Tipik parmak izi zirvelerde ile yeniden kurulmuş ve doğal CP24 CD spektrumunu göstermektedir Şekil 5 681 nm, 650 nm ve 481 nm olarak ölçülmüştür. Sonuç olarak, doğal spektroskopik özellikleri ile yeniden CP24 bu yeniden oluşturma işlemi verimler doğal benzeri kompleksleri Suita teyit arasındaki yüksek benzerlik ışık hasat proteinlerin in vitro çalışma için ble.

, Bir nikel kolonu kullanılarak bir His etiketi rekombinant proteinlerin BHÇ saflaştırma gösterimi Şekil 1. (A). Her ikisi de yeniden kompleksleri (yeşil altıgen) ve BM-yeniden / toplu proteini, saflaştırılması, His-etiketli protein sırasında, (turuncu Bağlanmamış pigmentler (küçük renkli noktalar) akmaya devam altıgen), Ni-Sefaroz (lekesi) yüzeyine bağlanmıştır. (B) sütunu elüsyon tamponu imidazol ihtiva ile yıkandığında, tekrar oluşturulmuş ve BM-yeniden proteinler akış içinde toplanır.

hres.jpg "width =" 500 "/>
Yeniden LHCII Şekil 2. sukroz gradyanlı nikel kolonu ile konsantre edildi. Yeniden kompleksler yoğunluk gradyanı ile serbest pigment ayrılır. Koyu yeşil bant yeniden oluşturulmuş LHCII temsil eder ve soluk yeşil arka serbest pigmentlerden meydana gelmiştir.

Yeniden proteini CP24 (rCP24, kırmızı çizgi) ve Arabidopsis thaliana'dan izole edilen doğal bir (nCP24, siyah çizgi) Şekil 3. absorpsiyon spektrumları. Her iki grafik olarak, kı ve Chl a Soret geçiş yönü (tepe noktalar kabul etmek mümkündür 671/439 nm) ve b Chl (649/466 nm tepe değeri) uygulanır. Bu rakam Passarini et al modifiye edilmiştir. 2014 ^21.

Şekil 4. floresans emisyon. Bir CHL için Chl b ve Xanthophyls verimli enerji transferi gösterilen maksimum (B) yeniden CP24 vahşi tipli kompleksi (A) ve normalize floresans emisyon spektrumu. Yeniden CP24 (rCP24) ve Arabidopsis thaliana'dan izole (nCP24) yerli kompleksi (C) Floresan emisyon spektrumları. Spektrumları tepe (D) maksimum normalleştirilmiş. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5. Dairesel Dikroizm Spektrumu. Sulandırılmış CP24 (rCP24, kırmızı çizgi) ve Arabidopsis thaliana'dan izole edilen doğal kompleksi (nCP24, siyah çizgi) çok benzer spektrumlarını göstermektedir.

CP29 vahşi tip (CP29_WT) ve mutasyona uğramış CP29 (CP29_A2) Şekil 6. absorpsiyon spektrumları. Yeşil hat iki parsel arasındaki farkları gösterir.

Bütün tamponlar, 4 ° C'de saklanabilir.
	Bileşenleri	Final Konsantrasyon	Ek notlar
Taşlama Tampon	Sorbitol	0.4 M
	Trişin	0.1M	pH 7.8
	NaCl	10 mM
	MgCI2	5mM
	Süt Tozu	% 0.5 a / h
Yıkama Tampon	Sorbitol	50 mM
	Trişin	5mM	pH 7.8
	EDTA	10 mM	pH değeri 8
Liziz Tamponu	Tris	50 mM	pH değeri 8
	Sukroz	% 2.5 a / h
	EDTA	1mM	pH değeri 8
Deterjan tampon	NaCl	200 mM NaCI
	Deoksikolik asit	% 1 w / v
	Nonidet P-40	% 1 w / v
	Tris	20 mM	pH 7.5
	EDTA	2mM	pH değeri 8
	beta-Merkaptoetanol	10 mM
Triton tampon	Triton X-100	% 0.5 a / h
	Tris	20 mM	pH 7.5
	beta-Merkaptoetanol	1mM
Tampon TE	Tris	50 mM	pH değeri 8
	EDTA	1mM	pH değeri 8
Sulandırma Tampon	Hepes	200 mM
	Sukroz	% 5 w / v
	Lithiumdodecylsulfate (LDS)	% 4 a / h
	Benzamidin	2mM
	Aminokaproik Asit	10 mM
OG Tampon	Oktilglükosid	% 1 w / v
	% 12.5 w / v
	NaCl	0.2 M
	Hepes	20 mM
	Imidazol	10 mM
OG durulayın Tampon	n-dodesil-p-D-maltozit (β-DM)	% 0.06 w / v
	Hepes	40 mM	pH değeri 7,5-9
	NaCl	0.2 M
Elüsyon Tamponu	Imidazol	0.5M
	n-dodesil-p-D-maltozit (β-DM)	% 0.06 w / v
	Hepes	40 mM	pH değeri 8
	NaCl	0.2 M
Sukroz çözeltisi	Sukroz	% 20 w / v
	n-dodesil-p-D-maltozit (β-DM)	% 0.06 w / v
	Hepes	0.01 M	pH 7.6
Aseton% 80 sodyum karbonat ile tamponlanmış	Aseton	% 80 h / h
	Sodyum Karbonat	1 M
Sodyum Karbonat ile tamponlanmış% 96 Etanol	Etanol	% 96 h / h
	Sodyum Karbonat	1 M

piksel; "> sukroz

Bu protokolde kullanılan tamponlar ve çözümleri Tablo 1. listesi.

rCP26

	ChlA a / b karışımı	ChlA a / b	Chl a	Chl b	Neo	Viola	Lute	Chl tot	Chl / Araç
nCP26	-	2.2 ± 0.05	6.2	2.8	0.61	0.38	1.02	9	4.5 ± 0.1
rCP26	8	2.71 ± 0.05	6.57	2.43	0.72	0.32	0.97	3.9 ± 0.04
rCP26	5.5	2.25 ± 0.05	6.23	2.77	0.77	0.3	0.96	9	4.0 ± 0.1
rCP26	3	2.08 ± 0.04	6.08	2.92	0.76	0.3	1.04	9	4.1 ± 0.1
rCP26	1	1.7 ± 0.05	5.7	3.3	0.7	0.3	0.9	9	4.3 ± 0.05
rCP26	0.3	1.11 ± 0.04	4.7	4.28	0.7	0.3	0.9	9	4.2 ± 0.2
0.05	0.23 ± 0.01	1.4	5.6	0.58	0.24	1.11	7	3.1 ± 0.06
rCP26	<0.01	0.11 ± 0.01	0.7	6,3	0.64	0.3	1.08	7	3.06 ± 0.06

"> 9 pt; genişliği: 48pt "width =" 64 ">

CP26 yerli Tablo 2. Pigment içeriği karmaşık farklı Chl a / b Oranlarının ³⁹ ile yeniden protein pigment kompleksleri ile karşılaştırıldığında.

Tartışmalar

Membran proteinleri çalışmak çok kolay değil. Doğal zar proteinlerinin izolasyonu protein zarar verebilir ve temel kofaktör kaldırmak deterjanlarla lipid çift katmanından çözündürülmesi için ihtiyacı karmaşık hale gelir. Bu proteinler ayrıca biyolojik zarların düşük seviyelerde mevcut olabilir, ya da zor tek komplekslerinin saflaştırılması kılan hafif hasat kompleks durumunda olduğu gibi, yakın ilişkili proteinler ile karıştırılabilir. E. coli 'de heterolog protein ekspresyonu E. coli ve in vitro yeniden yapımında Bu sorunları önlemek için imkanı sunar. in vitro homojenliğe ²⁴ saflaştırılarak edilemez kompleksleri incelemek için kullanılabilir doğal kompleksleri ^20,21,23 ve dolayısıyla çok benzer özelliklere sahip kompleksleri sulandırılması ve katlanmış proteinler, sonuç saflaştırılması ^{- 27.}

Bu yöntem attainab kolaylıkla, ıspanak, kullanırtoplam pigment ve karotenoid hazırlıkları için bir kaynak olarak le yıl boyunca,. Yosunlar için nativ proteinlerin bazı reconstitutions, yosunlar saflaştırılmış pigmentlerin kullanılması nedeniyle farklı pigment bileşimler tercih edilir. Chl a / b oranı ve Chl / otomobil oranı ne olursa olsun, pigment kaynağı aynı kalır.

Bu sulandırma verimliliği genellikle% 35 civarındadır ²⁸ olduğunu fark etmek önemlidir. Bu nedenle, yeniden oluşumun ardından çözeltiden Bağlı olmayan pigmentler ve katlanmamış apoprotein kaldırmak için gereklidir. Iki aşamalı bir saflaştırma protokolü (ayrıca sonuçları bakınız), bu protokolde sunulmuştur. Bununla birlikte, sukroz gradyanlı adım APO ve sanal-proteinin tam olarak ayrılmasına izin vermez unutulmamalıdır. Apoprotein fonksiyonel ölçülerde müdahale etmeyen, böylece pigmentler ihtiva etmez ve en gibi analizler için bu bir sorun değildir. Bununla birlikte, bu durumda, tamamen fr apoprotein kaldırmak için gereklidiryeniden kompleksi (örneğin protein stoikiometriye pigment hesaplamak için) ihtiva eden işlem, bir anyonik değiştirme sütunu (bakınız Passarini ve ark. detayları için ^29, 2009) kullanılabilir.

Kapasite in vitro izole edilmiş yeniden birleştirici pigmentler ile ışık toplayıcı proteinlerin yeniden kapatmak için, böylece elde edilen kompleksin özelliklerini değiştirmeden, çeşitli şekillerde yeniden oluşturma "çevre" değiştirerek kompleksleri "ayarlamak" için bir fırsat sağlar. Örneğin, sulandırma sırasında pigment bileşimi değişen değiştirilmiş bir pigment bileşimi ile bir kompleks neden olabilir. Bu özellik, çeşitli pigmentler kompleksinin yapısı ve kararlılığı üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir. 1 ve 2.9 arasında bir Chl / araç oranı l: süresi ıspanak elde edilen pigment preparasyonu 3 bir Chl a / b oranı 1. Bu oran, tipik olarak n ile aynı özelliklere sahip olan bir sulandırma proteini üretirbirini Ative. ^{33 -} Bununla birlikte, arıtılmış, Chl a veya b eklenmesiyle Chl a / b oranı ayarlanması bağlanma yerleri ³⁰ seçiciliği değişken bağlı olarak farklı pigmentlerin bağlayıcı etkileyebilir. Pigment bağlama sitelerinin çoğu Chl a ya da b Chl tamamen selektif değildir, ama her ikisi için uygun olabilir, çünkü bu, mümkün olmasına rağmen, farklı afinite ile ^{10,30,34. 38 -} Benzer şekilde, karotenoid bağlanma yerleri, ayrıca birden Ksantofil tür ^8,35 karşılamak mümkün olduğu gösterilmiştir. CP26, çeşitli pigment bileşimleri kullanılarak yüksek bitkiler, diğer pigment-protein kompleksinin farklı reconstitutions Tablo 2'de ³⁹ olarak gösterilmiştir. Bu reconstitutions, özellikle pigmentler ³⁹ için bağlanma afinitesini belirlemek için kullanıldı. Bu aynı pigment c ile bir kompleks elde etmek için dikkat çekicidir1: doğal olarak omposition pigment karışımı Chl a / b oranı 3 olmalıdır. Bu, daha yüksek bitki ^20,40 her BHÇ kompleksleri için geçerli görünmektedir.

Yeniden oluşturma tekniği ile, moleküler biyoloji kombinasyonu, Chl bağlayıcı kompleksinin özellikleri daha ayrıntılı olarak incelenecektir sağlar. ^{44 -} kompleksleri, ya da protein-protein etkileşimleri katılımları kararlılığı ve katlanma farklı bir protein alanlarının önemi, apoprotein kesilmesi ya da rastgele mutagenez ^8,41 yapılarak belirlenmiştir. ^{52 -} Farklı pigmentlerin koordinasyonu için önemli bir tek amino asit kalıntıları tek tek pigmentlerin özelliklerini analiz ya da kompleks ^10,28,29,45 bir fonksiyon ve stabilite etkilerinin değerlendirilmesi için, yer yönlendirmeli mutagenez ile değiştirilebilir. Şekil 6 ile Lhcb4 (CP29) yeniden^53, 216 konumunda bir mutasyonu histidin. vahşi tip ve mutant komplekslerinin pigment bileşimin bir karşılaştırması mutasyon hedef sitesi WT kompleksi içinde Chl a barındırır gösteren bir molekül, bir Chl kaybını uyardığını göstermektedir. WT ve mutant absorpsiyon spektrumları arasındaki farklar, pigment içeriğine normalleşmeyi üzerine de kayıp pigmentin emme özelliklerini gösterir. Bu durumda, fark Chl His216 tarafından koordine edilen bu dalga boyunda absorbe eder (bu, mutant ile ilgili daha fazla bilgi için ve spektroskopik özellikleri Mozzo ve ark. 2008 ⁵³⁾ gösteren, 680 nm 'de, ana zirve görülebilir. Mutasyon analizi, aynı zamanda pigmentlerin ⁵⁴ spektroskopik özellikleri üzerindeki çevre etkisini belirlemek için de kullanılabilir.

Sonuç olarak, ışık hasat proteinlerini pigment Protei sonuçlanan in vitro yeniden oluşturulabiliryerli kompleksleri çok benzer özelliklere sahip n kompleksleri. Ayrıca, ileri çalışmalar için yüksek verim ve saflıkta olan bir protein preparasyonunu elde ederlerken, bu şekilde, doğal proteinlerin izole zorlukları ortadan kaldırılır. 3 önemi: otantik bir kompleks oluşturan 1 Chl a / b oranı vurgulanmıştır ve yeniden vahşi tip ve mutant LHCs örnekleri tekniğin kullanımlarını daha fazla açıklamak için verilmiştir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
HisTrap HP	GE Healthcare	17-5247-01
Nylon cloth			20 μm pores
Soft artists paint brush
NONIDET P-40	Sigma	74385
Beta-DM	Sigma	D4641
DNAase	ThermoScientific	EN0525
Milk Powders
RNAase	ThermoScientific	EN0531
Sonicator
Octyl β-D-glucopyranoside	Sigma	O8001
Ultracentrifuge XL	Beckman-Coulter
TAP medium			see reference 17
LB medium			see reference 19