אינדוקציה של התחדשות שריר שלד החריף ידי Cardiotoxin הזרקה

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט להניע התחדשות שרירי שלד חריפה בעכברים בוגרים ומניפולציות הבאות של השרירים, כגון לנתיחה, מקפיא, חיתוך, מכתים שיגרתי, וניתוח שטח החתך myofiber.

Abstract

התחדשות שריר שלד היא תהליך פיסיולוגי המתרחש שרירי שלד מבוגרים בתגובת פציעה או מחלה. פגיעה הנגרמת חריפת התחדשות שריר שלד היא בשימוש נרחב, מערכת מודל רבה עצמה כדי לחקור את האירועים מעורבים התחדשות שרירים, כמו גם את מנגנוני שחקנים שונים. אכן, ידע מפורט של תהליך זה הוא חיוני להבנה טובה יותר של מצבים פתולוגיים שמובילים ניוון שרירי שלד, וזה מסייע בזיהוי אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות חדשות. העבודה הנוכחית מתארת ​​פרוטוקול מפורט לשחזור להניע התחדשות שרירי שלד חריפה בעכברים באמצעות זריקה תוך שרירית אחת של cardiotoxin (CTX). CTX שייך למשפחת מרעלים ארס נחשים וגורם myolysis של myofibers, אשר בסופו של דבר מעורר את אירועי התחדשות. הדינמיקה של התחדשות שריר שלד מוערכת על ידי ניתוח היסטולוגית סעיפי שריר. הפרוטוקול גםממחיש את הפרוצדורות עבור לנתח, מקפיא, חיתוך השריר הקדמי tibialis, כמו גם מכתים Hematoxylin & Eosin שגר כי נעשה שימוש נרחב לניתוח מורפולוגיים morphometric הבא.

Introduction

שרירי שלד מבוגרים יונק נוצרים על ידי קבוצות של fascicules של תאי שריר multinucleated (myofibers) כי הם מיוחדים עבור התכווצות. כל myofiber הוא syncytium מוארך, מוקף sarcolemma (קרום plasmatic) ו במיופיברילים המכיל, אשר עשויים מחלבונים התכווצות מאורגן קבוע וחוזר (סיבי אקטין ו שרירן). בהבגרות ובתנאים המנוחים, שרירי שלד יש תחלופה נמוכה מאוד של myonuclei שלהם ^1; ואכן, myonuclei, אשר ממוקמים בפריפריה של myofiber, תחת sarcolemma, נעצרים בשלב G0 של מחזור התא אינם מסוגלים להתרבות ^1,2.

יש שרירי השלד יכולת מופלאה להתחדש בעקבות נזקים והגיע הומאוסטזיס לאחר מספר אירועים של שיפוץ רקמות שאינן קשורות באופן הדוק זה לזה. לאחר פציעה או טראומה חריפה, ניוון מושרה, ואחריו תהליכי התחדשותשכוללים אוכלוסיות תאים שונות, כולל אוכלוסיית תושב תאי שריר, תאי הלווין (SCS). ואכן, בהעדר כל לגירויים סביבתיים, תאי הלווין נמצאים במצב שקט וממוקמים בתוך גומחה בין sarcolemma ואת ^3,4 lamina הבסיס. בעקבות פציעה או מחלה, גיל להיות מופעל, להתרבות, נודד אל האזורים שנפגעו, ובסופו של דבר להבדיל, והוליד להרכיב חדש myofibers ^5. גיל הופעל להקים הצטלבות עם אוכלוסיות תאים שונות, תאים דלקתיים בעיקר, אשר מגויסות באתר של טראומת ^6-8. הצטלבות זו מאפשרת לתאים אחרי פרדיגמה מוסדר שבו אותות מולקולריים לנהוג שינויים מבניים, המוביל בסופו של דבר הומאוסטזיס ^9. מלבד גיל, תאים דלקתיים ביניים, תהליכי אנגיוגנזה, ואירועים מחדש עצבוב מעורב גם, מתנהג באופן מתואם כדי לתקן המאורגן הזה מאוד שלמבנה pecialized.

יש עניין רב בלימוד היבטים שונים של התחדשות שריר שלד, לא רק להבין את הפיסיולוגיה של השריר, אלא גם כדי לשפר אסטרטגיות טיפוליות הדורשות ידע עמוק של התהליך כולו. גישות ניסוייות קיימות מספר כרגע ללמוד את זהותו ותפקידו של אוכלוסיות תאים שונות, מסלולי איתות, ואת המנגנונים המולקולריים המעורבים. מודלים עכבר של פגיעה חריפה מייצגים כלי רב עוצמה כדי לחקור היבטים רבים של תהליך זה. שונים השתמש בטכניקות נפוצות כדי לגרום ניזק לשרירים חריף מאפשר לחוקרים לעקוב אחר תהליך ההתחדשות in vivo, מן בשלבים מוקדמים מאוד עד סוף התהליך. פרוטוקול זה מתאר את השלבים מן זריקה תוך שרירית של cardiotoxin הנגזרות ארס נחשים (CTX), אשר גורם myolysis ומפעיל את תהליך השיקום, עד מועד ניתוח של דגימות רקמה. בעקבות הזרקת CTX, מילce אפשר להקריב בנקודות זמן שונות בהתאם לדרישות ניסוי, ואת שרירי השלד יכולים להיות גזור ומעובד לניתוח נוסף. לבסוף, אנו מתארים את פרוטוקול מכתים סעיפי רקמות לבצע תצפיות מורפולוגיים ניתוחים כמותיים בסיסיים. פרוטוקול זה מאפשר לחקר התחדשות שרירי השלד חריפה in vivo באופן מאוד לשחזור ^10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם קפדן עם ההנחיות המוסדיות עבור מחקר בבעלי חיים ואושר על ידי המחלקה לבריאות הציבור, בריאות בעלי החיים, תזונה ובטיחות המזון של המשרד האיטלקי בריאות בהתאם לחוק על ניסויים בבעלי חיים. נהלים נקע בצוואר רחם עשויים להשתנות ממוסד למוסד מבוסס על IACUC או הדרישות המקבילות שלה.

1. הזרקת Cardiotoxin בשריר השוקה הקדמית

1. כן 10 מיקרומטר פתרון עובדים של cardiotoxin (CTX) על ידי דילול פתרון מניות cardiotoxin ב פוספט שנאגר סטרילי מלוח (PBS) או במים לפני תחילת ההליך.
   הערה: CTX הוא מסיס במים הוא 1 מ"ג / מ"ל. כן פתרון מניות 70 מיקרומטר. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. CTX משמש פרוטוקול זה הוא תערובת של cardiotoxins בעל משקל מולקולרי של כ -7,000 Da.
   זהירות: מומלץ ללבושכפפות כפולות, מסכה היגיינה, משקפי מגן (לחלופין משקפי מגן, מומלץ לעבוד מתחת למכסת מנוע) וכדי להיות מאוד זהיר כדי להימנע מכל מגע עם הפתרון, גם אם מדוללות.
2. להרדים את העכברים בזריקה intraperitoneal של קטמין ו xylazine (80 מ"ג / ק"ג ו -10 מ"ג / ק"ג של מסת גוף) או הרדמה זמין מאושרת אחרת.
3. עם הפנים כלפי מעלה עכבר, לרסס את הגפיים האחוריים עם אתנול 70%. כדי להמחיש את המיקום המדויק של שריר השוקה הקדמי (ת"א), בעזרת אזמל, לחתוך את השיער משם בחלק הקדמי של הרגל התחתונה, מתחת לברך.
   הערה: שריר ת"א עולה מהגוף הפרוקסימלי של עצם השוק, יורד לרוחב עד העצם וכלה באזור הקרסול. הגיד הארוך שלה משתרע לתוך כף הרגל ברחבי הקרסול (ראה איור 1 א).
4. צייר ~ 100 μL של פתרון לתוך מזרק על ידי משיכת הבוכנה חזרה לאט.
5. הסר בועות אוויר, מחזיק את המזרק כלפי מעלה (עם המחט כלפי מעלה). משוך בעדינות את הבוכנה כלפי מטה והקש על הצד של המזרק כדי לעזור בועות אוויר שהיו מחוברים אל החלק הפנימי של הצינור לבוא כלפי מעלה. לאט ללחוץ על המתג כדי לשחרר בועות אוויר גדולות. כמה טיפות של נוזל ייצא המחט. בשלב זה, הקפד לבחור את הנוזל שוב לתוך הצינור ולא לפזר אותה, בהתחשב הרעיל של cardiotoxin.
6. לשאוב את התמיסה לתוך המזרק עד המינון הרצוי הוא הגיע. להזריק 20 μL של פתרון CTX עבור כל שריר ת"א.
7. הכנס את המחט במרכז ת"א על ​​ידי ביצוע עמדת עצם השוקה כקו מנחה, מן הגיד לכיוון הברך. מאז ת"א היא רקמה דקה, לבצע הזרקת מבלי לעבור עמוק מדי (להכניס את המחט 2/3 מ"מ עמוק, בערך בשעה 10 ° עד 20 ° זווית), ולהימנע הולך מעבר השריר עצמו (איור 1 א).
8. אין למשוך את המחט מיד לאחר ההזרקה, אך לחכות 2 - 3 שניות כדי למנוע דליפהגיל CTX טיפות מן השריר.
9. לאחר ההליך, למקם את הכלוב על צלחת מחוממת (37 מעלות צלזיוס) עד העכברים ערים, מאז ההרדמה ואת אתנול המשמש להפחית את טמפרטורת גוף.

בידוד 2. שוקה קדמית

הערה: שרירים יכולים להיות מבודדים בנקודות זמן שונות לאחר הזרקת cardiotoxin פי דרישות ניסוי.

1. להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
2. רסס את hindlimbs עם אתנול 70%. במהלך ההליך, בעל החיים יכול להיות קבוע על תמיכה להחזיק אותו.
3. חותכים את העור ברמה של גיד הפרוקסימלית (מעל כף הרגל), הכנס אחד הלהבים של המספריים מתחת לעור, לחתוך את העור כלפי מעלה, לכיוון הברך. בעזרת מלקחיים, למשוך את העור ולחשוף את השריר לגמרי. מוציאים בזהירות את כל העור והשיער מאזור עניין.
4. לחסל את fascia ידי צובט לאט או חיתוך (עם הב-קצה פינצטה או עם מייקרו בסדר לנתח מספריים) בפריפריה הקיצונית של השריר בצד הנגדי של הטיביה (האיור 1B). לאחר שבור, להסיר את fascia בעדינות בעזרת פינצטה דקה-קצה; למנוע נזק לשריר הבסיסית.
   הערה: כמו עם שרירים אחרים ואיברים, ת"א מכוסית על ידי fascia (fascia העמוק של הרגל), שכבה דקה של רקמת חיבור שנמצאת עמוק מתחת לעור וזה צריך להיות מוסר לבודד לשריר הבסיסי בקלות.
5. דמיינו את גיד ת"א דיסטלי ואת גיד פושטי digitorum מעל כף הרגל, אשר מונחים זה לצד זה. הגיד של שריר פושטי digitorum Longus (EDL) ממוקם מעט מתחת גיד ת"א. הגידים של עכברים בוגרים גלויים לעין בלתי מזוינת.
6. הסר את שריר ת"א הבא באחת משתי השיטות הבאות:
   1. חותכים שני גידים עם מיקרו בסדר לנתח מספריים ולמשוך אותם לכיוון הצד הפרוקסימלי, מחזיקהg הגידים עם מלקחיים. הפרד את שני הגידים, מושך אותם בעדינות בכיוונים מנוגדים כדי להפריד את השרירים.
   2. בעזרת פינצטה דקה-קצה, להפריד את גיד ת"א דיסטלי מן גיד פושטי digitorum ידי העברת הקצה מתחת הגיד עצמו (איור 1 ג, תמונה עליונה). חלק בעדינות את פינצטה מתחת ת"א להפריד אותו מן השרירים הבסיסיים (התרשים 1C, תמונה למטה).
   3. החזק את פינצטה מתחת לשריר כדי לשמור אותו מורם מעט, לחתוך את הגיד TA, בעדינות למשוך אותו כלפי מעלה עד שרק באזור מתחת לברך מצורף (1D איור, תמונה משמאל). חותך את ת"א מתחת לברך, הוא הולך על הגבולות השרירים עם המספריים (1D איור, נכון תמונה).
      הערה: אם השריר נשאר מחובר מעט לצדדים, השתמש מיקרו בסדר לנתח מספריים כדי לעזור לנתק אותו.
      הערה: אם המלקחיים לא מתאימים בקלות מתחת ת"א,זה אפשרי כי fascia לא הוסר לחלוטין, וזה עדיין יכול להיות גלוי על גבי השריר. במקרה זה, הסר את fascia לחלוטין לפני שתמשיך.

3. טכניקת שרירים קפואה

1. מניחים כמות קטנה של מסטיק tragacanth או תרכובת הקפאת דבק דומה (למשל, טמפרטורה אופטימלית חיתוך (תרכובת OCT)) על פרוסת הפקק. לייבל פרוסה של הפקק בצד ההפוך לפני ההקפאה, במידת הצורך (איור 2 א).
2. על מנת לקבל חלקים רוחביים של השריר, להטביע את ת"א לתוך מסטיק tragacanth ידי החדרת הגיד הדיסטלי ולהשאיר על 3/4 של השריר בחוץ, והקפד יש שריר במצב מאונך ביחס הפקק (איור 2A).
3. מלאו פחית אלומיניום (לחלופין, כוס מתכת או כוס זכוכית), עם איזופנטאן. להשעות את פחית איזופנטאן בתוך LIQUI המכיל דיוארחנקן ד, שאינו מאפשר את החנקן הנוזלי להיכנס לפח.
   הערה: איזופנטאן צריך להגיע לטמפרטורה הנכונה (מ -150 ל -160 מעלות צלזיוס) במשך הקפאה אופטימלית של הרקמה. הטמפרטורה הנכונה הוא הגיע כאשר כמה חלקיקים מוצקים לבן הטופס בתחתית של פחית ואת איזופנטאן הופך צמיג מעט.
   הערה: אין להקפיא המדגם לפני ההיווצרות של החלקיקים המוצקים, כפי שהוא יכול להוביל חפצים מקפיאים. מצד שני, אם איזופנטאן הופך לגמרי מוצק, להשאיר אותו בטמפרטורת החדר עד שהוא מופשר, ולוודא כי חלקיקים לבנים וחלקם עדיין קיים.
4. בעזרת מלקחי Mixter, טובל את הפקק במהירות עם השריר לתוך איזופנטאן, שמירה על מטה ממוצבת השריר, ולוודא כדי לשחרר את הפקק כאשר הוא שקוע לחלוטין בתוך הנוזל. בדרך זו, בעוד הדגימה צפה, רק הצד ההפוך של הפקק צריך להיות גלוי בתוך הנוזל.
5. השאירו את sample ב איזופנטאן דקות 1.
6. בעזרת מלקחי Mixter (או מלקחיים דומים), לקחת את השריר לטבול אותו בחנקן נוזל 2 דקות לפחות.
7. עוטפים את דגימות בנפרד בנייר אלומיניום שכותרתו ומיד למקם אותם בקרח יבש (-70 ° C), או ישירות לאחסן אותם מקפיא -80 מעלות צלזיוס.
   הערה: לאורך כל ההליך, מצעדי 3.4 ל 3.7, זה מאוד חשוב כדי לשמור על הטמפרטורה הנכונה ולמנוע דגימות מן המפשיר (למשל, במהלך ההעברה מקפיאה -80 מעלות צלזיוס.). תוצאות הטמפרטורה עולות פשרה מבוקרת refreezing של microcrystals המים שנמצאים בתוך הרקמה, ובסופו של דבר גורם להיווצרות של חפצים או ההתמוטטות של סיבי שריר (דמיינו על סעיפי רקמות כמו חורי לבן גדולים במרכז של הסיבים).

4. cryostat חתך של שרירים קפואים

1. הגדר את t הטמפרטורה בתא cryostato -20 עד -22 ° C.
2. שים את בדל הדגימה, להב, ואת הדגימה בתא cryostat, המאפשר להם לאזן במשך 30 דקות לפחות.
3. מניחים כמות קטנה של תרכובת הקפאה (למשל, במתחם אוקטובר) על בדל הדגימה לטבול את הפקק עם הדגימה לפני מתמצק מתחם מקפיא. בינתיים, למקם את הלהב בעל להב.
4. יישר את הדגימה ואת הלהב באמצעות הברגים המצורפים כדי לכוון את בעל הדגימה עם מחזיק הלהב (תרשים 2B).
5. הגדר את עובי סעיף 10 מיקרומטר. המשך כדי לחתוך את הרקמה. עבור כל סיבוב של גלגל הכונן, בעל הדגימה מקדם מרחק מבוקר כלפי הלהב.
6. מניחים את הסעיפים בשקופית מקוטב (8 עד 10 סעיף לכל שקופית) (איור 2 ג).
7. לאחר חתך, אחסן את השקופיות ב -80 ° C.
   הערה: הדגימה ניתן לאחסן במקפיא -80 מעלות צלזיוס ולעשות בהם שימוש חוזר עבור further חתך, אם ינוהלו כהלכה ומאוחסנים.

5. מכתים היסטולוגית שיגרתי (Hematoxylin & Eosin כתם)

הערה: כתמי היסטולוגית מספר יכולים להתבצע על סעיפים שריר על פי הניתוח. כתם היסטולוגית שגרתי לניתוח מורפולוגיים morphometric הוא Hematoxylin & Eosin (H & E) כתם bichromic. Hematoxylin מכתימה את הגרעינים סגול עמוק. מכתים גרעיני הוא counterstained עם eosin (ורוד / אדום), אשר מכתים מבנים אאוזינופילית, כגון myofibers בציטופלסמה.

1. לגמרי אוויר יבש שקופיות קפוא עם חלקים במשך 10 - 15 דקות בטמפרטורת חדר, להגיש את שקופיות מגש מכתים, ולשים את מגש שוקת מכתימה.
2. כתם דקות 1 עם hematoxylin.
3. הנח את שוקת מכתים תחת סילון מים ברז חלש למדי במשך 10 דקות כדי לשטוף את hematoxylin.
4. לטבול את השקופיות עבור 5 דקות באתנול 95%, אם פתרון אלכוהוליים של eosin ישמש (לדלג tהצעד שלו במקרה של פתרון eosin מימי).
5. Counterstain דקות 1 עם פתרון eosin.
6. לשטוף עם מים לחסל פתרון eosin מוגזם.
   הערה: תזמון אופטימלי של מכתים עם או hematoxylin או eosin צריך להיות מוגדר עבור כל אצווה חדשה.
7. מייבש את הדגימות בסדרת אתנול מדורגת: 50% ו -70% (כמה שניות כל אחד). במהירות לטבול אתנול 95%, ואחריו 2 שינויים אתנול 100%, 5 דקות כל אחד.
8. נקה 2 שינויים של קסילן, כל 5 דקות או יותר. צעד זה חייב להתבצע מתחת למכסה המנוע כימי.
9. הר השקופיות עם הרכבה בינונית מבוסס קסילן, החל כמה טיפות של הרכבה בינונית בשקופית ומכסה עם coverslip. המדיום גובר יכול לחול גם על coverslip ואת coverslip לשים בשקופית.
   1. הימנע ויוצרים בועות אוויר בין שקופיות coverslip. כדי לחסל בועות אוויר, לשמור את השקופית אנכית (לאחר ההרכבה) ו לסחוט את מו העודףבינוני unting ובועות אוויר על ידי הלחיצה בעדינות על coverslip עם מלקחיים בוטים (או כלי קהה דומה).
10. שמור את השקופיות מתחת למכסה המנוע במשך כמה שעות או למשך הלילה כדי לאפשר קסילן להתאדות לחלוטין לפני שתמשיך ניתוח.
11. לבצע את הניתוח המורפולוגי morphometric של H & E מוכתמים סעיפי התחדשות שריר באמצעות תמונות הסדרה שאינן חופפות של לפחות קטע שריר אחד שלם לכל עכבר. צלמו תמונות עם מיקרוסקופ שדה בהיר, עם הגדלה 20X.
    הערה: ישנו מספר קטן של 5 עכברים מומלץ להשיג מובהקות סטטיסטית של המדידות.
    הערה: תוכנה לניתוח תמונה זמינה למטרה זו, כגון ImageJ תוכנה להורדה בחינם (http://imagej.nih.gov/ij/).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

צביעת H & E מאפשרת ההערכה של המורפולוגיה של תהליך ההתחדשות בנקודות זמן ספציפי במהלך רגנרציה שרירי שלד. איור 3 מציג את הניתוח כמובן הזמן שבוצע על שרירי ת"א נפצעו של עכברי סוג ברים. שרירים בודדו בבית 3, 7, 15, ו -30 ימים לאחר הזרקת CTX, כמו schematized

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן אנו מתארים פרוטוקול לגרום לפגיעה חריפה בשרירי השלד (כלומר, זריקה תוך שרירית של CTX). זה נעשה שימוש נרחב ככלי רב עוצמה כדי ללמוד את הדינמיקה של התחדשות שריר השלד in vivo. הזרקת CTX גורמת לניוון של סיבי שריר, אשר נגרם על ידי שלילת הקוטביות של sarcolemma ואת ההתכווצות של...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica	SIGMA ALDRICH	C9759
Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL	BD	324826
Tragacanth Gum	MP BIOMEDICALS,LLC	104792
2-Methylbutane (Isopentane)	SIGMA ALDRICH	78-78-4.
OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat	Bio-optica	05-9801
Feather Microtome Blade S35	Bio-optica	01-S35
Glass Slide Superfrost Plus	Menzel-Gläser	09-OPLUS
Dumon #5 Mirror Finish Forceps	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	11251-23
Scissors Straight Sharp/Sharp	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15024-10
Scissors Noyes Straight	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15012-12
Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	14094-11
Eukitt	Bio-optica	09-00100
Slide Coverslip	BIOSIGMA	VBS651
Xylene	SIGMA ALDRICH	214736
Ethanol 100%	sigma-Aldrich	02860-2.5L
Hematoxyline	J.T. BAKER	3873
Eosin	SIGMA ALDRICH	HT110116
Cryostat	LEICA	CM3050 S