A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
המיטוכונדריה יכול לנצל את הפוטנציאל אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי שלהם (Δ Ψm) כדי לעקל סידן (Ca 2 +), המאפשר להם לעצב Ca cytosolic 2+ איתות בתוך התא. אנו מתארים שיטה המיטוכונדריה מדידה בו זמנית ספיגת Ca 2 + ו ΔΨ מ בתאים חיים באמצעות צבעי ניאון ו מיקרוסקופיה confocal.
מלבד התפקיד החיוני שלהם ביצירת ATP, המיטוכונדריה גם לשמש סידן מקומי (Ca 2 +) מאגרים להסדיר בחוזקה ריכוז תאיים Ca 2 +. לשם כך, המיטוכונדריה לנצל את הפוטנציאל אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי שלהם (ΔΨ מ ') כדי לעקל Ca 2+. זרם של Ca 2 + לתוך המיטוכונדריה מגרה שלושה דהידרוגנאז שער הגבלת של מעגל החומצה הציטרית, הגדלת העברת אלקטרונים דרך זרחון חמצוני (OXPHOS) תסביכים. גירוי זה מפעיל כיום ΔΨ מ ', אשר מתפזר באופן זמני כמו יוני סידן החיובי לחצות את הקרום הפנימי של המיטוכונדריה לתוך המטריצה המיטוכונדריה.
אנו מתארים כאן שיטה המיטוכונדריה מדידה בו זמנית ספיגת Ca 2 + ו ΔΨ מ בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ confocal. על ידי permeabilizing התאים, Ca המיטוכונדריה 2+ יכוללהימדד באמצעות Ca 2 + אינדיקטור Fluo-4, בבוקר, עם מדידת ΔΨ מ באמצעות אסתר tetramethylrhodamine, מתיל צבע פלואורסצנטי ניאון, פרכלורט (TMRM). היתרון של מערכת זו הוא כי יש חפיפה ספקטרלית מעט מאוד בין צבעי ניאון, המאפשר מדידה מדויקת של המיטוכונדריה Ca 2 + ו ΔΨ מ זמנית. באמצעות תוספת הרציפים של aliquots Ca 2 +, Ca 2 + המיטוכונדריה ספיגה ניתן לנטר, ואת הריכוז שבו Ca 2 + גורם מעבר חדירות קרום המיטוכונדריה ואובדן ΔΨ אני נחוש.
המיטוכונדריה לשחק תפקיד חשוב בוויסות ריכוז תאיים Ca 2 + על ידי מתנהג כמו מאגרים מקומיים Ca 2 + 1. Ca 2 + מזין את המיטוכונדריה דרך uniporter Ca 2+, תהליך מונע על ידי שיפוע אלקטרוכימיים שקיים על פני הקרום הפנימי של המיטוכונדריה (מ ΔΨ) 2. פעם בתוך מטריקס המיטוכונדריה, Ca 2 + יכול להפעיל זרחון חמצוני ידי גירוי שלושה דהידרוגנאז ומגביל הקצב של מחזור חומצת לימון 3. גירוי זה מפעיל כיום ΔΨ מ ', אשר מתפזר באופן זמני כמו יוני סידן החיובי לחצות את הקרום הפנימי של המיטוכונדריה לתוך המטריצה המיטוכונדריה. אם ריכוז Ca 2 + בתוך המיטוכונדריה הופך להיות מאוד גבוה, מעבר חדירות המיטוכונדריה יכול להיות יזם, וכתוצאה מכך את הפיזור מ ΔΨ, את cessation של זרחון חמצוני האינדוקציה של מוות של תאי מסלולי איתות 4.
התפקיד החשוב כי המיטוכונדריה לשחק חציצה המרחבי של סידן הסלולר הופך את הניטור המדויק של סידן המיטוכונדריה קריטי. שיטות שונות הוקמו לפקח סידן המיטוכונדריה, כולל את השימוש של צבעים המבוססים rhodamine. צבע אחד כזה, רוד-2, AM, הוא די יעיל מחיצות למיטוכונדריה כדי למדוד את רמות Ca 2+ המיטוכונדריה 5, 6. עם זאת, הטיפול חייב לשמש קצת צבע יצטברו אברונים אחרים, כגון ליפוזומים, או להישאר cytosol התא. אף על פי כן, ניתוחים במורד הזרם יכול להיות מועסק על מנת להבחין אותות אלה מאלה מהמיטוכונדריה 7.
טכניקה נוספת לפקח סידן המיטוכונדריה מנצלת כתב ניאון בונה 8 עד>. היתרון של בדיקות המקודדות גנטי אלה הוא שהם יכולים להיות ממוקדים במיוחד אל המיטוכונדריה באמצעות פפטידים אנדוגני N-terminal, למשל אות מיקוד N-terminal של VIII למקטע אדם COX. מערכת זו כבר מועסקת על מנת ליצור בדיקת aequorin במיקוד המיטוכונדריה אשר הוכיחה מאוד שימושי לחקירת סידן המיטוכונדריה איתות 9. החסרון העיקרי של בדיקות מקודדות גנטי אלה הוא שהם צריכים להיות מוחדרים לתאים על ידי ביטוי חולף (וזה לא ריאלי עבור סוגי תאים מסוימים יכולים לייצר תוצאות משתנות) או באמצעות יצירת מנגנוני ביטוי יציבים (אשר זמן רב).
כדי לעקוף את הבעיות שתוארו לעיל, פיתחנו פרוטוקול חדש למדידת המיטוכונדריה Ca 2 + ו ΔΨ מ זמנית. פרוטוקול זה מבוסס על שיטה שתוארה לעיל המוסיפה סידן אקסוגניים לתאי permeabilizeds = "Xref"> 10. יש הפרוטוקול שלנו יש שלושה יתרונות עיקריים על פני שיטות אחרות: ראשית, אנו משתמשים Fluo-4, בבוקר TMRM לפקח Ca המיטוכונדריה 2 + ו מ ΔΨ, שני צבעים שיש תכונות ספקטרליות ברורות מאוד; ושנית, התאים permeabilized כך שהאות Fluo-4 רק מזהה המיטוכונדריה Ca 2+ ולא Ca 2+ מקומי אברונים אחרים או cytosol התא; ושלישי, השימוש Fluo-4 לזהות Ca המיטוכונדריה 2+ מאפשר מכתים תא מהיר ופשוט, שלילת בעיות transfection או טרנספורמציה תא קיימות אם באמצעות בדיקות מקודדות גנטי.
1. הכנת תאים
2. חוצצים הדמיה TMRM ו Fluo-4
מכתים 3. תאים עם TMRM ו Fluo-4, בבוקר
דימות של תא 4.
ניתוח תמונה 5.
6. חישוב הריכוז חינם Ca 2 + היון הסופי [Ca 2 +]
השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לבחון את ההשפעות של מוטציה MT-ND5 על היכולת של המיטוכונדריה בתא 143B למאגר עליות סידן 12. בדוגמה המוצגת כאן, תאים 143B שליטה הועמסו עם TMRM ו Fluo-4, AM לפני permeabilization עם digitonin. אחרי 5 דקות של הדמיה, שמונה תוספות רציפות של די?...
סידן משחק תפקיד קריטי בתהליכים סלולריים רבים, כוללים התכווצות שרירים, איתות עצבה תא התפשטות 13. עליות שריכוז יוני הסידן התא הקשורים לעתים קרובות עם הביקוש לאנרגיה, עם סידן מסוגל לעורר זרחון חמצוני המיטוכונדריה ישירות לגדל דור ה- ATP 3. לכן זה חי...
The authors declare that they have no competing financial interests.
אנו מודים ד"ר Kirstin Elgass וד"ר שרה קריד מ מונש Micro Imaging לקבלת סיוע טכני, ואת האמון Wellcome ואת המועצה למחקר רפואי בבריטניה לתמיכה כספית. MMcK נתמכת בתכנית אחוות העתיד המועצה למחקר האוסטרלי (FT120100459), קרן ויליאם באקלנד, קרן מחלות מיטוכונדריאלי אוסטרלי (AMDF), מכון הדסון למחקר רפואי אוניברסיטת מונאש. עבודה זו נתמכה על ידי תכנית תמיכת תשתית מבצעית הממשלה ויקטוריאני.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved