Cardiotoxin 주입에 의한 급성 골격 근육 재생 유도

요약

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

초록

골격 근육 재생이 부상 또는 질병에 대한 응답으로 성인 골격 근육에서 발생하는 생리적 과정이다. 급성 손상 - ​​유도 골격근 재생 근육 재생뿐만 아니라 메커니즘과 다른 플레이어와 관련된 사건을 연구하기 위해 널리 사용되는 강력한 모델 시스템이다. 사실상,이 프로세스의 상세한 기술은 골격근 변성을 초래할 병적 조건의 이해에 필수적이며, 새로운 표적 치료 전략을 식별 돕는다. 본 연구는 cardiotoxin의 단일 근육 내 주사 (CTX)를 통해 마우스의 급성 골격 근육의 재생을 유도하는 상세하고 재생 가능한 프로토콜을 설명합니다. CTX는 뱀 독 독소의 가족에 속하고 결국 재생 이벤트를 트리거 근섬유의 근종 용해술을 발생합니다. 골격 근육 재생의 역학은 근육 부분의 조직 학적 분석에 의해 평가된다. 또한 프로토콜해부 동결 및 경골근 근육뿐만 아니라 널리 후속 학적 및 형태 계측 학적 분석에 사용되는 루틴을 헤 마톡 실린 및 에오신 염색 절단 실험 절차를 도시한다.

서문

포유류 성인 골격 근육 수축 전문화 다핵 근육 세포 (근섬유) fascicules의 그룹에 의해 형성된다. 각각의 근섬유는 정기적으로 반복 조직 수축성 단백질 (액틴과 미오신 필라멘트)로 구성되는 sarcolemma (혈장 막)과 포함 근원 섬유에 의해 둘러싸여 긴 syncytium입니다. 성인의 삶과 휴식 조건에서, 골격 근육은 myonuclei ^1의 매우 낮은 회전율을 가지고, 실제로 sarcolemma 아래 근섬유의 주변에 위치하는 myonuclei은, 세포주기의 G0 단계에서 검거 및 ^{1,2- 증식} 할 수없는된다.

골격 근육 손상을 따라 서로 밀접하게 관련되어 조직 리모델링 여러 이벤트 후에 항상성 도달 재생하는 독특한 능력을 가지고있다. 급성 손상 또는 외상 후 변성이 유발되어 재생 공정 뒤에근육 세포 집단의 거주자 등 다양한 세포 집단을 포함하는, 상기 위성 세포 SCS (). 실제로, 어떠한 환경 적 자극의 부재 하에서, 위성 셀은 정지 상태에 있고 sarcolemma 상기 기저판 사이에 ^3,4- 전문 틈새에 위치하고있다. 부상 또는 질병, 활성화, 새로 형성 근섬유 ⁵ 상승을주고, 손상된 지역으로 이주, 결국 차별화 확산 될 희주 다음과 같습니다. 활성화 SCS는 외상 ^6-8의 사이트에서 모집하는 서로 다른 세포 집단, 주로 염증 세포와 크로스 토크 (cross-talk)을 설정합니다. 이 크로스 토크는 세포가 결국 ⁹ 항상성 선도 분자 신호 구조 변경을 유도하는 규제 패러다임을 수행 할 수 있습니다. 희주, 염증 및 간질 세포, 혈관 신생 과정 및 재 신경 분포 이벤트 외에도이 높은 조직의 복구를 조율 된 방식으로 행동, 참여pecialized들 구조.

근육의 생리를 이해하고, 또한 전체 공정의 깊은 지식을 필요로 치료 전략을 향상시킬뿐만 아니라, 골격근 재생의 다양한 측면을 연구하는데 관심이있다. 여러 가지 실험 방법은 현재 서로 다른 세포 집단의 신호 경로, 및 관련된 분자 메커니즘의 정체성과 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 급성 손상의 마우스 모델은이 과정의 여러 측면을 조사하는 강력한 도구를 나타냅니다. 다른 일반적으로 급성 근육 손상 연구자 프로세스의 말미에 초기 단계에서, 생체 내에서 재생 공정을 수행 할 수 있도록 유도하는 방법을 사용 하였다. 이 프로토콜은 용해술 유도 및 조직 샘플의 분석까지 재생 공정을 트리거 뱀독 - 유래 cardiotoxin의 근육 내 주사 (CTX)의 단계를 설명한다. CTX 주입 후, 마일CE는 실험 조건에 따라 서로 다른 시점에서 희생 될 수 있고, 골격 근육 해부하고 추가 분석을 위해 처리 될 수있다. 마지막으로, 우리는 기본 형태 학적 관찰과 정량적 분석을 수행하도록 조직 절편의 염색 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 높은 재현성으로 ¹⁰ 생체 내에서 급성 골격 근육 재생의 연구 수 있습니다.

프로토콜

모든 실험 동물 연구를위한 제도적 지침에 엄격한에 따라 실시 및 동물 실험에 관한 법률에 따라 공중 보건, 동물 건강, 영양과 건강의 이탈리아 정부의 식품 안전의 부서에 의해 승인되었다. 경추 탈구 절차 IACUC 또는 이에 상응하는 요구 사항에 따라 기관의 기관에 따라 다를 수 있습니다.

경골 전방 근육 1. Cardiotoxin 주입

1. 절차를 시작하기 전에 멸균 인산 완충 용액 (PBS) 또는 물에 cardiotoxin 원액을 희석함으로써 cardiotoxin (CTX)의 용액을 10 μM 작업을 준비한다.
   주 : CTX는 1 ㎎ / ㎖의 물에 용해된다. 70 μm의 주식 솔루션을 준비합니다. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장. 이 프로토콜에 사용 CTX 약 7,000 다 분자량 cardiotoxins의 혼합물이다.
   착용하는 것이 좋습니다 :주의이중 장갑, 위생 마스크, 보호 안경 희석 경우에도, 상기 용액과 접촉을 피하기 위해 매우 조심해야 (또는 안전 안경에, 후드에서 작동하는 것이 좋습니다).
2. 케타민과 자일 라진 (80 ㎎ / ㎏ 및 / kg 몸 질량의 10 mg)을 또는 승인을 사용할 수 마취제의 복강 내 주사하여 마우스를 마취.
3. 마우스 얼굴이 위로, 70 % 에탄올로 뒷다리를 스프레이. 메스의 도움으로 전 경골근 (TA) 근육의 정확한 위치를 시각화하기 위해 무릎 아래 낮은 다리의 앞쪽 부분에서 떨어져 머리를 잘라.
   참고 : TA 근육이 뼈에 측면을가는 발목에서 끝나는, 경골의 근위 몸에서 발생한다. 긴 힘줄 (그림 1A 참조) 발목에서 다리로 확장합니다.
4. 다시 천천히 플런저를 잡아 당겨 주사기로 솔루션의 ~ 100 μL를 그립니다.
5. (기포 제거 수직 주사기 유지바늘과 위쪽). 조심스럽게 아래로 플런저를 끌어와 튜브의 내부에 부착 된 기포가 위쪽으로 올 수 있도록 주사기의 측면을 누릅니다. 천천히 큰 공기 방울을 해제 플런저를 누릅니다. 액체의 몇 방울 바늘을 올 것이다. 이 시점에서, cardiotoxin의 독성 주어, 그것을 분산 튜브로 다시 액체를 픽업하지해야합니다.
6. 원하는 투여 량에 도달 할 때까지 주사기로 상기 용액을 철회. 각 TA 근육에 대한 CTX 용액 20 μL를 주입한다.
7. 무릎을 향해 건에서 지침과 경골 뼈의 위치에 따라 TA의 중심에 바늘을 삽입합니다. 조교가 얇은 조직이기 때문에, (2/3 mm 깊이 바늘, 약 10 ° ~ 20 °의 각도를 삽입) 너무 깊이하지 않고 주사를 수행하고, 근육 자체 (그림 1A)을 넘어 마십시오.
8. 즉시 주사 후 바늘을 꺼내하지만 2 기다리지 말고 - 누출을 방지하기 위해 3들CTX의 나이는 근육에서 삭제합니다.
9. 쥐가 마취 때문에, 깨어 사용 된 에탄올 체온을 줄일 때까지 절차 후 (37 ° C에서) 가열 접시에 새장을 배치합니다.

2. 앞정 전방 격리

주 : 근육 실험 조건에 따라 cardiotoxin 주사 후에 여러 시점에서 분리 될 수있다.

1. 자궁 경부 전위로 마우스를 희생.
2. 70 % 에탄올로 뒷다리 스프레이. 절차 동안, 동물을 누르고 지지체에 고정 될 수있다.
3. (다리 위) 근위 힘줄 레벨에서 피부를 잘라 피부 아래 위의 블레이드를 삽입하고, 무릎의 방향을 위쪽으로 피부를 잘라. 집게의 도움으로, 피부를 위로 당겨 완전히 근육을 노출. 조심스럽게 피부와 관심의 영역에서 머리를 모두 제거합니다.
4. 일에 천천히 끼거나 절단하여 근막을 (제거핀셋 팁 또는 경골 (도 1b)의 대향 측) 근육의 극단적 외주 위 해부와 미세한 마이크로. 한 번 깨진 부드럽게 얇은 팁 핀셋의 도움으로 근막을 제거; 기본 근육의 손상을 방지.
   주의 : 다른 근육 및 기관과 마찬가지로, TA는 밴드 (다리 깊은 근막) 깊은 피부 아래에 놓여 있고 그 쉽게 기본 근육을 분리 제거 할 필요가 결합 조직의 얇은 판으로 덮여있다.
5. 말단 TA 건과 병치되어 다리 위의 신근 심지 건, 시각화합니다. 신근 심지 Longus (EDL) 근육의 힘줄이 약간 TA 건 아래에 있습니다. 성인 쥐의 힘줄은 육안으로 볼 수 있습니다.
6. 다음 두 가지 방법 중 하나 다음 TA 근육을 제거합니다 :
   1. 머무르고, 미세 마이크로 가위를 해부와 두 힘줄을 잘라 전방 측을 향해을 당겨g 집게와 힘줄. 두 힘줄 별개 근육을 분리 반대 방향으로 부드럽게 당겨.
   2. 얇은 팁 핀셋의 도움으로, 힘줄 자체 (그림 1C, 위 사진) 아래의 팁을 전달하여 신근 심지 건에서 말단 TA 건을 분리합니다. 부드럽게 기본 근육 (그림 1C, 아래 사진)에서 분리하기 위해 TA 아래 핀셋을 밀어 넣습니다.
   3. 약간 상승을 유지 조교 건 잘라 근육 아래에있는 핀셋을 잡고 조심스럽게 무릎 (그림 1D, 왼쪽 사진)를 부착 이하 만 지역까지 위쪽으로 당깁니다. 가위 (그림 1D, 오른쪽 사진)와 근육의 가장자리 다음, 무릎 아래 TA를 잘라.
      참고 : 근육이 약간 측면에 부착 된 상태를 유지하는 경우를 분리하기 위해 가위를 해부 미세 마이크로를 사용합니다.
      참고 : 집게 쉽게 TA 아래에 맞지 않으면,이는 밴드가 완전히 제거되지 않은 것으로 가능하고, 그것은 여전히 근육 위에 표시 될 수있다. 이 경우, 완전히 진행하기 전에 밴드를 제거합니다.

3. 신선한 냉동 근육 기술

1. 트라가 칸트 검 또는 코르크의 조각에 비슷한 접착제 동결 화합물 (예를 들어, 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물)의 작은 금액을 놓습니다. 동결하기 전에 뒷면에 코르크의 조각 레이블, 필요한 (그림 2A)의 경우.
2. 근육의 횡단면을 얻기 위해, 코르크에 대하여 수직 위치에서 근육을 확실하게 선단 힘줄 넣고 외부 3/4 근육을 떠나는 트라가 칸트 검으로 TA 싱크 (도 2A).
3. 알루미늄 캔을 작성 (또는, 금속 컵이나 유리 비이커) 이소 펜탄과. 듀어 포함하여 Liqui에 이소 펜탄의 캔을 일시 중단D 질소는 액체 질소는 캔에 입력 할 수 없습니다.
   참고 : 이소 펜탄은 조직의 최적의 동결에 대해 (-150에서 -160 ° C에) 적절한 온도에 도달해야합니다. 일부 흰색 고체 입자가 상기 캔의 바닥에 형성되고 펜탄 약간 점성이되면 정확한 온도에 도달한다.
   참고 : 냉동 유물로 이어질 수 있으므로, 고체 입자의 형성 전에 샘플을 동결하지 마십시오. 펜탄 완전히 단단한지면이 해동 될 때까지 한편, 약간 백색 입자가 여전히 존재하는지 확인하고, 실온에서두고.
4. Mixter 집게를 사용하여 빠르게 근육 위치 아래를 유지하면서 이소 펜탄에 근육과 코르크를 찍어, 그리고 완전히 액체에 침지 때 코르크를 해제해야합니다. 시료가 떠있는 동안 이러한 방법으로, 코르크의 뒷면은 액체에 표시해야한다.
5. 는 sa를 남겨1 분 동안 이소 펜탄에 mple.
6. Mixter 집게 (또는 유사한 집게)을 사용하여 근육을 적어도 2 분 동안 액체 질소에 담궈.
7. A의 보관 -80 C의 냉동고 ° 직접 표시 알루미늄 호일에 개별적으로 표본을 감싸 즉시 드라이 아이스 (-70 °에 C)에 배치하거나.
   주 : 절차를 통하여, 단계 3.4에서 3.7로, 그것은 정확한 온도를 유지하고 (. C 냉동기로 -80 ° 이송 중에 예) 해동로부터 시험편을 방지하는 것이 매우 중요하다. 제어되지 해동 조직 내에 존재하며, 결국 인공물의 형성 또는 근육 섬유의 파괴를 야기하는 물 미결정의 재 냉각의 온도 상승 결과 (섬유의 중심에 큰 화이트 홀로 조직 절편을 가시화).

냉동 근육의 (4)의 저온 단면

1. 그라 이오 스탯 챔버 온도 t 설정오 -20 -22 ° C까지.
2. 이를 최소 30 분간 평형을 허용 시험편 스터브 블레이드 및 저온 유지 챔버 내의 시료를 넣어.
3. 시편 스텁에 냉동 화합물 (예를 들어, 10월 화합물)의 작은 금액을 놓고 냉동 화합물 응고 전에 시편으로 코르크를 체험. 한편, 블레이드 홀더 블레이드를 배치합니다.
4. 블레이드 홀더 (도 2B)로 시험편 홀더 방향을 제공된 나사를 사용하여 시험편 및 블레이드 정렬.
5. 10 μm의 섹션 두께를 설정합니다. 조직을 잘라 진행합니다. 구동 휠의 각각의 차례를 시편 홀더 블레이드를 향해 제어 거리를 진행한다.
6. 편광 슬라이드 (슬라이드 당 8 ~ 10 절) (그림 2C)에 섹션을 놓습니다.
7. 절편 한 후, -80 ° C에서 슬라이드를 저장합니다.
   주 : 시료는 -80 ° C에 냉동 저장 furthe 위해 재사용 될 수있다제대로 처리하고 저장하는 경우 R, 절편.

5. 일상적인 조직 학적 염색 (헤 마톡 실린 및 에오신 얼룩)

주 : 여러 학적 얼룩 분석에 의한 근육의 부분에서 수행 될 수있다. 형태 학적 및 형태 계측 학적 분석을위한 일상적인 조직 학적 염색은 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 중크롬산 얼룩입니다. 헤 마톡 실린은 핵에게 깊은 보라색 얼룩. 핵 염색 에오신으로 대조되는 이러한 세포질의 근섬유 같은 산성 구조, 얼룩 (핑크 / 레드).

1. 완전히 자연 건조 10 절 냉동 슬라이드 - 실온에서 15 분, 염색 트레이에 슬라이드를 제출하고, 염색 통에 트레이를 넣어.
2. 헤 마톡 실린 1 분 동안 얼룩.
3. 10 분은 헤 마톡 실린를 세척하는 상당히 약한 수돗물 제트에서 염색 통을 놓습니다.
4. 에오신의 알콜 용액을 사용할 경우 t을 이동 (5 분 95 % 에탄올에 대한 슬라이드를 빠져수성 에오신 솔루션의 경우 자신의 단계).
5. 에오신 용액으로 1 분간 Counterstain과.
6. 과도한 에오신 용액을 제거하기 위해 물로 씻어.
   참고 : 헤 마톡 실린이나 에오신 중 하나와 염색의 최적의 타이밍은 각각의 새 배치에 대해 정의해야합니다.
7. 채점 에탄올 시리즈 샘플 탈수 50 % 및 70 % (몇 초간 각각). 신속하게 100 %의 에탄올이 변화를 5 분마다 한 후, 95 % 에탄올에 담가.
8. 자일 렌의 2 변경, 각 5 분 이상에 걸린. 이 단계는 화학 후드 하에서 수행되어야한다.
9. 슬라이드에 미디어를 장착하고 커버 슬립으로 다루는 몇 방울을 적용, 크실렌 기반 장착 매체 슬라이드를 탑재합니다. 장착 매체는 커버 슬립 슬라이드에 넣어 커버 슬립에 적용될 수있다.
   1. 슬라이드와 커버 슬립 사이의 공기 방울을 형성하지 마십시오. 기포를 제거 (설치 후) 수직 슬라이드를 유지하고 과잉 개월을 짜려면부드럽게 무딘 집게 (또는 유사한 무딘 도구)와 커버 슬립 눌러서 unting 매체 기포.
10. 크실렌이 분석을 진행하기 전에 완전히 증발 할 수 있도록 밤새 몇 시간 동안 후드 슬라이드를 유지하거나.
11. 마우스 당 적어도 하나의 전체 근육 부의 겹치지 일련의 이미지를 이용하여 H & E 염색 된 근육의 재생 구간의 형태 학적 및 형태 계측 학적 분석을 수행한다. 20X 배율 밝은 필드 현미경 이미지를 캡처.
    주 : 5 마우스의 최소 개수는 측정의 통계적 유의성을 구하는 것을 권장한다.
    참고 : 이미지 분석 소프트웨어는 (http://imagej.nih.gov/ij/)를 무료로 다운로드 소프트웨어 ImageJ에,이 목적을 위해 사용할 수 있습니다.

결과

H&E staining allows for the evaluation of the morphology of the regeneration process at specific time points during skeletal muscle regeneration. Figure 3 shows the time course analysis performed on injured TA muscles of wild type mice. Muscles have been isolated at 3, 7, 15, and 30 days after CTX injection, as schematized in Figure 3A. Representative pictures of H&E-stained transverse sections show the dynamics of skeletal muscle repair over time...

토론

Here, we describe a protocol to induce acute injury in skeletal muscle (i.e., the intramuscular injection of CTX). It is widely used as a powerful tool to study the dynamics of skeletal muscle regeneration in vivo. CTX injection induces the degeneration of muscle fibers, which is caused by the depolarization of the sarcolemma and the contraction of the fibers¹², and triggers the cascade of events that leads to muscle regeneration. Skeletal muscles are dissected at desired time points after th...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica	SIGMA ALDRICH	C9759
Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL	BD	324826
Tragacanth Gum	MP BIOMEDICALS,LLC	104792
2-Methylbutane (Isopentane)	SIGMA ALDRICH	78-78-4.
OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat	Bio-optica	05-9801
Feather Microtome Blade S35	Bio-optica	01-S35
Glass Slide Superfrost Plus	Menzel-Gläser	09-OPLUS
Dumon #5 Mirror Finish Forceps	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	11251-23
Scissors Straight Sharp/Sharp	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15024-10
Scissors Noyes Straight	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15012-12
Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	14094-11
Eukitt	Bio-optica	09-00100
Slide Coverslip	BIOSIGMA	VBS651
Xylene	SIGMA ALDRICH	214736
Ethanol 100%	sigma-Aldrich	02860-2.5L
Hematoxyline	J.T. BAKER	3873
Eosin	SIGMA ALDRICH	HT110116
Cryostat	LEICA	CM3050 S