Indução da Aguda Skeletal regeneração muscular por cardiotoxina Injection

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para induzir a regeneração do músculo esquelético aguda em ratos adultos e manipulações subsequentes dos músculos, como dissecção, corte, congelação, coloração de rotina e análise de células musculares área de secção transversal.

Resumo

regeneração do músculo esquelético é um processo fisiológico que ocorre em músculos esqueléticos adulto em resposta a uma lesão ou doença. a regeneração do músculo esquelético induzido por lesão aguda é um modelo amplamente usado do sistema, poderoso para estudar os acontecimentos envolvidos na regeneração muscular, bem como os mecanismos e os jogadores diferentes. Com efeito, o conhecimento detalhado deste processo é essencial para uma melhor compreensão das condições patológicas que conduzem à degeneração do músculo esquelético, e auxilia na identificação de novas estratégias terapêuticas dirigidas. O presente trabalho descreve um protocolo detalhado e reprodutível para induzir a regeneração do músculo esquelético aguda em ratos por meio de uma única injecção intramuscular de cardiotoxina (CTX). CTX pertence à família de toxinas de veneno de cobra e provoca miólise de miofibras, que eventualmente provoca os eventos de regeneração. A dinâmica de regeneração do músculo esquelético é avaliada por análise histológica de secções do músculo. O protocolo tambémilustra os procedimentos experimentais para dissecar, congelação, e cortando o músculo tibial anterior, bem como a rotina de coloração com Hematoxilina e Eosina que é amplamente utilizado para a análise morfológico e morfométrico subsequente.

Introdução

músculos esqueléticos mamíferos adultos são formados por grupos de fascículos de células musculares multinucleadas (miofibras) que são especializados para contracção. Cada fibra muscular é um sincício alongado, cercado pelo sarcolema (membrana plasmática) e contendo miofibrilas, que são compostas de proteínas contráteis regularmente e repetidamente organizados (actina e miosina). Na vida adulta e em condições de repouso, músculos esqueléticos têm uma muito baixa rotatividade de seu mionúcleos ^1; Com efeito, os mionúcleos, que estão localizados na periferia da fibra muscular, sob o sarcolema, são presos na fase G0 do ciclo celular e são incapazes de proliferar ^1,2.

Os músculos esqueléticos têm a capacidade peculiar para regenerar seguinte danos, atingindo homeostase depois de vários eventos de remodelação de tecidos que estão fortemente relacionados uns aos outros. Após uma lesão aguda ou trauma, degeneração é induzida, seguida por processos de regeneraçãoque envolvem diferentes populações de células, incluindo uma população residente de células musculares, as células satélites (SCS). Com efeito, na ausência de quaisquer estímulos ambientais, as células satélites estão num estado de repouso e situam-se num nicho especializado entre o sarcolema e a ^3,4 lâmina basal. Na sequência de uma lesão ou doença, a SCS se tornam activadas, proliferam, migram para as áreas danificadas, e, eventualmente, diferenciar-se, dando origem a recém-formadas miofibras ^5. SCs ativados estabelecer cross-talk com diferentes populações de células, principalmente células inflamatórias, que são recrutadas no local do trauma ^6-8. Este cross-talk permite que as células seguem um paradigma regulamentada pelo qual os sinais moleculares conduzir modificações estruturais, o que levou à homeostase ^9. Além SCs, células inflamatórias e intersticiais, processos angiogénicos e eventos re-inervação também estão envolvidos, atuando de forma coordenada para reparar este altamente organizado e sestrutura pecialized.

Há um grande interesse em estudar diferentes aspectos da regeneração do músculo esquelético, não só para compreensão da fisiologia do músculo, mas também para melhorar estratégias terapêuticas que requerem conhecimento mais profundo de todo o processo. Várias abordagens experimentais estão actualmente disponíveis para estudar a identidade e função das diferentes populações de células, as vias de sinalização, e os mecanismos moleculares envolvidos. modelos de rato de lesão aguda representa uma ferramenta poderosa para investigar muitos aspectos deste processo. Diferentes técnicas vulgarmente usadas para induzir lesão muscular aguda permitem acompanhar o processo de regeneração in vivo, a partir das fases muito precoces para o final do processo. Este protocolo descreve os passos da injecção intramuscular de cardiotoxina derivado de veneno de cobra-(CTX), que induz miólise e desencadeia o processo de regeneração, até a análise de amostras de tecido. Após a injecção CTX, MIce pode ser sacrificados em diferentes pontos de tempo, dependendo dos requisitos experimentais, e os músculos esqueléticos podem ser dissecados e processados ​​para análise posterior. Finalmente, descreve-se o protocolo de coloração de secções de tecido para realizar observações morfológicas e análises quantitativas de base. Este protocolo permite o estudo de regeneração do músculo esquelético aguda in vivo de um modo altamente reprodutível ^10.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes institucionais para a pesquisa animal e aprovado pelo Departamento de Saúde Pública, Saúde Animal, Nutrição e Segurança Alimentar do Ministério da Saúde italiano, em conformidade com a lei sobre a experimentação animal. procedimentos deslocamento cervical podem variar de instituição para instituição com base em IACUC ou seus requisitos equivalentes.

1. Injection cardiotoxina no músculo tibial anterior

1. Preparar uma solução 10 uM de cardiotoxina (CTX) de trabalho por diluição da solução estoque em cardiotoxina tamponada com fosfato estéril salino (PBS) ou em água, antes de iniciar o procedimento.
   Nota: CTX é solúvel em água a 1 mg / mL. Prepara-se uma solução estoque de 70? M. Alíquotas e armazenar a -20 ° C. CTX utilizado para este protocolo é uma mistura de cardiotoxinas tendo um peso molecular de cerca de 7000 Da.
   CUIDADO: Sugere-se ao desgasteluvas duplas, uma máscara de higiene, e óculos de segurança (em alternativa para óculos de segurança, recomenda-se a trabalhar sob um capuz) e de ter muito cuidado para evitar qualquer contacto com a solução, mesmo se diluído.
2. Anestesiar os ratos por injecção intraperitoneal de cetamina e xilazina (80 mg / kg e 10 mg / kg de massa corporal) ou outro anestésico disponível aprovado.
3. Com o mouse face para cima, pulverizar as patas traseiras com 70% de etanol. Para visualizar a localização exacta do músculo tibial anterior (TA), com a ajuda de um bisturi, cortar o cabelo de distância na parte anterior da parte inferior da perna, abaixo do joelho.
   Nota: O músculo TA surge a partir do corpo proximal da tíbia, que vai para baixo lateralmente ao osso e que termina no tornozelo. A sua longa tendão se estende para o outro lado do pé do tornozelo (ver Figura 1A).
4. Desenhar ~ 100 mL da solução para a seringa puxando o êmbolo para trás lentamente.
5. Remova as bolhas de ar, segurando a seringa na posição vertical (com a agulha para cima). Gentilmente puxar o êmbolo para baixo e toque no lado da seringa para ajudar as bolhas de ar ligado à parte interna do tubo vêm para cima. Lentamente pressione o êmbolo para liberar grandes bolhas de ar. Algumas gotas de líquido vai sair da agulha. Neste ponto, certifique-se de escolher o líquido novamente para dentro do tubo e não dispersá-lo, dada a toxicidade do cardiotoxina.
6. Aspirar a solução para a seringa até que a dose desejada seja atingida. Injectar 20 mL de solução de CTX para cada músculo TA.
7. Inserir a agulha no centro da TA, seguindo a posição da tíbia, como orientação, a partir do tendão para o joelho. Uma vez que o TA é um tecido fino, realizar a injeção sem ir muito profundo (inserir a agulha 2/3 mm de profundidade, a cerca de 10 ° a 20 ° de ângulo), e evitar ir além do próprio (Figura 1A) muscular.
8. Não puxe a agulha imediatamente após a injeção, mas esperar 2 - 3 s para evitar vazamentoCTX idade de gotas a partir do músculo.
9. Após o procedimento, colocar a gaiola sobre uma placa aquecida (a 37 ° C) até que os ratinhos está acordado, uma vez que o anestésico e o etanol usado reduzir a temperatura corporal.

2. tibial anterior Isolamento

Nota: Os músculos podem ser isolados em diferentes pontos de tempo após a injecção cardiotoxina acordo com as necessidades experimentais.

1. Sacrificar o mouse por deslocamento cervical.
2. Pulverizar as patas traseiras com 70% de etanol. Durante o procedimento, o animal pode ser fixo a um suporte para segurá-la para baixo.
3. Cortar a pele ao nível do tendão proximal (acima do pé), inserir uma das lâminas da tesoura sob a pele, e cortar a pele para cima, na direcção do joelho. Com a ajuda de fórceps, puxar para cima da pele e expor o músculo inteiramente. Cuidadosamente retire toda a pele e os cabelos da área de interesse.
4. Eliminar a fáscia lentamente beliscar ou cortar (com them ponta pinça ou com micro tesouras de dissecação fina) da periferia extrema do músculo no lado oposto da tíbia (Figura 1B). Uma vez quebrado, retire cuidadosamente a fáscia com a ajuda de uma pinça fina de ponta; evitar danificar o músculo subjacente.
   Nota: Tal como acontece com outros músculos e órgãos, a AT é coberto por fáscia (fáscia profunda da perna), uma folha fina de tecido conjuntivo que se encontra debaixo da pele e que precisa de ser removido para isolar facilmente o músculo subjacente.
5. Visualize o tendão TA distal eo tendão extensor digitorum acima do pé, que se justapõem. O tendão do músculo extensor longo dos dedos (EDL) situa-se ligeiramente abaixo do tendão TA. Tendões de ratos adultos são visíveis a olho nu.
6. Remover o músculo TA seguindo uma das duas técnicas seguintes:
   1. Cortar ambos os tendões com micro finas dissecando tesoura e puxá-los para o lado proximal, segurandog tendões com uma pinça. Separe os dois tendões, puxando-os suavemente em direções opostas para separar os músculos.
   2. Com a ajuda de uma pinça fina-tip, separar o tendão TA distai do extensor digitorum do tendão, passando a ponta inferior do próprio tendão (Figura 1C, quadro superior). Deslize suavemente a pinça abaixo do TA para separá-lo dos músculos subjacentes (Figura 1C, imagem inferior).
   3. Segure a pinça sob o músculo para mantê-lo ligeiramente levantada, cortou o tendão de TA, e puxe-o para cima até que apenas a área abaixo do joelho está ligado (Figura 1D, foto à esquerda). Cortar a TA abaixo do joelho, a seguir a borda do músculo com as tesouras (Figura 1D, imagem da direita).
      Nota: Se o músculo permanece ligeiramente ligado aos lados, utilizar tesouras de dissecação de micro fino para ajudar a retirá-la.
      Nota: Se a pinça não se encaixar facilmente abaixo da TA,é possível que a fáscia não tenha sido completamente removida, e ainda pode ser visível na parte superior do músculo. Neste caso, remover completamente a fáscia antes de prosseguir.

3. fresca Técnica músculo congelado

1. Colocar uma pequena quantidade de goma de tragacanto ou um adesivo de congelação composto semelhante (por exemplo, temperatura de corte óptima (OCT) composto) sobre uma fatia de cortiça. Rotular fatia da cortiça no verso antes de congelar, se necessário (Figura 2A).
2. De modo a obter secções transversais do músculo, a pia ta na goma de tragacanto através da inserção do tendão distai e deixando cerca de 3/4 do músculo do lado de fora, tornando-se de ter o músculo em posição perpendicular em relação à rolha (Figura 2A).
3. Encha uma lata de alumínio (em alternativa, um copo de metal ou uma taça de vidro), com isopentano. Suspender a lata de isopentano em um contendo liqui Deward azoto, não permitindo que o azoto líquido, para entrar para dentro da lata.
   Nota: O isopentano tem de atingir a temperatura adequada (de -150 a -160 ° C) para a congelação óptima do tecido. A temperatura correcta quando é atingido algumas partículas sólidas brancas formar na parte inferior da lata e o isopentano torna-se ligeiramente viscoso.
   Nota: Não congelar a amostra antes da formação das partículas sólidas, uma vez que pode levar a artefactos de congelação. Por outro lado, se o isopentano torna-se completamente sólida, deixá-lo à temperatura ambiente até que seja descongelado, certificando-se que algumas partículas brancas ainda estão presentes.
4. Utilizando uma pinça Mixter, mergulhe rapidamente a rolha com o músculo para o isopentano, mantendo os para baixo do músculo posicionado, e certifique-se para liberar a cortiça quando ele está completamente imerso no líquido. Desta forma, enquanto a amostra flutua, apenas o lado inverso da rolha deve ser visível no líquido.
5. Deixe a sample no isopentano durante 1 min.
6. Utilizando uma pinça Mixter (ou pinças semelhantes), tome o músculo e mergulhá-lo em nitrogênio líquido por pelo menos 2 min.
7. Enrole as amostras individualmente em papel alumínio marcado e colocá-los imediatamente em gelo seco (-70 ° C), ou diretamente armazená-los em um -80 ° C congelador.
   Nota: Durante todo o processo, a partir das etapas 3,4-3,7, é extremamente importante para manter a temperatura correcta e para evitar que os espécimes de descongelamento (por exemplo, durante a transferência para a -80 ° C congelador.). As aumento da temperatura resulta na descongelação não controlada e recongelar os microcristais de água que se encontram presentes no interior do tecido e, finalmente, provoca a formação de artefactos ou a destruição das fibras musculares (visualizado em secções de tecido como grandes furos branco no centro da fibra).

4. Cryostat Seccionamento dos músculos congelados

1. Defina a temperatura da câmara de criostato tO -20 a -22 ° C.
2. Coloque a ponta da amostra, a lâmina, e a amostra na câmara de criostato, permitindo-lhes a equilibrar durante pelo menos 30 min.
3. Coloque uma pequena quantidade de composto de congelamento (por exemplo, outubro composto) no topo da amostra e mergulhe a cortiça com a amostra antes dos solidifica compostos de congelamento. No entanto, colocar a lâmina com o suporte da lâmina.
4. Alinhar o espécime e a lâmina com os parafusos fornecidos para orientar o suporte da amostra com o suporte da lâmina (Figura 2B).
5. Defina a espessura de corte de 10 mm. Avance para cortar o tecido. Para cada volta da roda de carro, suporte para amostra avança uma distância controlada para a lâmina.
6. Coloque as secções sobre uma lâmina polarizada (8 a 10 secção por lâmina) (Figura 2C).
7. Após o corte, armazenar as lâminas a -80 ° C.
   Nota: A amostra pode ser armazenada num congelador a -80 ° C e reutilizada para further seccionamento, se devidamente manipulados e armazenados.

5. rotina histológica de coloração (Hematoxilina e Eosina Stains)

Nota: várias manchas histológicas pode ser realizada em secções musculares de acordo com a análise. Uma mancha histológica de rotina para análise morfológica e morfométrica é o Hematoxilina e Eosina (H & E) mancha bichromic. A hematoxilina cora os núcleos de um roxo profundo. coloração nuclear é contrastado com eosina (rosa / vermelho), que mancha estruturas eosinofílica, tais como fibras musculares no citoplasma.

1. Completamente ar seco lâminas congeladas com secções para 10 - 15 min à temperatura ambiente, apresentar os slides em uma bandeja coloração, e colocou a bandeja em uma calha coloração.
2. Manchar durante 1 min com hematoxilina.
3. Coloque a calha de coloração sob um bastante fraco jato de água da torneira por 10 min para lavar a hematoxilina.
4. Mergulhar as lâminas durante 5 min em etanol a 95%, se uma solução alcoólica de eosina vai ser usado (t pularo seu passo, no caso de uma solução aquosa eosina).
5. Contracoloração durante 1 min com solução de eosina.
6. Enxágüe com água para eliminar a solução de eosina excessiva.
   Nota: O tempo certo de coloração ou com hematoxilina ou eosina devem ser definidos para cada novo lote.
7. Desidratar as amostras numa série de etanol graduada: 50% e 70% (de alguns segundos cada). Rapidamente imerso em etanol a 95%, seguido de 2 mudanças em etanol a 100%, 5 min cada.
8. Limpar em 2 mudanças de xileno, cada 5 minutos ou mais. Este passo deve ser realizado sob uma capa química.
9. Montar as lâminas com um meio de montagem à base de xileno, aplicando-se algumas gotas de meio de montagem sobre a lâmina e cobertura com uma lamela. O meio de montagem também pode ser aplicado para a lamela e as lamelas colocado na corrediça.
   1. Evitar a formação de bolhas de ar entre a corrediça ea lamela. Para eliminar as bolhas de ar, mantenha o controle deslizante vertical (após a montagem) e esprema o excesso de mounting médio e bolhas de ar, pressionando suavemente sobre a lamela com uma pinça sem corte (ou uma ferramenta sem corte similar).
10. Manter as lâminas sob o capô por algumas horas ou durante a noite para deixar o xileno evapora-se completamente antes de prosseguir para a análise.
11. Realizar a análise morfológica e morfométrica das seções musculares em regeneração H & E manchada pelo uso de imagens em série não sobrepostos de pelo menos uma seção de músculo inteiro per mouse. Capturar imagens com um microscópio de campo brilhante, com ampliação de 20x.
    Nota: um número mínimo de 5 ratos é recomendada para se obter significância estatística das medições.
    Nota: software de análise de imagem está disponível para esta finalidade, como o download gratuito ImageJ software (http://imagej.nih.gov/ij/).

Resultados

H & E coloração permite uma avaliação da morfologia do processo de regeneração em pontos de tempo específicos durante a regeneração do músculo esquelético. A Figura 3 mostra o decurso de tempo de análise realizada em músculos TA feridas de ratinhos do tipo selvagem. Músculos foram isolados em 3, 7, 15 e 30 dias após a injecção CTX, como esquematizado na Figura 3A. Representativos de imagens de secções transversais de H & E-cora...

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo para induzir lesão aguda no músculo esquelético (ou seja, a injeção intramuscular de CTX). É amplamente utilizado como uma ferramenta poderosa para o estudo da dinâmica de regeneração do músculo esquelético in vivo. CTX injecção induz a degeneração das fibras musculares, que é causada pela despolarização do sarcolema e a contracção das fibras ^12, e desencadeia a cascata de eventos que conduz à regeneração muscular. Os músculos esqueléti...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica	SIGMA ALDRICH	C9759
Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G x 8 mm - Da 0.3 mL	BD	324826
Tragacanth Gum	MP BIOMEDICALS,LLC	104792
2-Methylbutane (Isopentane)	SIGMA ALDRICH	78-78-4.
OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat	Bio-optica	05-9801
Feather Microtome Blade S35	Bio-optica	01-S35
Glass Slide Superfrost Plus	Menzel-Gläser	09-OPLUS
Dumon #5 Mirror Finish Forceps	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	11251-23
Scissors Straight Sharp/Sharp	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15024-10
Scissors Noyes Straight	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	15012-12
Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10.5 cm	2BIOLOGICAL INSTRUMENTS	14094-11
Eukitt	Bio-optica	09-00100
Slide Coverslip	BIOSIGMA	VBS651
Xylene	SIGMA ALDRICH	214736
Ethanol 100%	sigma-Aldrich	02860-2.5L
Hematoxyline	J.T. BAKER	3873
Eosin	SIGMA ALDRICH	HT110116
Cryostat	LEICA	CM3050 S