La inducción de la regeneración muscular esquelético aguda por inyección Cardiotoxin

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo detallado para inducir la regeneración del músculo esquelético aguda en ratones adultos y posteriores manipulaciones de los músculos, tales como disección, congelación, corte, tinción de rutina, y miofibras análisis del área de la sección transversal.

Resumen

la regeneración del músculo esquelético es un proceso fisiológico que se produce en los músculos esqueléticos adultos en respuesta a una lesión o enfermedad. la regeneración del músculo esquelético inducida por la lesión aguda es un sistema poderoso modelo ampliamente utilizado para estudiar los eventos involucrados en la regeneración muscular, así como los mecanismos y diferentes jugadores. De hecho, un conocimiento detallado de este proceso es esencial para una mejor comprensión de las condiciones patológicas que conducen a la degeneración del músculo esquelético, y que ayuda en la identificación de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas. El presente trabajo describe un protocolo detallado y reproducible para inducir la regeneración del músculo esquelético aguda en ratones a través de una única inyección intramuscular de cardiotoxina (CTX). CTX pertenece a la familia de toxinas de veneno de serpiente y causa miólisis de miofibras, que finalmente desencadena los eventos de regeneración. La dinámica de la regeneración del músculo esquelético es evaluado por el análisis histológico de secciones de músculo. El protocolo tambiénilustra los procedimientos experimentales para la disección, la congelación, y cortar el músculo tibial anterior, así como la tinción con hematoxilina y eosina de rutina que se utiliza ampliamente para el análisis morfológico y morfométrico posterior.

Introducción

músculos esqueléticos adultos de mamíferos están formados por grupos de fascículos de las células musculares multinucleadas (miofibras) que se especializan para la contracción. Cada miofibrilar es un sincitio alargada, rodeada por el sarcolema (membrana plasmática) y miofibrillas que contienen, que se compone de proteínas contráctiles organizadas regular y repetidamente (actina y miosina filamentos). En la vida adulta y en condiciones de reposo, los músculos esqueléticos tienen una muy baja rotación de su mionúcleos ^1; de hecho, los mionúcleos, que se encuentran en la periferia de la miofibras, bajo el sarcolema, son detenidas en la fase G0 del ciclo celular y son incapaces de proliferar ^1,2.

Los músculos esqueléticos tienen la capacidad peculiar de regenerarse después del daño, llegando a homeostasis después de varios acontecimientos de remodelación de tejidos que están estrechamente relacionados entre sí. Después de una lesión aguda o trauma, se induce la degeneración, seguida por los procesos de regeneraciónque implican diferentes poblaciones de células, incluyendo una población residente de las células musculares, las células satélite (SCS). En efecto, en ausencia de cualquier estímulo ambientales, las células satélite están en un estado de reposo y se encuentran en un nicho especializado entre el sarcolema y el ^3,4 lámina basal. Después de una lesión o enfermedad, SCs se activan, proliferan, migran a las zonas dañadas, y, finalmente, diferenciar, dando lugar a las miofibras de nueva formación ^5. SC activados establecen diafonía con diferentes poblaciones de células, células inflamatorias, principalmente, que son reclutadas en el sitio del trauma ^6-8. Esta diafonía permite que las células siguen un paradigma regulado por el cual las señales moleculares que conducen modificaciones estructurales, que finalmente llevan a la homeostasis ^9. Además de las SC, células inflamatorias e intersticiales, procesos angiogénicos, y eventos de re-inervación también están involucrados, actuando de manera coordinada para reparar este altamente organizado y specialized estructura.

Hay un gran interés en el estudio de los diferentes aspectos de la regeneración del músculo esquelético, no sólo para entender la fisiología del músculo, pero también para mejorar las estrategias terapéuticas que requieren conocimiento más profundo de todo el proceso. Varios enfoques experimentales están disponibles actualmente para estudiar la identidad y la función de las diferentes poblaciones de células, las vías de señalización, y los mecanismos moleculares implicados. Los modelos de ratón de lesión aguda representan una herramienta poderosa para investigar muchos aspectos de este proceso. Diferentes usados comúnmente técnicas para inducir daño muscular aguda permiten a los investigadores siguen el proceso de regeneración in vivo, desde las primeras etapas hasta el final del proceso. Este protocolo describe los pasos de la inyección intramuscular de cardiotoxina derivada de veneno de serpiente (CTX), que induce miólisis y desencadena el proceso de regeneración, hasta el análisis de muestras de tejido. Después de la inyección CTX, mice puede ser sacrificada en diferentes puntos de tiempo dependiendo de las necesidades experimentales, y los músculos del esqueleto puede ser disecado y procesada para su posterior análisis. Finalmente, se describe el protocolo de tinción de secciones de tejido para realizar observaciones morfológicas y análisis cuantitativos básicos. Este protocolo permite el estudio de la regeneración del músculo esquelético aguda in vivo de una manera altamente reproducible ^10.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo en estricta conformidad con las directrices institucionales para la investigación con animales y aprobados por el Departamento de Salud Pública, Sanidad Animal, Nutrición y Seguridad del Ministerio de Salud de Italia Alimentación, de acuerdo con la ley en la experimentación animal. procedimientos dislocación cervical pueden variar de una institución a otra basada en IACUC o sus requisitos equivalentes.

1. Inyección Cardiotoxin en el músculo tibial anterior

1. Preparar una solución de 10 mM de cardiotoxina (CTX) de trabajo diluyendo la solución cardiotoxina de valores en tamponada con fosfato estéril salino (PBS) o en agua antes de iniciar el procedimiento.
   Nota: CTX es soluble en agua a 1 mg / mL. Preparar una solución madre 70 mM. Alícuota y almacenar a -20 ° C. CTX utilizado para este protocolo es una mezcla de cardiotoxinas que tienen un peso molecular de aproximadamente 7.000 Da.
   PRECAUCIÓN: Se sugiere llevarguantes dobles, una máscara de la higiene y gafas de seguridad (como alternativa a las gafas de seguridad, se recomienda trabajar bajo una campana) y ser muy cuidadosos para evitar cualquier contacto con la solución, incluso si se diluye.
2. Anestesiar a los ratones por inyección intraperitoneal de ketamina y xilazina (80 mg / kg y 10 mg / kg de masa corporal) u otro anestésico disponible aprobado.
3. Con la cara del ratón hacia arriba, rociar las extremidades traseras, con un 70% de etanol. Para visualizar la ubicación exacta del músculo tibial anterior (TA), con la ayuda de un bisturí, cortar el pelo en la parte anterior de la pierna inferior, debajo de la rodilla.
   Nota: El músculo TA del cuerpo proximal de la tibia, bajando lateral al hueso y terminando en el tobillo. Su tendón largo se extiende en el pie a través del tobillo (véase la Figura 1A).
4. Dibuje ~ 100 l de la solución en la jeringa tirando del émbolo hacia atrás lentamente.
5. Eliminar las burbujas de aire, manteniendo la jeringa en posición vertical (con la aguja hacia arriba). Tire suavemente el émbolo hacia abajo y pulse el lado de la jeringa para ayudar a las burbujas de aire conectados a la parte interior del tubo vienen hacia arriba. Presione lentamente el émbolo para liberar grandes burbujas de aire. Unas pocas gotas de líquido va a salir la aguja. En este punto, asegúrese de recoger el líquido de nuevo en el tubo y no dispersarla, dada la toxicidad de cardiotoxina.
6. Retirar la solución en la jeringa hasta que se alcanza la dosis deseada. Inyectar 20 l de solución de CTX para cada músculo TA.
7. Insertar la aguja en el centro de la TA siguiendo la posición del hueso de la tibia como guía, desde el tendón hacia la rodilla. Dado que la TA es un tejido delgado, lleve a cabo la inyección sin ir demasiado profundo (inserte la aguja de 2/3 mm de profundidad, aproximadamente a 10 ° a 20 ° de ángulo), y evitar ir más allá del propio músculo (Figura 1A).
8. No tire de la aguja inmediatamente después de la inyección, pero esperar 2 - 3 s para evitar fugasedad de CTX cae del músculo.
9. Después del procedimiento, colocar la jaula en una placa caliente (a 37 ° C) hasta que los ratones están despiertos, ya que el anestésico y el etanol utilizado reducir la temperatura corporal.

2. Aislamiento tibial anterior

Nota: Los músculos se pueden aislar en diferentes puntos temporales después de la inyección de cardiotoxina según los requisitos experimentales.

1. Sacrificar el ratón por dislocación cervical.
2. Pulverizar las patas traseras con un 70% de etanol. Durante el procedimiento, el animal puede ser fijado a un soporte para mantenerla oprimida.
3. Cortar la piel a nivel del tendón proximal (por encima del pie), insertar una de las cuchillas de las tijeras debajo de la piel, y cortar la piel hacia arriba, en la dirección de la rodilla. Con la ayuda de unas pinzas, tire hacia arriba de la piel y exponer el músculo en su totalidad. Retirar con cuidado toda la piel y el pelo de la zona de interés.
4. Eliminar la fascia pellizcando lentamente o de corte (con THen la punta de unas pinzas o con micro finas tijeras de disección) de la periferia extrema del músculo en el lado opuesto de la tibia (Figura 1B). Una vez roto, retire suavemente la fascia con la ayuda de unas pinzas de punta fina; evitar dañar el músculo subyacente.
   Nota: Al igual que con otros músculos y órganos, la AT está cubierto por la fascia (fascia profunda de la pierna), una hoja delgada de tejido conectivo que se encuentra profundamente bajo la piel y que necesita ser eliminado fácilmente para aislar el músculo subyacente.
5. Visualizar el tendón distal TA y el tendón extensor de los dedos por encima del pie, que se yuxtaponen. El tendón del músculo extensor digitorum longus (EDL) se encuentra ligeramente por debajo del tendón de TA. Los tendones de ratones adultos son visibles para el ojo desnudo.
6. Retire el músculo TA siguiendo una de las dos técnicas siguientes:
   1. Corte los dos tendones finos con micro tijeras de disección y tirar de ellos hacia el lado proximal, aguantandog los tendones con fórceps. Separar las dos tendones, tirando de ellos suavemente en direcciones opuestas para separar los músculos.
   2. Con la ayuda de unas pinzas de punta fina, separar el tendón distal TA del tendón extensor digital pasando la punta por debajo del tendón en sí (Figura 1C, imagen superior). Deslice suavemente las pinzas por debajo de la TA para separarlo de los músculos subyacentes (Figura 1C, la imagen inferior).
   3. Mantenga las pinzas debajo del músculo para mantenerlo ligeramente elevada, cortar el tendón TA, y tire de él hacia arriba hasta que sólo el área debajo de la rodilla se adjunta (Figura 1D, imagen de la izquierda). Cortar la TA debajo de la rodilla, siguiendo el borde del músculo con las tijeras (Figura 1D, imagen derecha).
      Nota: Si el músculo permanece ligeramente unido a los lados, utilizar bien micro tijeras de disección para ayudar a separarla.
      Nota: Si la pinza no encajan fácilmente por debajo de la TA,es posible que la fascia no se ha eliminado por completo, y aún podría ser visible en la parte superior del músculo. En este caso, eliminar por completo la fascia antes de proceder.

3. fresca Técnica del músculo congelado

1. Coloque una pequeña cantidad de goma tragacanto o un compuesto adhesivo congelación similar (por ejemplo, temperatura óptima de corte compuesto (OCT)) sobre una rebanada de corcho. Etiquetar rebanada del corcho en el reverso antes de la congelación, si es necesario (Figura 2A).
2. Con el fin de obtener secciones transversales de músculo, el disipador de TA en la goma de tragacanto mediante la inserción del tendón distal y dejando aproximadamente 3/4 del músculo fuera, asegurándose de que el músculo en una posición perpendicular con respecto al corcho (Figura 2A).
3. Llenar una lata de aluminio (como alternativa, una taza de metal o de un vaso de vidrio), con isopentano. Suspender la lata de isopentano en un Dewar que contiene liquid nitrógeno, no permitiendo que el nitrógeno líquido para entrar en la lata.
   Nota: isopentano necesita para alcanzar la temperatura adecuada (-150 a -160 ° C) para la congelación óptima del tejido. La temperatura correcta se alcanza cuando algunas partículas sólidas blancas forman en la parte inferior de la lata y el isopentano se vuelve ligeramente viscosa.
   Nota: No congelar la muestra antes de la formación de las partículas sólidas, ya que puede dar lugar a artefactos de congelación. Por otro lado, si el isopentano se vuelve completamente sólido, dejarlo a temperatura ambiente hasta que se descongela, asegurándose de que algunas partículas blancas son todavía presente.
4. El uso de pinzas Mixter, sumerja rápidamente el corcho con el músculo en el isopentano, manteniendo los músculos hacia abajo posicionado, y asegúrese de que para liberar el corcho cuando éste se encuentre totalmente sumergido en el líquido. De esta manera, mientras que la muestra flota, sólo el reverso de la corcho debe ser visible en el líquido.
5. Deje la sample en el isopentano para 1 min.
6. El uso de pinzas o fórceps Mixter (similares), tome el músculo y sumergirlo en nitrógeno líquido durante al menos 2 minutos.
7. Envolver las muestras individualmente en papel de aluminio y etiquetada inmediatamente colocarlos en hielo seco (-70 ° C), o directamente guardarlos en un congelador a -80ºC.
   Nota: Durante todo el procedimiento, desde pasos 3.4 a 3.7, es extremadamente importante para mantener la temperatura correcta y para evitar que los especímenes de descongelación (por ejemplo, durante la transferencia a la -80 ° C congelador.). El aumento de temperatura da como resultado la descongelación no controlada y recongelación de los microcristales de agua que están presentes en el tejido y, finalmente, provoca la formación de artefactos o la ruptura de las fibras musculares (visualizaron en las secciones de tejido como agujeros grandes blancas en el centro de la fibra).

4. La sección del criostato músculos congelados

1. Ajuste la temperatura de la cámara del criostato tO a la -20 -22ºC.
2. Ponga el talón de la muestra, la hoja, y la muestra en la cámara del criostato, lo que les permite equilibrar durante al menos 30 min.
3. Coloque una pequeña cantidad de compuesto de congelación (por ejemplo, OCT compuesto) en el talón de muestra y sumergir el corcho con la probeta antes de que solidifique el compuesto de congelación. Mientras tanto, colocar la hoja en el soporte de la cuchilla.
4. Alinear la muestra y la cuchilla usando los tornillos provistos para orientar el soporte de la muestra con el soporte de la cuchilla (Figura 2B).
5. Seleccionar el espesor de 10 micras. Proceder a cortar el tejido. Por cada vuelta de la rueda motriz, el soporte de la muestra avanza una distancia controlada hacia la cuchilla.
6. Colocar las secciones sobre un portaobjetos polarizado (8-10 sección por diapositiva) (Figura 2C).
7. Después de seccionar, almacenar las diapositivas a -80 ° C.
   Nota: la muestra se pueden almacenar en un congelador C -80 ° y volver a utilizar para further seccionamiento, si se almacena y maneja adecuadamente.

5. rutina histológica de tinción (hematoxilina y eosina)

Nota: Varios tinciones histológicas se pueden realizar en secciones de músculo de acuerdo con el análisis. Una mancha histológico de rutina para el análisis morfológico y morfométrico es la mancha bichromic hematoxilina y eosina (H & E). La hematoxilina tiñe el núcleo de un color morado oscuro. tinción nuclear se counterstained con eosina (rosa / rojo), que tiñe las estructuras de eosinófilos, tales como las miofibrillas en el citoplasma.

1. Completamente de aire seco diapositivas congeladas con secciones de 10 - 15 minutos a temperatura ambiente, alojamiento los portaobjetos en una bandeja de tinción, y poner la bandeja en una cubeta de tinción.
2. Manchar durante 1 minuto con hematoxilina.
3. Coloque la cubeta de tinción bajo un chorro de agua del grifo bastante débil durante 10 min para vaciar este último hematoxilina.
4. Sumergir los portaobjetos durante 5 minutos en etanol al 95%, si se utiliza una solución alcohólica de eosina (t saltarsu paso en caso de una solución de eosina acuosa).
5. CONTRATINCIÓN durante 1 min con una solución de eosina.
6. Enjuague con agua para eliminar la solución de eosina excesiva.
   Nota: El tiempo óptimo de la tinción con hematoxilina eosina o debe definirse para cada nuevo lote.
7. Deshidratar las muestras en una serie de etanol: 50% y 70% (unos pocos segundos cada uno). Rápidamente sumerja en 95% de etanol, seguido de 2 cambios en 100% de etanol, 5 min cada uno.
8. Claro en 2 cambios de xileno, cada 5 min o más. Este paso debe llevarse a cabo bajo una campana química.
9. Montar las diapositivas con un medio de montaje a base de xileno, la aplicación de unas gotas de medio de montaje de la diapositiva y cubriendo con un cubreobjetos. El medio de montaje también se puede aplicar a la cubreobjetos y el cubreobjetos poner en la diapositiva.
   1. Evitar la formación de burbujas de aire entre el portaobjetos y el cubreobjetos. Para eliminar las burbujas de aire, mantener el deslizamiento vertical (después del montaje) y exprima el exceso de momedio unting y burbujas de aire presionando suavemente sobre el cubreobjetos con unas pinzas romas (o una herramienta similar sin filo).
10. Mantenga las diapositivas bajo el capó durante unas horas o durante la noche para permitir que el xileno se evapore completamente antes de proceder al análisis.
11. Realizar el análisis morfológico y morfométrico de las secciones de músculo en regeneración teñidas con H y E mediante el uso de imágenes en serie que no se solapan de al menos una sección de músculo entero por ratón. Capturar imágenes con un microscopio de campo claro, con 20 aumentos.
    Nota: Se recomienda un número mínimo de 5 ratones para obtener la significación estadística de las mediciones.
    Nota: El software de análisis de imágenes está disponible para este propósito, tales como la descarga libre ImageJ software (http://imagej.nih.gov/ij/).

Resultados

H & E tinción permite la evaluación de la morfología del proceso de regeneración en los puntos de tiempo específicos durante la regeneración del músculo esquelético. La figura 3 muestra el tiempo de análisis se realiza en los músculos TA heridas de los ratones de tipo salvaje. Los músculos se han aislado a los 3, 7, 15, y 30 días después de la inyección CTX, como se esquematiza en la Figura 3A. Imágenes representativas de secciones tra...

Discusión

A continuación, se describe un protocolo para inducir una lesión aguda en el músculo esquelético (es decir, la inyección intramuscular de CTX). Es ampliamente utilizado como una herramienta poderosa para estudiar la dinámica de la regeneración del músculo esquelético in vivo. Inyección CTX induce la degeneración de las fibras musculares, que es causada por la despolarización de la sarcolema y la contracción de las fibras ^12, y desencadena la cascada de eventos que conduce a la r...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica	SIGMA ALDRICH	C9759
Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL	BD	324826
Tragacanth Gum	MP BIOMEDICALS,LLC	104792
2-Methylbutane (Isopentane)	SIGMA ALDRICH	78-78-4.
OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat	Bio-optica	05-9801
Feather Microtome Blade S35	Bio-optica	01-S35
Glass Slide Superfrost Plus	Menzel-Gläser	09-OPLUS
Dumon #5 Mirror Finish Forceps	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	11251-23
Scissors Straight Sharp/Sharp	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15024-10
Scissors Noyes Straight	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15012-12
Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	14094-11
Eukitt	Bio-optica	09-00100
Slide Coverslip	BIOSIGMA	VBS651
Xylene	SIGMA ALDRICH	214736
Ethanol 100%	sigma-Aldrich	02860-2.5L
Hematoxyline	J.T. BAKER	3873
Eosin	SIGMA ALDRICH	HT110116
Cryostat	LEICA	CM3050 S