Induction de aiguë Skeletal Muscle Régénération par cardiotoxine Injection

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour induire régénération du muscle squelettique aiguë chez la souris adulte et manipulations ultérieures des muscles, comme la dissection, le gel, la coupe, coloration de routine, et myofibre analyse de surface en coupe transversale.

Résumé

Régénération du muscle squelettique est un processus physiologique qui se produit dans les muscles squelettiques adultes en réponse à une lésion ou une maladie. Aiguë régénération du muscle squelettique induite par blessure est un système puissant modèle largement utilisé pour étudier les événements impliqués dans la régénération musculaire, ainsi que les mécanismes et les différents acteurs. En effet, une connaissance détaillée de ce processus est essentiel pour une meilleure compréhension des conditions pathologiques qui conduisent à la dégénérescence des muscles squelettiques, et il aide à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées. Le présent ouvrage décrit un protocole détaillé et reproductible pour induire régénération du muscle squelettique aiguë chez la souris par une injection intramusculaire unique de cardiotoxine (CTX). CTX appartient à la famille des serpents toxines de venin et provoque myolyse de myofibres, ce qui déclenche finalement les événements de régénération. La dynamique de la régénération du muscle squelettique est évaluée par une analyse histologique de coupes de muscle. Le protocole a égalementillustre les procédures expérimentales pour la dissection, le gel, et en coupant le muscle jambier antérieur, ainsi que l'hématoxyline & éosine routine qui est largement utilisé pour l'analyse morphologique et morphométrique ultérieure.

Introduction

les muscles squelettiques chez les mammifères adultes sont formés par des groupes de fascicules de cellules musculaires multinucléées (les myofibres) qui sont spécialisées pour la contraction. Chaque myofibres est un syncytium allongé, entouré par le sarcolemme (membrane plasmatique) et contenant des myofibrilles qui sont constitués de protéines contractiles régulièrement et de manière répétée organisées (actine et la myosine). Dans la vie adulte et dans des conditions de repos, les muscles squelettiques ont un chiffre d' affaires très faible de leur myonuclei ^1; en effet, les noyaux musculaires, qui sont situés à la périphérie de la myofibres, sous le sarcolemme, sont arrêtés dans la phase G0 du cycle cellulaire et sont incapables de proliférer ^1,2.

les muscles squelettiques ont la capacité propre à se régénérer après une lésion, atteignant homéostasie après plusieurs événements de remodelage tissulaire qui sont étroitement liés les uns aux autres. Après une blessure aiguë ou d'un traumatisme, la dégénérescence est induite, suivie par les processus de régénérationqui comportent des populations de cellules différentes, y compris une population résidente de cellules musculaires, les cellules satellites (CS). En effet, en l'absence de tout stimulus environnemental, les cellules satellites sont dans un état quiescent et sont situés dans un créneau spécialisé entre le sarcolemme et la lame basale de ^3,4. Suite à une blessure ou d'une maladie, SCs sont activées, proliférer, migrer vers les zones endommagées, et finalement la différence, ce qui donne lieu à des myofibres nouvellement formant ^5. SCs Activé établir cross-talk avec différentes populations cellulaires, principalement des cellules inflammatoires, qui sont recrutés dans le site du traumatisme ^6-8. Ce cross-talk permet aux cellules de suivre un paradigme réglementé par lequel des signaux moléculaires conduisent des modifications structurelles, pour aboutir finalement à l' homéostasie ^9. Outre SCs, les cellules inflammatoires et interstitielles, processus angiogéniques, et les événements ré-innervation sont également impliqués, agissant de manière coordonnée pour réparer ce très organisé et sStructure nstru.

Il y a un grand intérêt dans l'étude de différents aspects de la régénération du muscle squelettique, non seulement de comprendre la physiologie du muscle, mais aussi d'améliorer les stratégies thérapeutiques qui nécessitent une connaissance plus approfondie de l'ensemble du processus. Plusieurs approches expérimentales sont actuellement disponibles pour étudier l'identité et la fonction des différentes populations cellulaires, les voies de signalisation et les mécanismes moléculaires impliqués. Des modèles murins de blessures aiguës représentent un outil puissant pour étudier de nombreux aspects de ce processus. Différentes techniques couramment utilisées pour induire des lésions musculaires aiguës permettent aux chercheurs de suivre le processus de régénération in vivo, à partir des premières étapes à la fin du processus. Ce protocole décrit les différentes étapes de l'injection intramusculaire de cardiotoxine de venin de serpent dérivée (CTX), ce qui induit myolyse et déclenche le processus de régénération, jusqu'à l'analyse des échantillons de tissus. Après injection CTX, miCE peut être sacrifiée à différents points dans le temps en fonction des besoins expérimentaux, et les muscles squelettiques peut être disséqué et traitées pour une analyse ultérieure. Enfin, nous décrivons le protocole de coloration des coupes de tissus pour effectuer des observations morphologiques et des analyses quantitatives de base. Ce protocole permet l'étude de la régénération du muscle squelettique aiguë in vivo d'une manière hautement reproductible ^10.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées en stricte conformité avec les directives institutionnelles pour la recherche animale et approuvés par le ministère de la santé publique, la santé animale, la nutrition et la sécurité du Ministère italien de la santé des aliments, conformément à la loi sur l'expérimentation animale. procédures de dislocation cervicale peuvent varier d'une institution à la base de IACUC ou de ses exigences équivalentes.

1. cardiotoxine Injection dans le muscle jambier antérieur

1. Préparer un 10 uM solution de cardiotoxine (CTX) de travail en diluant la solution cardiotoxine mère dans stérile Phosphate-Buffered Saline (PBS) ou dans l'eau avant de commencer la procédure.
   Note: CTX est soluble dans l' eau à 1 mg / mL. Préparer une solution mère de 70 uM. Aliquoter et conserver à -20 ° C. CTX utilisé pour ce protocole est un mélange de cardiotoxines ayant un poids moléculaire d'environ 7000 Da.
   ATTENTION: Il est recommandé de portergants doubles, un masque d'hygiène, et des lunettes de sécurité (alternativement des lunettes de sécurité, il est recommandé de travailler sous une hotte) et être très prudent pour éviter tout contact avec la solution, même si dilué.
2. Anesthésier les souris par injection intraperitoneale de kétamine et de xylazine (80 mg / kg et 10 mg / kg de masse corporelle) ou un autre anesthésique disponible agréé.
3. Avec la souris face vers le haut, pulvériser les membres postérieurs avec 70% d'éthanol. Pour visualiser l'emplacement exact du muscle jambier antérieur (TA), avec l'aide d'un scalpel, couper les cheveux loin à la partie antérieure de la jambe, sous le genou.
   Remarque: Le muscle TA provient du corps proximale du tibia, en descendant latéral à l'os et se terminant à la cheville. Son long tendon se prolonge dans le pied à travers la cheville (voir figure 1A).
4. Dessinez ~ 100 ul de la solution dans la seringue en tirant doucement sur le piston.
5. Retirer les bulles d'air, tenant la seringue verticalement (avec l'aiguille vers le haut). Tirez doucement le piston vers le bas et appuyez sur le côté de la seringue pour aider les bulles d'air attachés à la partie intérieure du tube viennent vers le haut. Pressez lentement le piston pour libérer de grandes bulles d'air. Quelques gouttes de liquide sortira l'aiguille. À ce stade, assurez-vous de choisir le liquide à nouveau dans le tube et non disperser, étant donné la toxicité de cardiotoxine.
6. Retirer la solution dans la seringue jusqu'à ce que la dose désirée soit atteinte. Injecter 20 ul de solution CTX pour chaque muscle TA.
7. Insérer l'aiguille dans le centre de l'AT en suivant la position de l'os du tibia que l'orientation, du tendon vers le genou. Étant donné que la TA est un tissu mince, effectuer l'injection sans aller trop profond (insérer l'aiguille 2/3 mm de profondeur, à environ 10 ° à 20 ° d' angle), et éviter d' aller au - delà du muscle lui - même (figure 1A).
8. Ne tirez pas sur l'aiguille immédiatement après l'injection, mais attendez 2 - 3 s pour empêcher la fuiteâge de CTX tombe du muscle.
9. Après la procédure, placer la cage sur une plaque chauffante (à 37 ° C) jusqu'à ce que les souris sont éveillés, étant donné que l'anesthésique et de l'éthanol utilisé réduire la température corporelle.

2. jambier antérieur Isolation

Nota: Les muscles peuvent être isolés à différents points de temps après l'injection de cardiotoxine selon les exigences expérimentales.

1. Sacrifiez la souris par dislocation cervicale.
2. Pulvériser les pattes arrières avec 70% d'éthanol. Pendant la procédure, l'animal peut être fixé sur un support pour la maintenir enfoncée.
3. Couper la peau au niveau du tendon proximale (au-dessus du pied), insérer une des lames des ciseaux sous la peau, et couper la peau vers le haut, dans la direction du genou. Avec l'aide de pinces, tirer vers le haut la peau et exposer le muscle entièrement. Retirez soigneusement toute la peau et les cheveux de la zone d'intérêt.
4. Éliminer le fascia en pinçant lentement ou de coupe (avec een pointe des pinces ou micro fines dissection ciseaux) l'extrême périphérie du muscle sur le côté opposé du tibia (figure 1B). Une fois cassé, retirez délicatement le fascia avec l'aide d' une pince à épiler fine pointe; éviter d'endommager le muscle sous-jacent.
   Remarque: Comme avec d' autres muscles et les organes, la TA est couvert par fascia (profonde fascia de la jambe), une feuille mince de tissu conjonctif qui se trouve profondément sous la peau et qui doit être enlevé pour isoler facilement le muscle sous - jacent.
5. Visualiser le tendon distal TA et le tendon extenseur commun au-dessus du pied, qui sont juxtaposés. Le tendon du muscle long extenseur des orteils (EDL) se trouve légèrement en dessous du tendon TA. Tendons de souris adultes sont visibles à l'œil nu.
6. Retirer le muscle TA suivant l'une des deux techniques suivantes:
   1. Couper les deux tendons avec micro fines disséquer des ciseaux et tirez-les vers le côté proximal, holding les tendons avec une pince. Séparer les deux tendons, les tirant doucement dans des directions opposées pour séparer les muscles.
   2. Avec l'aide d' une pince à épiler fine pointe, séparer le tendon TA distal du tendon extenseur des orteils en passant la pointe en dessous du tendon lui - même (figure 1C, image du haut). Faites glisser doucement la pince à épiler en dessous de la TA pour séparer des muscles sous - jacents (figure 1C, image de fond).
   3. Tenir les pinces sous le muscle pour le maintenir légèrement surélevé, couper le tendon TA, et tirez doucement vers le haut jusqu'à ce que la zone en dessous du genou est fixé (figure 1D, photo de gauche). Couper le TA - dessous du genou, en suivant le bord du muscle avec les ciseaux (figure 1D, image de droite).
      Remarque: Si le muscle reste légèrement attaché aux côtés, utilisez fines micro dissection ciseaux pour aider à détacher.
      Remarque: Si la pince ne rentrent pas facilement en dessous de la TA,il est possible que la planche de bord n'a pas été complètement enlevé, et il pourrait encore être visible au - dessus du muscle. Dans ce cas, supprimer complètement le fascia avant de poursuivre.

3. Frais Technique de Muscle Frozen

1. Placer une petite quantité de gomme adragante ou un adhésif de congélation composé similaire (par exemple, Optimal Cutting Température (OCT) composé) sur une tranche de liège. Etiqueter la tranche du bouchon sur le côté inverse avant la congélation, si nécessaire (figure 2A).
2. Afin d'obtenir des coupes transversales du muscle, couler la TA dans la gomme adragante en insérant le tendon distal et en laissant environ 3/4 du muscle à l' extérieur, en veillant à avoir le muscle dans une position perpendiculaire par rapport au bouchon (Figure 2A).
3. Remplir une boîte en aluminium (en variante, une coupelle métallique ou d'un récipient en verre), avec de l'isopentane. Suspendre la boîte de isopentane dans un contenant liqui Deward 'azote, ne permettant pas l'azote liquide d'entrer dans la boîte.
   Remarque: L' isopentane a besoin pour atteindre la température appropriée (-150 à -160 ° C) pour la congélation optimale du tissu. La bonne température est atteinte lorsque certaines particules solides blanches forment au fond de la boîte et de l'isopentane devient légèrement visqueux.
   Note: Ne pas congeler l'échantillon avant la formation des particules solides, car il peut conduire à des artefacts de congélation. D'autre part, si l'isopentane devient complètement solide, laissez-le à température ambiante jusqu'à ce qu'elle soit décongelée, faire en sorte que certaines particules blanches sont toujours présents.
4. En utilisant des pinces Mixter, tremper rapidement le bouchon avec le muscle dans le isopentane, en gardant les muscles positionné vers le bas, et assurez-vous de libérer le bouchon quand il est complètement immergé dans le liquide. De cette façon, tandis que l'échantillon flotte, seule la face arrière du bouchon doit être visible dans le liquide.
5. Laissez le sample dans l'isopentane pendant 1 min.
6. En utilisant des pinces Mixter (ou pinces similaires), prenez le muscle et la plonger dans de l'azote liquide pendant au moins 2 min.
7. Envelopper les échantillons individuellement dans du papier d'aluminium étiqueté et les placer immédiatement dans la glace sèche (-70 ° C), ou directement les stocker dans un -80 ° C congélateur.
   Remarque: Tout au long de la procédure, des étapes 03/04 à 03/07, il est extrêmement important de maintenir la température correcte et pour éviter que les spécimens de décongélation (par exemple, lors du transfert vers -80 ° C congélateur.). Les résultats de l'augmentation de la température dans la fonte non contrôlée et recongélation des microcristaux d'eau qui sont présentes dans les tissus et, éventuellement, provoque la formation d'artefacts ou de la décomposition des fibres musculaires (visualisées sur les coupes de tissu que de grands trous blancs dans le centre de la fibre).

4. Cryostat Sectionnement des muscles congelés

1. Réglez la chambre de cryostat température to à -22 ° -20 C.
2. Mettre l'embout de spécimen, la lame et l'échantillon dans la chambre de cryostat, leur permettant de se stabiliser pendant au moins 30 min.
3. Placer une petite quantité de composé de congélation (par exemple, EAO composé) sur le talon de l' échantillon et immerger le bouchon avec l'échantillon avant la solidification du composé de congélation. Pendant ce temps, placer la lame dans le porte-lame.
4. Aligner l'échantillon et la lame à l' aide des vis fournies pour orienter le porte-échantillon avec le porte-lame (figure 2B).
5. Réglez l'épaisseur de coupe à 10 um. Passez à couper le tissu. Pour chaque tour de la roue motrice, le porte-échantillon avance une distance contrôlée vers la lame.
6. Placez les sections sur une lame polarisée (8 à 10 de la section par diapositive) (figure 2C).
7. Après la coupe, stocker les lames à -80 ° C.
   Remarque: Les échantillons peuvent être stockés dans un congélateur à -80 ° C , et réutilisés pour further sectionner, si elles sont correctement manipulés et entreposés.

5. Routine histologiques Coloration (hématoxyline et éosine)

Remarque: plusieurs colorants histologiques peuvent être réalisées sur des coupes de muscles conformément à l'analyse. Une tache histologique de routine pour l'analyse morphologique et morphométrique est l'hématoxyline & éosine (H & E) tache bichromique. L'hématoxyline colore les noyaux d'un violet profond. coloration nucléaire de contraste avec l'éosine (rose / rouge), qui colore les structures éosinophiles, comme les myofibres dans le cytoplasme.

1. Complètement air-sec diapositives congelés avec des sections pendant 10 - 15 min à température ambiante, déposer les lames dans un plateau de coloration, et posa le plateau dans une auge de coloration.
2. Colorer pendant 1 min avec de l'hématoxyline.
3. Poser la cuvette de coloration sous un jet d'eau du robinet assez faible pendant 10 min pour se laver le hématoxyline.
4. Immerger les lames pendant 5 min dans 95% d'éthanol, si une solution alcoolique d'éosine sera utilisé (sauter tson pas dans le cas d'une solution d'éosine aqueuse).
5. Counterstain pendant 1 min avec une solution de éosine.
6. Rincer à l'eau pour éliminer la solution de éosine excessive.
   Remarque: Le moment optimal de la coloration avec soit hématoxyline ou éosine devrait être défini pour chaque nouveau lot.
7. Déshydrater les échantillons dans une série d'éthanol à 50% et 70% (quelques secondes chacune). immerger rapidement dans 95% d'éthanol, suivi de 2 changements dans 100% d'éthanol, 5 minutes chacun.
8. Effacer en 2 de xylène, chaque 5 minutes ou plus. Cette étape doit être effectuée sous une hotte chimique.
9. Monter les lames avec un milieu de montage à base de xylène, en appliquant quelques gouttes de milieu de montage sur la lame et recouvrir d'une lamelle. Le support de montage peut également être appliquée à la lamelle et la lamelle couvre-objet mis sur la diapositive.
   1. Eviter la formation de bulles d'air entre la lame et la lamelle. Pour éliminer les bulles d'air, garder la glissière verticale (après montage) et presser l'excès momoyen CHASSE et les bulles d'air en appuyant doucement sur la lamelle avec une pince contondants (ou un outil contondant similaire).
10. Gardez les diapositives sous le capot pendant quelques heures ou toute la nuit pour laisser le xylène évaporer complètement avant de procéder à l'analyse.
11. Effectuer l'analyse morphologique et morphométrique des sections musculaires régénérant H & E-colorées à l'aide d'images en série sans chevauchement d'au moins une section entière du muscle par souris. Capture d'images avec un microscope à champ clair, avec un grossissement de 20x.
    Note: Un nombre minimum de 5 souris est recommandé d'obtenir une signification statistique des mesures.
    Remarque: le logiciel d'analyse d'images est disponible à cet effet, tel que le logiciel téléchargement gratuit ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).

Résultats

Coloration H & E permet l'évaluation de la morphologie du processus de régénération à des moments spécifiques au cours de la régénération du muscle squelettique. La figure 3 montre l'analyse au cours du temps effectuées sur les muscles TA blessés de souris de type sauvage. Les muscles ont été isolés à 3, 7, 15 et 30 jours après l' injection CTX, comme schématisé sur la figure 3A. Images représentatives de sections trans...

Discussion

Ici, nous décrivons un protocole pour induire une lésion aiguë dans le muscle squelettique (ie, l'injection intramusculaire de CTX). Il est largement utilisé comme un outil puissant pour étudier la dynamique de régénération du muscle squelettique in vivo. L' injection CTX induit la dégénérescence des fibres musculaires, ce qui est provoqué par la dépolarisation du sarcolemme et la contraction des fibres ¹² et déclenche la cascade d'événements qui conduit à la ré...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica	SIGMA ALDRICH	C9759
Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL	BD	324826
Tragacanth Gum	MP BIOMEDICALS,LLC	104792
2-Methylbutane (Isopentane)	SIGMA ALDRICH	78-78-4.
OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat	Bio-optica	05-9801
Feather Microtome Blade S35	Bio-optica	01-S35
Glass Slide Superfrost Plus	Menzel-Gläser	09-OPLUS
Dumon #5 Mirror Finish Forceps	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	11251-23
Scissors Straight Sharp/Sharp	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15024-10
Scissors Noyes Straight	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15012-12
Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	14094-11
Eukitt	Bio-optica	09-00100
Slide Coverslip	BIOSIGMA	VBS651
Xylene	SIGMA ALDRICH	214736
Ethanol 100%	sigma-Aldrich	02860-2.5L
Hematoxyline	J.T. BAKER	3873
Eosin	SIGMA ALDRICH	HT110116
Cryostat	LEICA	CM3050 S