Индукция Острый скелетных мышц регенерации путем инъекций Cardiotoxin

Резюме

Эта рукопись описывает подробный протокол, чтобы вызвать острый скелетной регенерации мышц у взрослых мышей и последующих манипуляций мышц, таких как рассечение, замораживание, разделка, рутинного окрашивания и мышечное волокно поперечного сечения анализа площади.

Аннотация

Скелетная регенерации мышц является физиологическим процессом, который происходит у взрослых скелетных мышц в ответ на повреждение или болезнь. Острая травма индуцированных скелетных мышц регенерации является широко используемым, мощная модель системы для изучения событий, участвующих в регенерации мышц, а также механизмов и различных игроков. Действительно, детальное знание этого процесса имеет важное значение для лучшего понимания патологических состояний, которые приводят к скелетной мышечной дегенерацией, и это помогает в определении новых целевых терапевтических стратегий. Настоящая работа описывает подробную и воспроизводимый протокол, чтобы вызвать острый скелетной регенерации мышц у мышей через одну внутримышечной инъекции cardiotoxin (CTX). CTX принадлежит к семейству змеиного яда токсинов и вызывает миолиза из мышечных волокон, которые в конечном итоге вызывает события регенерации. Динамика скелетной мышечной регенерации оценивали с помощью гистологического анализа срезов мышц. Протокол такжеиллюстрирует экспериментальные процедуры вскрытия, замораживания и сокращения мышц передней большеберцовой, а также рутинное окрашивание Hematoxylin и эозином, который широко используется для последующего морфологического и морфометрического анализа.

Введение

Млекопитающим взрослых скелетных мышц образуются группами fascicules многоядерные мышечные клетки (миофибриллы), которые являются специализированными для сокращения. Каждый мышечное волокно представляет собой продолговатый синцитиально, окруженный сарколеммой (плазматической мембраны) и содержащие миофибрилл, которые состоят из регулярно и многократно организованных сократительных белков (актина и миозина). Во взрослой жизни и в состоянии покоя, скелетные мышцы имеют очень низкий оборот их миоядер ^1; В самом деле, миоядер, которые расположены на периферии мышечное волокно, под сарколемму, арестовываются в фазе G0 клеточного цикла и не способны пролиферировать ^1,2.

Скелетные мышцы имеют своеобразную способность регенерировать после повреждения, достигая гомеостаза после нескольких событий ремоделирование тканей, которые тесно связаны друг с другом. После острого повреждения или травмы, дегенерации индуцируется, с последующим процессам регенерациикоторые включают различные клеточные популяции, в том числе постоянного населения мышечных клеток, сателлитные клетки (SCS). Действительно, при отсутствии каких - либо внешних стимулов, сателлитные клетки находятся в состоянии покоя и расположены в специализированной нише между сарколеммой и базальной пластинки ^3,4. После травмы или болезни, ГКС активизируются, пролиферируют, мигрируют в поврежденные участки, и в конечном итоге дифференцироваться, давая начало формирующихся миофибрилл ^5. Активированные Стволовые установить перекрестные помехи с различных клеточных популяций, в основном воспалительные клетки, которые набираются в месте травмы ^6-8. Это наводок позволяет клеткам следовать регулируемую парадигму , с помощью которых молекулярные сигналов возбуждения структурных изменений, в конечном итоге приводит к гомеостаза ^9. Кроме того, ГКС, воспалительных и интерстициальных клеток, кровеносных сосудов процессов, а также повторно иннервации событий также участвуют, действуя согласованно, чтобы исправить это высокоорганизованная и SСтруктура специализированном.

Существует большой интерес к изучению различных аспектов скелетной мышечной регенерации, не только понять физиологию мышцы, но и улучшить терапевтические стратегии, которые требуют более глубокого знания всего процесса. Несколько экспериментальных подходов в настоящее время доступны для изучения личности и функции различных клеточных популяций, сигнальных путей и молекулярных механизмов, участвующих. Мышиные модели острого повреждения представляют собой мощный инструмент для исследования многих аспектов этого процесса. Различные часто используемые методы , чтобы вызвать острое повреждение мышц позволяют исследователям следить за процессом регенерации в естественных условиях, от самых ранних этапов до конца процесса. Этот протокол описывает шаги из внутримышечной инъекции змеиного яда-производного cardiotoxin (CTX), который вызывает миолиза и запускает процесс регенерации, вплоть до анализа образцов ткани. После CTX инъекции, милиCE может быть принесена в жертву в различные моменты времени в зависимости от экспериментальных условий, а скелетные мышцы могут быть разрезаны и обработаны для дальнейшего анализа. Наконец, мы опишем протокол окрашивания срезов тканей для выполнения морфологических наблюдений и основные количественные анализы. Этот протокол позволяет для исследования острой скелетной мышечной регенерации в естественных условиях в высокой воспроизводимостью ^10.

протокол

Все эксперименты проводились в строгом соответствии с руководящими принципами для институциональных исследований на животных и одобрены Департаментом здравоохранения, охраны здоровья животных, питания и продовольственной безопасности итальянского Министерства здравоохранения в соответствии с законом о экспериментов на животных. Шейки процедуры дислокационные могут варьироваться в зависимости от одного учреждения к другому на основе IACUC или ее эквивалента требований.

1. Cardiotoxin инъекция в мышцы передней большеберцовой

1. Подготовьте 10 мкМ рабочий раствор cardiotoxin (CTX) путем разбавления cardiotoxin маточного раствора в стерильном забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), или в воде, перед началом процедуры.
   Примечание: СТХ растворим в воде при концентрации 1 мг / мл. Приготовьте 70 мкМ исходного раствора. Алиготе и хранить при температуре -20 ° C. СТХ используется для этого протокола представляет собой смесь cardiotoxins, имеющих молекулярную массу приблизительно 7000 Да.
   ВНИМАНИЕ: Предлагается носитьдвойные перчатки, маска, гигиена и защитные очки (в качестве альтернативы защитные очки, рекомендуется работать под капотом) и быть очень осторожным, чтобы избежать любого контакта с раствором, даже если разводили.
2. Обезболить мышей путем внутрибрюшинной инъекции кетамина и ксилазина (80 мг / кг и 10 мг / кг массы тела), или из другого одобренного имеющегося анестетика.
3. С помощью мыши лицевой стороной вверх, опрыскивать задние конечности с 70% -ным этанолом. Чтобы визуализировать точное местоположение передней большеберцовой (TA) мышцы, с помощью скальпеля, вырезать волосы прочь на передней части голени, под коленом.
   Примечание: Эта мышца TA возникает из проксимального тела большеберцовой кости, спускаясь сбоку от кости и заканчивая лодыжкой. Его длинная сухожилие проходит в ногу через лодыжку (см рисунок 1А).
4. Draw ~ 100 мкл раствора в шприц, потянув поршень назад медленно.
5. Удалите пузырьки воздуха, держа шприц вертикально (с иглой вверх). Осторожно потяните поршень вниз и нажмите на сторону шприца, чтобы помочь пузырьки воздуха, прикрепленные к внутренней части трубы приходят вверх. Медленно нажмите на поршень, чтобы высвободить большие воздушные пузырьки. Несколько капель жидкости выйдет иглу. На данный момент, убедитесь, чтобы забрать жидкость снова в трубу, а не разгонять, учитывая токсичность cardiotoxin.
6. Вывод раствор в шприц, пока желаемая доза не будет достигнута. Вводят 20 мкл раствора CTX для каждой мышцы TA.
7. Вставьте иглу в центре ТП, следуя позиции Tibia кости в качестве руководства, из сухожилия в направлении колена. Поскольку ТП представляет собой тонкую ткань, выполняют инъекцию , не вдаваясь слишком глубоко (вставить иглу глубоко 2/3 мм, при приблизительно 10 ° до 20 °) угол, и избежать выхода за пределы самого (рис 1А) мышцы.
8. Не вынимайте иглу сразу после инъекции, но не менее 2 - 3 сек, чтобы предотвратить утечкувозраст CTX падает из мышцы.
9. После процедуры поместить клетку на подогретую тарелку (при 37 ° С) до тех пор, пока у мышей бодрствуем, так как анестезирующего средства и этанол использовали снижения температуры тела.

2. Изоляция передней большеберцовой

Примечание: Мышцы могут быть выделены в различные моменты времени после инъекции cardiotoxin в соответствии с экспериментальным требованиям.

1. Жертвоприношение мышь путем смещения шейных позвонков.
2. Спрей задних конечностей с 70% -ным этанолом. Во время процедуры животное может быть прикреплена к опоре, чтобы держать его вниз.
3. Порезать кожу на уровне проксимального сухожилия (выше стопы), вставьте один из лезвий ножниц под кожей, и разрезают кожу вверх, в направлении колена. С помощью щипцов, подтянуть кожу и обнажить мышцы полностью. Осторожно снимите кожу и волосы от области интереса.
4. Устранить фасции медленно щипать или резки (с гов-кончике пинцета или с мелкими микро анатомические ножницы) крайнюю периферию мышцы на противоположной стороне большеберцовой кости (рис 1б). После того, как сломана, аккуратно удалите облицовку с помощью тонких наконечников пинцета; Во избежание повреждения основные мышцы.
   Примечание: Как и в случае других мышц и органов, ТП покрыта фасцией (глубокой фасции голени), тонкий лист соединительной ткани , которая лежит глубоко под кожей , и который должен быть удален , чтобы легко изолировать основные мышцы.
5. Визуализируйте дистального TA сухожилие и сухожилие разгибателя выше стопы, которые смежное. Сухожилие разгибатель большого пальца (EDL) мышце расположена чуть ниже сухожилие TA. Сухожилиями взрослых мышей видны невооруженным глазом.
6. Удалите мышцы TA следующую одну из двух следующих методов:
   1. Отрезать обе жилы с мелким микро рассекает ножницы и тянуть их к ближней стороне, Holdinг сухожилия с пинцетом. Разделяют два сухожилия, потянув их мягко в противоположных направлениях, чтобы отделить мышцы.
   2. С помощью тонких наконечников пинцета, отделить дистального TA сухожилие от разгибатель сухожилия, пропуская кончик ниже самого сухожилия (рис 1C, верхняя картинка). Аккуратно вставьте пинцет ниже ТА , чтобы отделить его от основных мышц (рис 1C, нижний рисунок).
   3. Удерживая пинцет под мышцу , чтобы держать его слегка приподняты, перерезал сухожилие TA, и осторожно потяните ее вверх , пока только область ниже колена прилагается (рис 1D, показано на рисунке слева). Вырезать TA ниже колена, после края мышцы с ножницами (рис 1D, фото справа).
      Примечание: Если мышца остается слегка прикреплены к бокам, с помощью тонкой микро рассекает ножницы , чтобы помочь отделить его.
      Примечание: Если пинцет не легко помещается ниже ТА,возможно , что фасция не была полностью удалена, и она все еще может быть видна на верхней части мышцы. В этом случае полностью удалить фасцию , прежде чем продолжить.

3. Свежезамороженная Мышцы Техника

1. Поместите небольшое количество трагакант или аналогичного клеевой замораживании соединения (например, оптимальная температуры резания (ОКТ) соединения) на срез пробки. Добавьте ломтик в пробку на обратной стороне перед замораживанием, в случае необходимости (рис 2А).
2. Для того чтобы получить поперечные срезы мышцы, тонут ТА в трагакант, вставив дистального сухожилие и оставив примерно 3/4 мышцы снаружи, убедившись , что есть мышцы в перпендикулярном положении по отношению к пробке (рис 2А).
3. Заполните алюминиевую банку (в качестве альтернативы, металлическая чаша или стеклянный стакан), с изопентана. Приостановка банку изопентана в содержащей отмера жидкос Дьюараd азота, не позволяя жидкий азот, чтобы войти в банку.
   Примечание: изопентан необходимо достичь нужной температуры (от -150 до -160 ° C) для оптимального замораживания ткани. Правильная температура достигается, когда некоторые белые твердые частицы образуют в нижней части банки и изопентана становится слегка вязкая.
   Примечание: Не замораживать образец до образования твердых частиц, так как это может привести к замораживанию артефактов. С другой стороны, если изопентана становится полностью твердым, оставьте его при комнатной температуре до тех пор, пока не будет оттаивают, убедившись, что некоторые белые частицы все еще присутствуют.
4. Использование Mixter щипцов, быстро окунуть пробку мышцы в изопентан, держа мышцы расположены вниз, и убедитесь в том, чтобы освободить пробку, когда он полностью погружен в жидкость. Таким образом, в то время как образец плавает, только обратная сторона пробки должна быть видна в жидкости.
5. Оставьте саmple в изопентана в течение 1 мин.
6. Использование Mixter пинцетом (или аналогичных пинцетом), возьмите мышцы и погрузить его в жидкий азот в течение по крайней мере 2 мин.
7. Оберните образцы индивидуально в меченого алюминиевой фольги и сразу же поместить их в сухом льду (-70 ° C), или непосредственно хранить их в -80 ° C морозильнике.
   Примечание: На протяжении всей процедуры, от шагов 3.4 до 3.7, крайне важно для поддержания нужной температуры и предотвратить образцы таянии (например, во время передачи в -80 ° C морозильнике.). Возрастающие температуры приводит к неконтролируемому оттаиванием и повторным замерзанием водных микрокристаллов, которые присутствуют в тканях и в конечном итоге приводит к образованию артефактов, или разрушение мышечных волокон (визуализируется на участках ткани в виде больших белых дыр в центре волокна).

4. криостат секционирования мерзлых Мышцы

1. Установите камеру криостата температуры ТO от -20 до -22 ° C.
2. Поместите образец окурок, лезвие и образца в камере криостата, что позволяет им уравновешиваться в течение не менее 30 мин.
3. Поместите небольшое количество замерзающей соединения (например, соединение) Октябре на образец заглушкой и погрузить пробку образца перед морозильных соединения затвердевает. В то же время, поместите лезвие в держателе лезвий.
4. Совместите образец и лезвие с помощью прилагаемых винта , чтобы ориентировать держатель образца с держателем ножа (Рисунок 2B).
5. Установить толщину профиля до 10 мкм. Продолжайте, чтобы разрезать ткань. При каждом повороте приводного колеса, держатель образца продвигает контролируемое расстояние в сторону ножа.
6. Поместите секции на поляризованном слайде ( от 8 до 10 раздела на слайд) (рис 2С).
7. После секционирования, хранить слайды при температуре -80 ° C.
   Примечание: Образец можно хранить в морозильной камере C -80 ° и повторно использовать для furtheг секционирования, при правильном обращении и хранении.

5. гистологического Окрашивание (гематоксилином и эозином Пятна)

Примечание: Несколько гистологические пятна могут быть выполнены на участках мышц в соответствии с анализом. Рутинная гистологическое пятно для морфологического и морфометрического анализа является гематоксилином и эозином (H & E) bichromic пятно. Гематоксилин окрашивает ядер глубокий фиолетовый. Ядерное окрашивание контрастному эозином (розовый / красный), который окрашивает эозинофильные структуры, такие, как миофибрилл в цитоплазме.

1. Полностью воздушно-сухие замороженные слайды с разделами в течение 10 - 15 мин при комнатной температуре, подать слайдов в окрашивании лоток и поставить лоток в окрашивании корыта.
2. Окрашивают в течение 1 мин с гематоксилином.
3. Положите окрашивания корыто под довольно слабой струей водопроводной воды в течение 10 мин, чтобы смыть гематоксилином.
4. Погрузите слайды в течение 5 мин в 95% этаноле, если будет использоваться спиртовой раствор эозина (пропустить тего шаг в случае водного раствора эозина).
5. Проводят контрастное в течение 1 мин с эозином раствором.
6. Промыть водой для устранения чрезмерного раствора эозин.
   Примечание: Оптимальные сроки окрашивания либо с гематоксилином или эозином должны быть определены для каждой новой партии.
7. Дегидрировать образцов в серии градуированных этанола: 50% и 70% (несколько секунд каждый). Быстро погружают в 95% этаноле, а затем 2 изменений в 100% этанола, 5 мин каждый.
8. Ясно в 2 смены ксилола, каждые 5 минут или дольше. Этот шаг должен выполняться в соответствии с химическим капотом.
9. Установите слайды с ксилолом на основе монтажной среды, применяя несколько капель монтажа среды на слайде и покрытие с покровным. Установочная среда также может быть применен к покровным и покровным положить на слайде.
   1. Избегайте образования пузырьков воздуха между предметным и покровным. Для удаления пузырьков воздуха, держать скольжение по вертикали (после монтажа) и выжмите избыток мохота среда и пузырьки воздуха, осторожно нажимая на покровное с тупыми щипцами (или подобным тупым инструментом).
10. Храните слайды под капотом в течение нескольких часов или на ночь, чтобы позволить ксилол полностью испариться, прежде чем перейти к анализу.
11. Выполните морфологического и морфометрического анализа H & E-окрашенных регенерирующих участков мышц с использованием неперекрывающихся последовательных изображений, по меньшей мере, одного целого раздела мышц на мышь. Захват изображений с ярко-поле микроскопа с 20-кратным увеличением.
    Примечание: Минимальное количество 5 мышей рекомендуется для получения статистической значимости результатов измерений.
    Примечание: программное обеспечение для анализа изображений доступен для этой цели, такие как бесплатно скачать программное обеспечение ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).

Результаты

Н & Е окрашивание позволяет для оценки морфологии процесса регенерации в определенные моменты времени в течение скелетной мышечной регенерации. Рисунок 3 показывает анализ течения времени проводили на поврежденных мышц TA мышей дикого типа. Мышцы были изол...

Обсуждение

Здесь мы опишем протокол , чтобы вызвать острое поражение в скелетных мышцах (например, внутримышечной инъекции CTX). Он широко используется в качестве мощного инструмента для изучения динамики скелетной мышечной регенерации в естественных условиях. СТХ инъекция индуцирует д?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica	SIGMA ALDRICH	C9759
Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL	BD	324826
Tragacanth Gum	MP BIOMEDICALS,LLC	104792
2-Methylbutane (Isopentane)	SIGMA ALDRICH	78-78-4.
OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat	Bio-optica	05-9801
Feather Microtome Blade S35	Bio-optica	01-S35
Glass Slide Superfrost Plus	Menzel-Gläser	09-OPLUS
Dumon #5 Mirror Finish Forceps	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	11251-23
Scissors Straight Sharp/Sharp	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15024-10
Scissors Noyes Straight	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15012-12
Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	14094-11
Eukitt	Bio-optica	09-00100
Slide Coverslip	BIOSIGMA	VBS651
Xylene	SIGMA ALDRICH	214736
Ethanol 100%	sigma-Aldrich	02860-2.5L
Hematoxyline	J.T. BAKER	3873
Eosin	SIGMA ALDRICH	HT110116
Cryostat	LEICA	CM3050 S