心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導

要約

この原稿は、成体マウスや、解剖などの筋肉のその後の操作、凍結、切断、ルーチン染色、および筋線維断面積の解析における急性骨格筋再生を誘導するための詳細なプロトコルを記述します。

要約

骨格筋再生は、損傷または疾患に応じて、成人骨格筋に発生する生理学的プロセスです。急性損傷誘導骨格筋再生は筋肉の再生に関与するイベントだけでなく、メカニズムと異なる選手を研究するために広く使用されている、強力なモデル系です。実際には、このプロセスの詳細な知識は、骨格筋の変性につながる病的状態をより良く理解するために不可欠であり、それは新たな標的治療戦略を同定するのに役立ちます。本研究は、心臓毒の単回筋肉内注射（CTX）を介して、マウスにおける急性骨格筋再生を誘導するための詳細と再現性のプロトコルについて説明します。 CTXは、ヘビ毒毒素のファミリーに属し、最終的には再生イベントをトリガ筋線維の筋変性を引き起こします。骨格筋再生のダイナミクスは、筋肉切片の組織学的分析によって評価されます。また、プロトコル、解剖凍結、および前脛骨筋だけでなく、広くその後の形態学的および形態計測分析のために使用されるルーチンのヘマトキシリン＆エオシン染色を切断するための実験手順を示しています。

概要

哺乳類の成体の骨格筋が収縮するために特化して多核筋細胞（筋線維）のfasciculesのグループによって形成されています。各筋線維は、筋細胞膜（原形質膜）に囲まれた、細長い合胞体であり、定期的に繰り返し編成収縮タンパク質（アクチンとミオシンフィラメント）で構成されている筋原繊維を含みます。大人の生活の中で、および休止状態で、骨格筋は、彼らの筋核¹の非常に低い離職率を持っています。確かに、筋線維の周囲に位置している筋核は、筋細胞膜の下で、細胞周期のG0期で停止し^、1,2を増殖することはできませんされています。

骨格筋は、互いに緊密に関連している組織リモデリングのいくつかのイベントの後ホメオスタシスに達し、次のダメージを再生する独特の能力を有します。急性損傷または外傷後、変性は、誘導される再生過程が続きますすなわち、筋細胞、衛星細胞（SCS）の居住集団を含む異なる細胞集団を含みます。実際、任意の環境刺激の非存在下では、衛星細胞は静止状態にあり、筋細胞膜と基底板^3,4の間に特殊なニッチに位置しています。怪我や病気に続いて、SCが、活性化、増殖、損傷領域に移行し、最終的に分化し、新たに筋線維^5を形成を生じます。活性化のSCは、異なる細胞集団で外傷^6-8のサイトで募集されている主に炎症細胞を、クロストークを確立します。このクロストークは、細胞が分子シグナルが最終的ホメオスタシス⁹につながる、構造的修飾を駆動することによって調整されたパラダイムに従うことができます。 SC、炎症および間質細胞、血管形成過程、および再神経支配のイベントの他にも、この高度に組織とsを修復するために協調的に作用し、関与していますpecialized構造。

筋肉の生理学を理解するだけでなく、プロセス全体のより深い知識を必要とする治療戦略を改善するだけでなく、骨格筋再生のさまざまな側面を研究することに大きな関心があります。いくつかの実験的アプローチは、現在、異なる細胞集団、シグナル伝達経路、および関与する分子メカニズムのアイデンティティと機能を研究するために利用可能です。急性の傷害のマウスモデルは、このプロセスの多くの側面を研究するための強力なツールを表します。研究者は非常に早い段階からプロセスの最後に、 インビボでの再生プロセスに従うことができるように、急性筋損傷を誘発する別の一般的に使用される技術。このプロトコルは、筋変性を誘導し、組織サンプルの分析まで、再生処理をトリガするヘビ毒由来の心臓毒（CTX）の筋肉内注射からの手順を説明します。 CTXの注射後、MICEは、実験の要件に応じて異なる時点で犠牲にすることができ、骨格筋を解剖し、さらなる分析のために処理することができます。最後に、我々は、形態学的観察結果と基本的な定量分析を行うための組織切片の染色プロトコルを記述する。このプロトコルは、非常に再現性のある方法¹⁰のin vivoでの急性骨格筋再生の研究を可能にします。

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プロトコル

すべての実験は動物研究のための施設のガイドラインに厳密に従って行われ、動物実験に関する法律に従って公衆衛生、動物衛生、栄養と健康のイタリア省の食品安全省によって承認されました。頸椎脱臼手順はIACUCまたはそれと同等の要件に基づいて機関から機関に異なる場合があります。

前脛骨筋1.心臓毒注射

1. 手順を開始する前に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中または水中で心臓毒原液を希釈することにより、心臓毒（CTX）の溶液を作業10μMのを準備します。
   注：CTXを1mg / mLで水に可溶です。 70μMストック溶液を準備します。 -20℃で小分けし、店舗。 CTXは、このプロトコルのために使用される約7,000ダの分子量を有する心臓毒の混合物です。
   注意：着用することが示唆されています二重手袋、衛生マスク、安全メガネは、希釈した場合でも、その溶液との接触を避けるために非常に注意する（あるいは安全メガネには、フードの下で作業することが推奨されます）。
2. ケタミンおよびキシラジン（80 mgの/ kg及び10mgの体重の/ kg）または他の承認された利用可能な麻酔薬の腹腔内注射によってマウスを麻酔。
3. マウス面を上にして、70％エタノールで後肢をスプレー。前脛骨（TA）筋の正確な場所を視覚化するために、メスの助けを借りて、膝の下で、下肢の前方部分に離れて髪を切ります。
   注：TA筋が骨に横を下って行くと足首で終わる、脛骨の近位本体から生じます。その長い腱は、（ 図1A参照）足首全体の足の中に延びます。
4. バックゆっくりプランジャーを引くことにより、シリンジへの溶液の〜100μLを描画します。
5. 直立シリンジを保持する、気泡を除去（針で上向き）。そっとプランジャーを引くと、チューブの内側部分に接続されているすべての気泡が上向きに来助けるために、注射器の側面をタップします。ゆっくりと、大きな気泡を解放するためにプランジャーを押してください。液体を数滴は、針を出てきます。この時点で、心臓毒の毒性を考慮すると、チューブに再び液体をピックアップし、それを分散しないようにしてください。
6. 所望の投与量に達するまで、注射器への溶液を撤回。各TA筋のためのCTX溶液20μLを注入します。
7. 膝に向かって腱から、ガイダンスとして脛骨骨の位置を追跡することによって、TAの中心に針を挿入します。 TAは薄い組織であるので、（2/3ミリメートルの深針、約10°〜20°の角度を挿入）深すぎる行かずに注射を行い、筋肉自体（ 図1A）を越えて行くことは避けてください。
8. 注射直後に針を引き出したが、2待ってはいけない - 漏れを防ぐために3秒CTXの年齢は筋肉から落下します。
9. マウスは麻酔ので、覚醒され、使用されるエタノールは、体温を低下させるまでの手順の後、（37℃で）加熱されたプレート上にケージを配置します。

2.前脛骨の分離

注：筋肉は、実験の要件に応じて心臓毒注射後の異なる時点で単離することができます。

1. 頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。
2. 70％エタノールで後肢をスプレーします。手順の間、動物はそれを保持するために支持体に固定することができます。
3. （足の上）近位腱のレベルで皮膚を切り取り、皮膚の下にはさみの刃の1を挿入して、膝の方向に、上向きに皮膚を切りました。鉗子の助けを借りて、皮膚を引き上げ、完全に筋肉を露出させます。慎重に関心領域から肌や髪のすべてを削除します。
4. ゆっくりと（thとつまんまたは切断することにより、 筋膜を排除チップインピンセットやハサミを解剖細かいマイクロ付き）脛骨（ 図1B）の反対側の筋肉の極端な周囲。一度壊れて、そっと細い先端ピンセットの助けを借りて筋膜を除去します。根本的な筋肉の損傷を防ぎます。
   注：他の筋肉および器官と同様に、TAは、 筋膜 （脚の深部筋膜）、深い皮膚の下にあり、それは容易に下にある筋肉を単離するために除去する必要がある結合組織の薄いシートで覆われています。
5. 遠位TAの腱と並置されている足、上記の伸筋Digitorum腱を視覚化します。伸筋Digitorum長い（EDL）筋肉の腱はわずかTA腱の下に位置しています。成体マウスの腱は、肉眼で見ることができます。
6. 2次のいずれかの次のTA筋を削除します。
   1. 細かいマイクロはさみを解剖して、両方の腱をカットし、近位側に向かって、それらを引く、holdinグラム鉗子で腱。筋肉を分離するために反対方向に優しく、それらを引っ張って、2腱を分離します。
   2. 薄チップピンセットの助けを借りて、腱自体（ 図1C、上の写真）の下にチップを渡すことによって、伸筋腱Digitorumから遠位TA腱を分離します。ゆっくり基礎となる筋肉（ 図1C、下の写真）からそれを分離するために、TA以下ピンセットをスライドさせます。
   3. 、わずかに隆起それを維持TAの腱を切断し、軽くひざ下の領域のみが装着されるまで、上向きにそれを引っ張って筋肉の下でピンセットを持ち（ 図1D、左画像）。はさみ（ 図1D、右の写真）と筋肉のエッジ以下、膝下TAをカットします。
      注：筋肉を少し脇に取り付けられたままの場合、それを切り離す助けるためにはさみを解剖細かいマイクロを使用しています。
      注：鉗子を簡単にTAの下に収まらない場合は、筋膜が完全に除去されていないことが可能であり、それはまだ、筋肉の上に見えるかもしれません。この場合、完全に進む前筋膜を除去します。

3.新鮮凍結筋肉テクニック

1. トラガカントゴムまたはコルクのスライス上に同様の接着剤、凍結化合物（ 例えば、最適な切削温度（OCT）化合物）の少量を置きます。必要に応じて（ 図2A）、凍結前の逆側のコルクのスライスにラベルを付けます。
2. 筋肉の横断面を得るためには、コルクに対して垂直な位置にある筋肉を持って確認しながら、遠位腱を挿入し、外部の約3/4の筋肉のを残すことによって、トラガントガムにTAをシンク（ 図図2（a））。
3. イソペンタンで、アルミ缶（あるいは、金属カップやガラスビーカー）を入力します。 LIQUIを含むデュワー内のイソペンタンの缶を一時停止D窒素は、液体窒素が缶に入力することができません。
   注：イソペンタンは、組織の最適な凍結のために（-150から-160℃）適切な温度に到達する必要があります。いくつかの白色の固体粒子は、缶の底部に形成し、イソペンタンがわずかに粘性になったときに、正しい温度に到達します。
   注：それは凍結アーチファクトにつながることができますように、固体粒子を形成する前にサンプルを凍結しないでください。それが解凍されるまで一方、イソペンタンが完全に固体になった場合、いくつかの白色粒子が依然として存在していることを確認して、室温でそれを残します。
4. Mixterの鉗子を使用して、急速にイソペンタンに筋肉でコルクを浸し、下方に位置する筋肉を維持し、それが完全に液体に浸漬されたときにコルクを解放するようにしてください。試料が浮いている間このように、コルクの唯一の裏面には、液体中に表示されるはずです。
5. SAを残します1分間のイソペンタンでmple。
6. Mixter鉗子（または類似の鉗子）を使用して、筋肉を取ると、少なくとも2分間、液体窒素の中に浸します。
7. 格納-80℃のフリーザー直接標識アルミ箔で個別に試験片をラップし、直ちにドライアイス（-70℃）に配置し、または。
   ステップ3.4から3.7に、手順では、正確な温度を維持し、解凍から標本を防ぐために非常に重要です：注意してください （ 例えば 、℃の冷凍庫に-80転送中。）。組織内に存在しており、最終的には人工物の形成または筋線維（繊維の中心にある大きな白い穴として組織切片上で視覚化）の故障の原因となり、水の微結晶の制御されない融解および再凍結中の温度上昇をもたらします。

冷凍筋肉の4クライオスタットセクショニング

1. クライオスタットチャンバ温度tを設定しますO -20〜-22℃です。
2. 彼らは、少なくとも30分間平衡化することができ、試料のスタブ、ブレード、クライオスタットチャンバ内の試料を入れてください。
3. 試料スタブで凍結化合物（ 例えば、10月化合物）の少量を置き、凍結化合物が固化する前に、検体とコルクを浸します。一方、ブレードホルダーに刃を配置します。
4. ブレードホルダー（ 図2B）で試料ホルダーを方向付けるために付属のネジを使用して試料とブレードの位置を合わせます。
5. 10μmの切片厚を設定します。組織を切断するために進んでください。駆動輪の各ターンのために、試料ホルダーは、ブレードに向かって制御された距離を進みます。
6. 偏スライド（スライドあたり8〜10節）（ 図2C）のセクションを配置します。
7. 切片後、-80℃でスライドを保存します。
   注：試料は、-80℃の冷凍庫に保存し、furtheに再利用することができます適切に処理し、保存されている場合はrを、切片。

5.ルーチンの組織学的染色（ヘマトキシリン＆エオシン染色）

注：いくつかの組織学的染色は、分析によれば、筋肉切片上で実施することができます。形態学的および形態計測分析のためのルーチンの組織学的染色はヘマトキシリン＆エオシン（H＆E）重クロム染色です。ヘマトキシリンは、深い紫色の核を染色します。核染色は、細胞質内の筋繊維のような好酸球の構造を、染色エオシン（ピンク/赤）、で対比されます。

1. 10のためのセクションで完全に空気乾燥冷凍スライド - 室温で15分間、染色トレイにスライドを申し立てる、および染色トラフにトレイを置きます。
2. ヘマトキシリンで1分間染色します。
3. ヘマトキシリンを洗い流すために10分間、かなり弱い水道水ジェットの下で染色トラフを置きます。
4. エオシンのアルコール溶液が使用される場合（Tをスキップし、95％エタノール中で5分間、スライドを浸漬水性エオシン溶液の場合では、彼のステップ）。
5. エオシン溶液で1分間対比染色。
6. 過度のエオシン液を除去するために水ですすいでください。
   注：ヘマトキシリンまたはエオシンのいずれかで染色の最適なタイミングは、各新しいバッチのために定義されるべきです。
7. 50％および70％（数秒ごと）：段階的エタノールシリーズでサンプルを脱水します。急速に100％エタノールで2変化、それぞれ5分、続いて95％エタノールに浸します。
8. キシレンの2の変更、各5分以上でクリア。このステップは、化学フードの下で行わなければなりません。
9. スライド上のメディアをマウントし、カバーガラスで覆い、数滴を適用し、キシレン系封入剤でスライドをマウントします。マウンティング培地はまた、カバーガラススライド上に置き、カバースリップを適用することができます。
   1. スライドとカバーガラスの間に空気の泡を形成することは避けてください。 、気泡を除去する（実装後）縦スライドを維持し、過剰カ月を絞り出すために、優しく鈍鉗子（または類似の鈍ツール）でカバースリップ上で押してuntingメディアや気泡。
10. キシレンは、分析に進む前に、完全に蒸発させるために数時間または一晩フードの下のスライドを保管してください。
11. マウスごとに少なくとも1つの全体の筋肉部分の非重複シリアル画像を用いて、H＆E染色された再生筋肉切片の形態学的および形態計測解析を実行します。 20X倍率で、明視野顕微鏡で画像をキャプチャします。
    注：5匹のマウスの最小数は、測定値の統計的有意性を得ることが推奨されます。
    注：画像解析ソフトウェアは、無料ダウンロードソフトウェアImageJのように、この目的のために利用可能である（http://imagej.nih.gov/ij/）。

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結果

H＆E染色は、骨格筋の再生中に特定の時点で再生プロセスの形態の評価が可能になります。 図3は 、野生型マウスの負傷したTA筋肉に行っ時間経過解析を示します。 図3Aに図式として筋肉は、CTXの注射後3、7、15、30日目に単離されています。 H＆E染色した横断面の代表的な写真が（ 図3B-E）は、時間の経過骨格筋修復のダイナミク...

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ディスカッション

ここでは、骨格筋（ すなわち、CTXの筋肉注射）での急性損傷を誘導するためのプロトコルを記述します。これは、 インビボでの骨格筋再生のダイナミクスを研究するための強力なツールとして広く用いられています。 CTX注入は筋細胞膜の脱分極および繊維¹²の収縮によって引き起こされる筋線維の変性を誘導し、筋肉の再生につながる事象のカスケードを誘発します。...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica	SIGMA ALDRICH	C9759
Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL	BD	324826
Tragacanth Gum	MP BIOMEDICALS,LLC	104792
2-Methylbutane (Isopentane)	SIGMA ALDRICH	78-78-4.
OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat	Bio-optica	05-9801
Feather Microtome Blade S35	Bio-optica	01-S35
Glass Slide Superfrost Plus	Menzel-Gläser	09-OPLUS
Dumon #5 Mirror Finish Forceps	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	11251-23
Scissors Straight Sharp/Sharp	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15024-10
Scissors Noyes Straight	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15012-12
Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	14094-11
Eukitt	Bio-optica	09-00100
Slide Coverslip	BIOSIGMA	VBS651
Xylene	SIGMA ALDRICH	214736
Ethanol 100%	sigma-Aldrich	02860-2.5L
Hematoxyline	J.T. BAKER	3873
Eosin	SIGMA ALDRICH	HT110116
Cryostat	LEICA	CM3050 S