Die Induktion von Akute Skelettmuskelregeneration durch Cardio Injection

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll akuten Skelettmuskelregeneration in erwachsenen Mäusen und nachfolgende Manipulationen der Muskeln zu induzieren, wie Dissektion, Einfrieren, Schneiden, Routine-Färbung und myofiber Querschnittsfläche Analyse.

Zusammenfassung

Skelettmuskelregeneration ist ein physiologischer Prozess, der in der Erwachsenenskelettmuskeln in Reaktion auf eine Verletzung oder Erkrankung auftritt. Akute Verletzungen induzierte Skelettmuskelregeneration ist eine weit verbreitete, leistungsfähiges Modellsystem die Ereignisse in der Regeneration der Muskulatur sowie die Mechanismen und andere Akteure zu studieren. Tatsächlich ist eine genaue Kenntnis dieses Prozesses wichtig für ein besseres Verständnis der pathologischen Zustände, die Skelettmuskeldegeneration führen, und es hilft bei der neuen gezielte Therapiestrategien zu identifizieren. Die vorliegende Arbeit beschreibt eine detaillierte und reproduzierbare Protokoll akute Regeneration der Skelettmuskulatur bei Mäusen durch eine einzige intramuskuläre Injektion von Cardio (CTX) zu induzieren. CTX, gehört zur Familie der Toxine venom snake und verursacht Myolyse von Muskelfasern, die schließlich die Regenerationsereignisse auslöst. Die Dynamik der Skelettmuskelregeneration wird durch histologische Analyse von Muskelpartien ausgewertet. Das Protokoll auchzeigt die experimentellen Verfahren zum Präparieren, Einfrieren und die Tibialis Anterior Muskel, sowie die Routine Hämatoxylin & Eosin-Färbung Schneiden, die häufig für nachfolgende morphologische und morphometrische Analyse verwendet wird.

Einleitung

Mammalian erwachsenen Skelettmuskeln werden durch Gruppen von Heften von mehrkernigen Muskelzellen (Muskelfasern) gebildet, die für die Kontraktion spezialisiert sind. Jede myofiber ist ein längliches Syncytium, durch die Sarkolemm (plasmatische Membran) umgeben und enthaltend Myofibrillen, die aus regelmäßig und wiederholt organisiert kontraktilen Proteine ​​(Aktin und Myosin-Filamente) hergestellt sind. Im Erwachsenenleben und Ruhebedingungen, haben die Skelettmuskulatur eine sehr geringe Fluktuation ihrer myonuclei ^1; Tatsächlich sind die myonuclei, die an der Peripherie des myofiber angeordnet sind, unter dem Sarkolemm, sind in der G0 - Phase des Zellzyklus arretiert und sind unfähig ^1,2 zu proliferieren.

Skelettmuskeln haben die besondere Fähigkeit, nach einer Schädigung zu regenerieren, nach mehreren Ereignissen Geweberemodellierung Erreichen Homöostase, die miteinander fest verbunden sind. Nach einer akuten Verletzung oder ein Trauma wird Degeneration durch Regenerationsprozesse induziert, gefolgtdie verschiedenen Zellpopulationen beteiligt, einer Wohnbevölkerung von Muskelzellen einschließlich, die Satellitenzellen (SCs). Tatsächlich in Abwesenheit jeglicher Reize aus der Umwelt sind die Satellitenzellen in einem Ruhezustand und in einer Nische zwischen dem sarcolemma und der Basalmembran ^3,4 liegt. Nach einer Verletzung oder Krankheit, aktiviert SCs werden, vermehren sich , wandern in die beschädigten Bereiche und schließlich unterscheiden, was zu neu bildenden Muskelfasern ^5. Aktivierte SCs etablieren Cross-Talk mit verschiedenen Zellpopulationen, vor allem Entzündungszellen, die ^6-8 in der Stelle des Traumas rekrutiert werden. Dieses Übersprechen ermöglicht es den Zellen einen geregelten Paradigma folgen , durch welche molekularen Signale strukturelle Modifikationen fahren, schließlich ⁹ bis Homöostase führt. Neben SCs, Entzündungs- und interstitiellen Zellen, angiogene Prozesse und Reinnervation Ereignisse sind ebenfalls beteiligt, in koordinierter Weise wirken diese hoch organisiert zu reparieren und specialized Struktur.

Es besteht großes Interesse verschiedene Aspekte der Skelettmuskelregeneration bei der Untersuchung, nicht nur die Physiologie des Muskels zu verstehen, sondern auch therapeutische Strategien zu verbessern, die tiefere Kenntnis des gesamten Prozesses erfordern. Mehrere experimentelle Ansätze sind derzeit beteiligt, die Identität und Funktion der verschiedenen Zellpopulationen, die Signalwege, und die molekularen Mechanismen zu untersuchen. Mausmodellen der akuten Verletzung stellen ein leistungsfähiges Werkzeug viele Aspekte dieses Prozesses zu untersuchen. Verschiedene Techniken , die üblicherweise verwendet , um akute Muskelschädigung zu induzieren den Forschern ermöglichen , den Regenerationsprozess in vivo zu folgen, von den sehr frühen Stadien bis zum Ende des Prozesses. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte von der intramuskulären Injektion von Schlangengift abgeleitetes Cardio (CTX), die Myolyse und löst den Regenerationsprozess induziert, bis zur Analyse von Gewebeproben. Nach CTX Injektion, mice kann zu unterschiedlichen Zeitpunkten je nach Versuchsanforderungen geopfert werden, und die Skelettmuskeln können für die weitere Analyse herausgeschnitten und bearbeitet. Schließlich beschreiben wir das Färbungsprotokoll von Gewebeschnitten auf morphologische Beobachtungen und grundlegende quantitative Analysen durchführen. Dieses Protokoll ermöglicht die Studie der akuten Skelettmuskelregeneration in vivo in einer sehr reproduzierbar ^10.

Protokoll

Alle Versuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts für Tierforschung und genehmigt durch das Ministerium für öffentliche Gesundheit, Tiergesundheit, Ernährung und Lebensmittelsicherheit des italienischen Gesundheitsministeriums in Übereinstimmung mit dem Gesetz über Tierversuche durchgeführt. Genickbruch Verfahren von Institution zu Institution basiert auf IACUC oder eine gleichwertige Anforderungen variieren.

1. Cardio Injektion in den M. tibialis anterior

1. Bereiten Sie eine 10 & mgr; M Arbeitslösung von Cardio (CTX) durch die Cardiostammlösung in sterilen Phosphat-gepufferte Verdünnung Saline (PBS) oder in Wasser, bevor Sie den Vorgang starten.
   Anmerkung: CTX löslich ist in Wasser bei 1 mg / mL. Bereiten Sie eine 70 & mgr; M Stammlösung. Aliquotieren und bei -20 ° C. CTX für dieses Protokoll verwendet, ist eine Mischung aus Cardio ein Molekulargewicht von etwa 7.000 Da.
   ACHTUNG: Es wird vorgeschlagen, zu tragenDoppel Handschuhe, eine Hygienemaske und Schutzbrille (alternativ zu Schutzbrille wird empfohlen, unter einer Haube zu arbeiten) und sehr vorsichtig sein, jeden Kontakt mit der Lösung zu vermeiden, auch wenn verdünnt.
2. Anästhesieren die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Ketamin und Xylazin (80 mg / kg und 10 mg / kg Körpermasse) oder einem anderen Anästhetikum zur Verfügung zugelassen.
3. Mit dem Gesicht nach oben Maus, sprühen die Hinterbeine mit 70% Ethanol. Um die genaue Lage des Tibialis Anterior (TA) Muskel, mit Hilfe eines Skalpells sichtbar zu machen, schneiden das Haar am vorderen Teil des Unterschenkels, unter dem Knie.
   Hinweis: Der TA Muskel von dem proximalen Körper der Tibia entsteht, lateral zum Knochen hinunter und am Knöchel endet. Seine lange Sehne erstreckt sich in den Fuß über die Knöchel (siehe 1A).
4. Zeichnen Sie ~ 100 & mgr; l der Lösung in die Spritze durch den Kolben langsam zurück ziehen.
5. Luftblasen entfernen, halten Sie die Spritze aufrecht (mit der Nadel nach oben). kommen nach oben ziehen Sie den Kolben leicht nach unten und tippen Sie auf die Seite der Spritze befestigt Luftblasen auf den inneren Teil des Rohres zu helfen. Langsam drücken Sie den Kolben große Luftblasen zu entfernen. Ein paar Tropfen Flüssigkeit wird die Nadel herauskommen. An dieser Stelle stellen Sie sicher, um die Flüssigkeit zu holen wieder in das Rohr und nicht zerstreuen es, angesichts der Toxizität von Cardio.
6. Zurückziehen der Lösung in der Spritze, bis die gewünschte Dosis erreicht ist. Injizieren von 20 & mgr; l Lösung für jeden CTX TA Muskel.
7. Führen Sie die Nadel in der Mitte des TA, indem Sie die Position der Tibia Knochen als Orientierungshilfe, von der Sehne zum Knie. Da die TA ein dünnes Gewebe ist, führen Sie die Injektion ohne zu tief gehen (legen Sie die Nadel 2/3 mm tief, bei etwa 10 ° bis 20 ° Winkel), und vermeiden Sie über den Muskel selbst (Abbildung 1A) gehen.
8. Ziehen Sie nicht die Nadel unmittelbar nach der Injektion, sondern warten, 2 - 3 s Leck zu verhindernAlter von CTX Tropfen aus dem Muskel.
9. Nach dem Eingriff, legen Sie den Käfig auf einer beheizten Platte (bei 37 ° C), bis die Mäuse seit der Narkose wach sind und die verwendete Ethanol Körpertemperatur reduzieren.

2. Vorderer Schienbein Isolation

Hinweis: Die Muskeln können nach Versuchsanforderungen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion Cardio isoliert werden.

1. Opfere die Maus durch Genickbruch.
2. Sprühen Sie die hinteren Gliedmaßen mit 70% Ethanol. Während des Verfahrens kann das Tier auf einem Träger befestigt werden, um es zu halten.
3. Schneiden Sie die Haut auf der Ebene des proximalen Sehne (oberhalb des Fußes), legen Sie eine der Klingen der Schere unter der Haut, und schneiden Sie die Haut nach oben in Richtung des Knies. Mit Hilfe einer Pinzette, ziehen die Haut und den Muskel vollständig aussetzen. Entfernen Sie vorsichtig die gesamte Haut und die Haare aus dem Bereich von Interesse.
4. Beseitigen Sie die Blende durch langsames Kneifen oder Schneiden (mit thin-Spitze Pinzette oder mit feinen Mikro Schere) , um den extremen Peripherie des Muskels auf der gegenüberliegenden Seite der Tibia (Abbildung 1B) seziert. Einmal gebrochen, entfernen Sie die Blende mit Hilfe von dünnen Spitze Pinzette; vermeiden, dass die darunter liegende Muskulatur zu beschädigen.
   Hinweis: Wie bei anderen Muskeln und Organen wird die TA abgedeckt durch Faszie (tiefe Faszie des Beines), eine dünne Schicht aus Bindegewebe , das tief unter der Haut liegt und dass muss entfernt werden , um leicht die darunter liegende Muskulatur zu isolieren.
5. Visualisieren Sie die distale TA Sehne und die extensor digitorum-Sehne oberhalb des Fußes, die nebeneinander angeordnet sind. Die Sehne des Extensor communis digitorum (EDL) Muskel leicht unter dem TA Sehne entfernt. Sehnen adulter Mäuse sind mit bloßem Auge.
6. Entfernen Sie die TA Muskel finden Sie eines der beiden folgenden Techniken:
   1. Schneiden Sie beide Sehnen mit feinen Mikroschere sezieren und ziehen sie in Richtung der proximalen Seite, Holding die Sehnen mit einer Pinzette. Trennen Sie die beiden Sehnen, ziehen Sie sie vorsichtig in entgegengesetzte Richtungen, um die Muskeln zu trennen.
   2. Mit Hilfe von Dünn Spitze Pinzette, trennen Sie die distale TA Sehne vom extensor digitorum - Sehne durch die Spitze unterhalb der Sehne vorbei selbst (1C, oberes Bild). Schieben Sie die Pinzette unterhalb der TA aus den darunter liegenden Muskeln (1C, Bild unten) zu trennen.
   3. Halten Sie die Pinzette unter den Muskel zu halten , leicht erhöht, schneiden Sie die TA - Sehne und vorsichtig nach oben ziehen , bis nur noch der Bereich unterhalb des Knies befestigt ist (Abbildung 1D, linkes Bild). Schneiden Sie die TA unter dem Knie, im Anschluss an die Kante des Muskels mit der Schere (1D, rechtes Bild).
      Hinweis: Wenn der Muskel leicht an den Seiten befestigt bleibt, benutzen feine Mikro Schere Sezieren es zu helfen , zu lösen.
      Hinweis: Wenn die Zange nicht leicht unterhalb der TA passen,es ist möglich , dass die Faszie nicht vollständig entfernt worden ist , und es könnte immer noch auf dem Muskel sichtbar. In diesem Fall vollständig zu entfernen die Faszie , bevor Sie fortfahren.

3. frisch gefroren Muskel-Technik

1. Legen Sie eine kleine Menge von Tragant oder einem ähnlichen Klebstoff Einfrieren Verbindung (zB optimale Schnitt Temperatur (OCT) Verbindung) auf einer Scheibe Kork. Beschriften Sie die Scheibe der Korken auf der Rückseite vor dem Einfrieren, falls erforderlich (2A).
2. Um Querschnitte des Muskels zu erhalten, die in den TA Tragantgummi sinken durch das distale Sehne Einsetzen und außen etwa 3/4 des Muskels zu verlassen, um sicherzustellen , den Muskel in einer senkrechten Position in Bezug auf den Kork zu haben (Abbildung 2A).
3. Füllen Sie eine Aluminiumdose (alternativ eine Metallschale oder ein Becherglas), mit Isopentan. Hängen Sie die Dose Isopentan in einem Dewar-enthaltenden LIQUId Stickstoff, nicht so dass der flüssige Stickstoff in die Dose zu öffnen.
   Anmerkung: Isopentane die richtige Temperatur zu erreichen muss (von -150 bis -160 ° C) für eine optimale Gefrieren des Gewebes. Die richtige Temperatur erreicht ist, wenn einige weiße feste Partikel am Boden der Dose bilden und das Isopentan wird leicht viskos.
   Hinweis: Die Probe nicht einfrieren vor der Bildung der festen Teilchen, wie es das Einfrieren Artefakte führen kann. Auf der anderen Seite, wenn die Isopentan vollständig fest wird, lassen Sie es bei Raumtemperatur, bis es aufgetaut ist, um sicherzustellen, dass einige weiße Partikel immer noch vorhanden sind.
4. Mit Mixter Zange, tauchen schnell den Korken mit dem Muskel in die Isopentan, die Muskel positioniert nach unten zu halten, und stellen Sie sicher, den Korken zu lösen, wenn es vollständig in die Flüssigkeit eingetaucht ist. Auf diese Weise wird, während die Probe schwebt, wird nur die Rückseite des Korkens sollte in der Flüssigkeit sichtbar.
5. Lassen Sie das sample im Isopentan für 1 min.
6. Mit Mixter Zange (oder ähnliche Zange), nehmen Sie die Muskeln und tauchen sie in flüssigem Stickstoff für mindestens 2 min.
7. Wickeln Sie die Proben einzeln in beschrifteten Aluminiumfolie und sofort legen Sie sie in Trockeneis (-70 ° C), oder direkt speichern sie in einem -80 ° C Gefrierschrank.
   Anmerkung: Während des gesamten Verfahrens aus den Schritten 3,4-3,7, ist es äußerst wichtig ist , die richtige Temperatur zu erhalten und die Proben aus dem Auftauen zu verhindern (beispielsweise während der Übertragung auf die -80 ° C Gefrierschrank.). Die steigende Temperatur führt zu unkontrollierter Auftauen und Wiedereinfrieren der Wasser-Mikrokristalle, die in dem Gewebe vorhanden sind, und schließlich bewirkt die Bildung von Artefakten oder den Abbau von Muskelfasern (auf den Gewebeschnitten als große weiße Löcher in der Mitte der Faser sichtbar).

4. Kryostat Sectioning of Frozen Muskeln

1. Stellen Sie die Kryostatkammer Temperatur to -20 bis -22 ° C.
2. Setzen Sie den Proben Stummel, die Klinge und die Probe in der Kryostatkammer, so dass sie für mindestens 30 min äquilibrieren.
3. Legen Sie eine kleine Menge des Einfrierens Verbindung (zB OCT - Verbindung) auf dem Proben Stummel und tauchen Sie den Korken mit der Probe vor dem Einfrieren Verbindung verfestigt. In der Zwischenzeit setzen die Klinge in den Klingenhalter.
4. Richten Sie die Probe und die Klinge mit den mitgelieferten Schrauben den Probenhalter mit dem Klingenhalter (2B) zu orientieren.
5. Stellen Sie die Schnittdicke bis 10 um. Gehen Sie um das Gewebe zu schneiden. Für jede Umdrehung des Antriebsrades, schreitet der Probenhalter einen kontrollierten Abstand zur Klinge.
6. Legen Sie die Abschnitte auf einem polarisierten Schieber (8 bis 10 Abschnitt pro Folie) (Abbildung 2C).
7. Nach dem Schneiden, speichern Sie die Objektträger bei -80 ° C.
   Anmerkung: Die Probe kann in einen -80 ° C Gefrierschrank gelagert werden und wiederverwendet further sectioning, wenn sie richtig behandelt und gelagert.

5. Routine histologische Färbung (Hematoxylin & Eosin-Färbung)

Hinweis: Mehrere histologischen Färbungen können auf Muskelpartien nach der Analyse durchgeführt werden. Eine Routine histologischen Färbung für morphologische und morphometrische Analyse ist die Hematoxylin & Eosin (H & E) Dichromsäure Fleck. Die Hämatoxylin färbt die Kerne ein tiefes Purpur. Kernfärbung wird mit Eosin gegengefärbt (pink / rot), die eosinophile Strukturen Flecken, wie die Muskelfasern im Zytoplasma.

1. Komplett lufttrockenen gefrorenen Dias mit den Abschnitten 10 - 15 Minuten bei Raumtemperatur, die Folien in einem Färbeschale einlegen und das Fach in einem Färbetrog setzen.
2. Stain für 1 min mit Hämatoxylin.
3. Legen Sie den Färbetrog unter einem ziemlich schwachen Leitungswasser Jet für 10 min die Hämatoxylin auszuwaschen.
4. Tauchen Sie die Folien für 5 min in 95% Ethanol, wenn eine alkoholische Lösung von Eosin wird (überspringen t verwendet werdenseinen Schritt bei einer wässrigen Eosinlösung).
5. Gegenfärbung für 1 min mit Eosin-Lösung.
6. Spülen mit Wasser zu einer übermäßigen Eosinlösung beseitigen.
   Hinweis: Die optimale Timing der Färbung mit entweder Hämatoxylin oder Eosin sollte für jede neue Charge definiert werden.
7. Entwässern der Proben in einer abgestuften Ethanolreihe: 50% und 70% (ein paar Sekunden). Schnell in 95% Ethanol eintauchen, gefolgt von 2 Veränderungen in 100% Ethanol, 5 min pro.
8. Klar in zwei Änderungen Xylol, jede 5 Minuten oder länger. Dieser Schritt muss unter einer chemischen Haube erfolgen.
9. Montieren Sie die Folien mit einem Xylol-basierten Eindeckmittel, ein paar Tropfen Eindeckmedium auf der Folie und Abdecken mit einem Deckglas aufgebracht wird. Das Befestigungsmittel kann auch auf dem Deckglas und dem Deckglas auf dem Objektträger gelegt angewendet werden.
   1. Vermeiden Sie Luftblasen zwischen dem Objektträger und dem Deckglas bildet. Luftblasen, halten Sie die Folie vertikal (nach der Montage) und Squeeze-out das überschüssige mo zu beseitigenunting Medium und Luftblasen durch sanft mit stumpfen Pinzette auf dem Deckglas drücken (oder einem ähnlichen stumpfen Werkzeug).
10. Halten Sie die Folien unter der Haube für ein paar Stunden oder über Nacht das Xylol vollständig zu verdampfen lassen, um die Analyse, bevor Sie fortfahren.
11. Führen Sie die morphologische und morphometrische Analyse von H & E-gefärbten regenerierende Muskelpartien durch die Verwendung nicht-überlappende Serienbilder von mindestens einer ganzen Muskelschnitt pro Maus. Machen Sie Bilder mit einem Hellfeld-Mikroskop, mit 20-facher Vergrößerung.
    Hinweis: Eine Mindestanzahl von 5 Mäusen empfohlen statistische Signifikanz der Messungen zu erhalten.
    Hinweis: Die Bildanalyse - Software für diesen Zweck, wie den kostenlosen Download - Software ImageJ verfügbar ist (http://imagej.nih.gov/ij/).

Ergebnisse

H & E-Färbung ermöglicht die Bewertung der Morphologie des Regenerationsprozesses zu bestimmten Zeitpunkten während der Skelettmuskelregeneration. Abbildung 3 zeigt den Verlauf Analysezeit auf verletzte TA Muskeln von Wildtyp - Mäusen durchgeführt. Muskeln wurden bei 3, 7, 15 und 30 Tage nach Injektion CTX isoliert, wie in 3A schematisch dargestellt. Repräsentative Bilder von H & E-gefärbten Querschnitte zeigen die Dynamik der Skelettmuske...

Diskussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll akuten Verletzungen der Skelettmuskulatur zu induzieren (dh die intramuskuläre Injektion von CTX). Es ist weithin als ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung der Dynamik von Skelettmuskelregeneration in vivo verwendet. CTX Injektion induziert die Degeneration von Muskelfasern, die durch die Depolarisation des Sarkolemm und die Kontraktion der Fasern ¹² und löst die Kaskade von Ereignissen verursacht wird , die zu Muskelregeneration führt. Skelettmuskeln...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica	SIGMA ALDRICH	C9759
Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL	BD	324826
Tragacanth Gum	MP BIOMEDICALS,LLC	104792
2-Methylbutane (Isopentane)	SIGMA ALDRICH	78-78-4.
OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat	Bio-optica	05-9801
Feather Microtome Blade S35	Bio-optica	01-S35
Glass Slide Superfrost Plus	Menzel-Gläser	09-OPLUS
Dumon #5 Mirror Finish Forceps	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	11251-23
Scissors Straight Sharp/Sharp	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15024-10
Scissors Noyes Straight	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15012-12
Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	14094-11
Eukitt	Bio-optica	09-00100
Slide Coverslip	BIOSIGMA	VBS651
Xylene	SIGMA ALDRICH	214736
Ethanol 100%	sigma-Aldrich	02860-2.5L
Hematoxyline	J.T. BAKER	3873
Eosin	SIGMA ALDRICH	HT110116
Cryostat	LEICA	CM3050 S