מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

Summary

המיטוכונדריה יכול לנצל את הפוטנציאל אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי שלהם (Δ _Ψm) כדי לעקל סידן (Ca ^{2 +),} המאפשר להם לעצב Ca cytosolic ²⁺ איתות בתוך התא. אנו מתארים שיטה המיטוכונדריה מדידה בו זמנית ספיגת Ca ^{2 +} ו ΔΨ _מ בתאים חיים באמצעות צבעי ניאון ו מיקרוסקופיה confocal.

Abstract

מלבד התפקיד החיוני שלהם ביצירת ATP, המיטוכונדריה גם לשמש סידן מקומי (Ca ^{2 +)} מאגרים להסדיר בחוזקה ריכוז תאיים Ca ^{2 +.} לשם כך, המיטוכונדריה לנצל את הפוטנציאל אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי שלהם (ΔΨ _{מ ')} כדי לעקל Ca ^2+. זרם של Ca ^{2 +} לתוך המיטוכונדריה מגרה שלושה דהידרוגנאז שער הגבלת של מעגל החומצה הציטרית, הגדלת העברת אלקטרונים דרך זרחון חמצוני (OXPHOS) תסביכים. גירוי זה מפעיל כיום ΔΨ _{מ ',} אשר מתפזר באופן זמני כמו יוני סידן החיובי לחצות את הקרום הפנימי של המיטוכונדריה לתוך המטריצה המיטוכונדריה.

אנו מתארים כאן שיטה המיטוכונדריה מדידה בו זמנית ספיגת Ca ^{2 +} ו ΔΨ _מ בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ confocal. על ידי permeabilizing התאים, Ca המיטוכונדריה ²⁺ יכוללהימדד באמצעות Ca ^{2 +} אינדיקטור Fluo-4, בבוקר, עם מדידת ΔΨ _מ באמצעות אסתר tetramethylrhodamine, מתיל צבע פלואורסצנטי ניאון, פרכלורט (TMRM). היתרון של מערכת זו הוא כי יש חפיפה ספקטרלית מעט מאוד בין צבעי ניאון, המאפשר מדידה מדויקת של המיטוכונדריה Ca ^{2 +} ו ΔΨ _מ זמנית. באמצעות תוספת הרציפים של aliquots Ca ^{2 +,} Ca ^{2 +} המיטוכונדריה ספיגה ניתן לנטר, ואת הריכוז שבו Ca ^{2 +} גורם מעבר חדירות קרום המיטוכונדריה ואובדן ΔΨ _אני נחוש.

Introduction

המיטוכונדריה לשחק תפקיד חשוב בוויסות ריכוז תאיים Ca ^{2 +} על ידי מתנהג כמו מאגרים מקומיים Ca ^{2 + 1.} Ca ^{2 +} מזין את המיטוכונדריה דרך uniporter Ca ^2+, תהליך מונע על ידי שיפוע אלקטרוכימיים שקיים על פני הקרום הפנימי של המיטוכונדריה _(מ ΔΨ) ^2. פעם בתוך מטריקס המיטוכונדריה, Ca ^{2 +} יכול להפעיל זרחון חמצוני ידי גירוי שלושה דהידרוגנאז ומגביל הקצב של מחזור חומצת לימון ^3. גירוי זה מפעיל כיום ΔΨ _{מ ',} אשר מתפזר באופן זמני כמו יוני סידן החיובי לחצות את הקרום הפנימי של המיטוכונדריה לתוך המטריצה המיטוכונדריה. אם ריכוז Ca ^{2 +} בתוך המיטוכונדריה הופך להיות מאוד גבוה, מעבר חדירות המיטוכונדריה יכול להיות יזם, וכתוצאה מכך את הפיזור _מ ΔΨ, את cessation של זרחון חמצוני האינדוקציה של מוות של תאי מסלולי איתות ^4.

התפקיד החשוב כי המיטוכונדריה לשחק חציצה המרחבי של סידן הסלולר הופך את הניטור המדויק של סידן המיטוכונדריה קריטי. שיטות שונות הוקמו לפקח סידן המיטוכונדריה, כולל את השימוש של צבעים המבוססים rhodamine. צבע אחד כזה, רוד-2, AM, הוא די יעיל מחיצות למיטוכונדריה כדי למדוד את רמות Ca ²⁺ המיטוכונדריה ^{5, 6.} עם זאת, הטיפול חייב לשמש קצת צבע יצטברו אברונים אחרים, כגון ליפוזומים, או להישאר cytosol התא. אף על פי כן, ניתוחים במורד הזרם יכול להיות מועסק על מנת להבחין אותות אלה מאלה מהמיטוכונדריה ^7.

טכניקה נוספת לפקח סידן המיטוכונדריה מנצלת כתב ניאון בונה ⁸ עד>. היתרון של בדיקות המקודדות גנטי אלה הוא שהם יכולים להיות ממוקדים במיוחד אל המיטוכונדריה באמצעות פפטידים אנדוגני N-terminal, למשל אות מיקוד N-terminal של VIII למקטע אדם COX. מערכת זו כבר מועסקת על מנת ליצור בדיקת aequorin במיקוד המיטוכונדריה אשר הוכיחה מאוד שימושי לחקירת סידן המיטוכונדריה איתות ^9. החסרון העיקרי של בדיקות מקודדות גנטי אלה הוא שהם צריכים להיות מוחדרים לתאים על ידי ביטוי חולף (וזה לא ריאלי עבור סוגי תאים מסוימים יכולים לייצר תוצאות משתנות) או באמצעות יצירת מנגנוני ביטוי יציבים (אשר זמן רב).

כדי לעקוף את הבעיות שתוארו לעיל, פיתחנו פרוטוקול חדש למדידת המיטוכונדריה Ca ^{2 +} ו ΔΨ _מ זמנית. פרוטוקול זה מבוסס על שיטה שתוארה לעיל המוסיפה סידן אקסוגניים לתאי permeabilizeds = "Xref"> 10. יש הפרוטוקול שלנו יש שלושה יתרונות עיקריים על פני שיטות אחרות: ראשית, אנו משתמשים Fluo-4, בבוקר TMRM לפקח Ca המיטוכונדריה ^{2 +} ו _מ ΔΨ, שני צבעים שיש תכונות ספקטרליות ברורות מאוד; ושנית, התאים permeabilized כך שהאות Fluo-4 רק מזהה המיטוכונדריה Ca ²⁺ ולא Ca ²⁺ מקומי אברונים אחרים או cytosol התא; ושלישי, השימוש Fluo-4 לזהות Ca המיטוכונדריה ²⁺ מאפשר מכתים תא מהיר ופשוט, שלילת בעיות transfection או טרנספורמציה תא קיימות אם באמצעות בדיקות מקודדות גנטי.

Protocol

1. הכנת תאים

1. לגדל תאים על תרבות מנות תא 10 ס"מ או 75 ס"מ ² צלוחיות בתקשורת תרבות [10 מ"ל בינוני הנשרים Modified של Dulbecco (DMEM) בתוספת 5% (v / v) בסרום שור עוברית (FBS) ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין (P / S )], בעמ '37 ° C / 5% CO _2.
2. כדי לקצור תאים, להסיר התקשורת על ידי שאיפה, ולאחר מכן לשטוף עם 5 מ"ל סליין 1x פוספט שנאגרו (1x PBS). הסר PBS 1x ידי שאיפה, ולאחר מכן להוסיף 1.5 מ"ל 0.25% (w / v) טריפסין / 0.25% (w / v) חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ו לדגור על 37 ° C / 5% CO ₂ למשך 2 דקות. הקש צלחת או בקבוק בעדינות כדי להסיר תאים, resuspend אז התקשורת והתרבות 5 מ"ל.
3. ספירת תאים על ידי הוספת 12 μl של תאים resuspended על hemocytometer.
4. פלייט תאי מנות או coverslips תאי הדמיה confocal.
   הערה: אלה יהיו בתחתית פלסטיק או זכוכית מתאימה אשר תוכננה לשימוש עם מיקרוסקופים הפוכים.
5. פלייט תאים כך הב ~ 80% confluency מושגת ביום הדמיה. לדוגמה, כ 2 x 10 ⁴ תאים אוסטאוסרקומה 143B יכול להיות מצופה לתוך אחד טוב של יום אחד שקופיות קאמרית 8 היטב לפני הדמיה.
6. תאים דגירה לילה בשעה 37 ° C / 5% CO ₂ כדי לאפשר לתאים לצרף ולשחזר.

2. חוצצים הדמיה TMRM ו Fluo-4

1. הכן פתרון שיא (RS) המכיל 156 mM NaCl, KCl 3 מ"מ, 2 מ"מ MgSO _4, 1.25 מ"מ KH _{2 4} PO, 10 מ"מ D- גלוקוז, 2 מ"מ CaCl ₂ ו -10 מ"מ HEPES pH 7.35. RS חנות aliquots ב -20 ºC.
2. הכן תאיים בינוני (IM) המכיל 6 מ"מ NaCl, 130 מ"מ KCl, 7.8 מ"מ MgCl _2, 1 מ"מ KH _{2 4} PO, 0.4 מ"מ CaCl _2, 2 מ"מ EGTA, 10 מ"מ HEDTA, 2 malate מ"מ, 2 מ"מ גלוטמט, 2 מ"מ ADP ו 20 מ"מ HEPES pH 7.1. 200 פתרונות מ"מ המניות של malate, גלוטמט ADP ניתן להכין בנפרד, aliquoted, ומאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס. אלה stocks ניתן להוסיף אל IM רק לפני השימוש.
3. Ca ^{2 +} חינם תמיסת המלח שנאגרה של האנק (HBSS) ניתן להשיג מוכן מראש מספקי מסחרי. התוספת bis אתילן גליקול (אתר β-aminoethyl) -N, N, N ', חומצה N'-tetraacetic (EGTA) לריכוז סופי של 500 מיקרומטר.
4. הכן פתרון מניות של 10 מ"מ tetramethylrhodamine, מתיל אסטר, פרכלורט (TMRM) מתנול 100%. ממלאי זה, להפוך מלאה עבודה של 2 מיקרומטר H המזוקק ₂ O.
5. הכן פתרון מניות של 10 מ"מ Verapamil ב 100% אתנול.
6. הכן 1 מ"ג / מ"ל ​​(w / v) פתרון המניות של אסתר acetoxymethyl Fluo-4 (Fluo-4, בבוקר) ב sulfoxide דימתיל (DMSO).
   הערה: Fluo-4, בבוקר הוא אינדיקטור סידן שמספק גדל קרינה על מחייב Ca ^{2 +.} Fluo-4 הוא אנלוגי של fluo-3, עם שני מתמירים כלור שהחליפו fluorines. התוצאה היא עירור קרינה גדל ב 488 ננומטר ורמות אותות קרינה גבוהות יותר. ההאסטר AM תוצאות במולקולת Fluo-4 טעונים שיכולים לחדור קרום התא. פעם בתוך התא, האסטר AM הוא בקע ידי esterases הספציפי, וכתוצאה מכך צורה טעונה של Fluo-4 כי הוא לכוד בתוך התא.
7. כן פתרון מניות של p-trifluoromethoxyphenylhydrazone ציאניד קרבוניל 1 מ"מ (FCCP) באתנול 100%.
8. הכן פתרון המניות של 25 מ"ג / מ"ל (w / v) digitonin ב H מזוקקים ₂ O.
9. כן פתרון מניות של 100 מיקרומטר thapsigargin ב DMSO.
10. כן פתרון מניות של סידן כלורי 40 מ"מ (CaCl ₂₎ ב H המזוקק ₂ O.

מכתים 3. תאים עם TMRM ו Fluo-4, בבוקר

1. הכן פתרון מכתים RS עם 20 ננומטר TMRM, 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​(w / v) Fluo-4, בבוקר פעילי שטח 0.005% כגון Pluronic F-127 RS.
   הערה: פעילי שטח זהו polyol nonionic המאפשרת solubilization של Fluo-4, בבוקר. הערה: 10 מיקרומטר Verapamil ניתן להוסיף גם inhibit TMRM ליצוא על ידי טרנספורטר multidrug קרום הפלזמה אם זה מתבטא בסוג התא להיות מנותח.
2. הסר מדיה תרבות מן התאים על ידי פיפטה ולשטוף עם 100 μl 1x PBS.
3. הסר PBS 1x ידי פיפטה דגירה תאים בתמיסה מכתים 250 μl RS במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: לאחר Fluo-4, בבוקר נכנס לתא, האסטר AM הוא ביקע ידי esterases הסלולר. דוגרים בטמפרטורת החדר מעכב פעילות אסטראז, המאפשר Fluo-4, בבוקר להיכנס המיטוכונדריה.
4. הסר פתרון מכתים RS ידי פיפטה ולשטוף תאים 100 μl Ca ^{2 +} חינם HBSS להסיר Fluo-4 עודף, בבוקר TMRM.
5. הכן פתרון הדמיה IM עם 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​(w / v) digitonin, 200 ננומטר TMRM ו -1 מיקרומטר thapsigargin ב IM.
   הערה: ריכוז digitonin ייתכן שיהיה צורך מותאם על מנת להבטיח כי permeabilization של הקרום הפנימי של המיטוכונדריה אינו מתרחש. זה יכול להיקבע באופן אמפירי על ידי בחינה של עוצמתשל האות TMRM בריכוזים שונים של digitonin.
6. הסר את HBSS Ca ²⁺ בחינם על ידי פיפטה ולהוסיף 300 μl של פתרון הדמיה IM אל התאים. השאירו תאים לאזן בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. תאים מוכנים כעת הדמיה עם תוספות ₂ CaCl.

דימות של תא 4.

1. מניחים צלחת או coverslip תאיים עם תאים בתמיסה הדמיה IM על מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר הפוכה.
2. השתמש בהגדרה על לייזרים מיקרוסקופ עבור ספקטרום עירור ופליטה של ​​TMRM ו Fluo-4. לדוגמה, השתמש 543 ננומטר הוא Ne-ו 473 קווי לייזר ארגון ננומטר לרגש TMRM ו Fluo-4 בהתאמה. השתמש כוח לייזר נמוך של כ 5% כדי למזער כל נזק התמונה אל התאים.
3. גדר מיקרוסקופ כדי לסרוק תמונות כל 25 שניות. תאי סריקה במשך 10 דקות כדי להקים קריאות בסיס עבור TMRM אותות Fluo-4.
   הערה: אות Fluo-4 יכולה להיות חלשה או בלתי מורגשת בבית concent סידן נחמנות.
4. הוסף 3 μl של 40 מניות פתרון מ"מ CaCl ₂ ישירות אל התאים ב 300 μl של פתרון הדמיה IM (דילול 1: 100) ומערבבים בעדינות עם טפטפת. השהה את סריקת תמונות תוך הוספת לערבב את CaCl ₂ במידת הצורך.
   הערה: ריכוז יון חינם Ca ^{2 +} הסופי [Ca ^{2 +]} בפתרון הדמיה IM יכול להיות מחושב באמצעות תוכנה כגון Maxchelator WEBMAXC המורחבת ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) או chelator ^11. תיאור מפורט של איך לחשב את ריכוז יון חינם הסופי Ca ^{2 +} [Ca ^{2 +]} מתואר בסעיף 6 להלן.
5. המשך סריקת תמונות עבור כ 4 דקות, ולאחר מכן לחזור CaCl ₂ תוספות כל 4 דקות עד TMRM הרצוי או אותות Fluo-4 הם הגיעו, בדרך כלל סביב 8 עד 10 תוספות.
6. בעזרת פיפטה, להוסיף דילול 1: 100 של 1 מ"מ FCCP (ג הסופיoncentration של 10 מיקרומטר) ישירות אל התאים להתפוגג _מ ΔΨ. תאי תמונה עבור 5 דקות נוספות. הניסוי הסתיים.

ניתוח תמונה 5.

1. לאחר הדמיה תושלם, לקבוע את עוצמת האותות Fluo-4 ו TMRM באמצעות תוכנת ניתוח התמונה, למשל ImageJ תוכנה עם תוסף ביו-פורמטים (הורדה 'bioformats_package.jar' מ http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / ולשמור אותו: בתיקייה 'C Program Files ImageJ plugins').
2. פתח את קובץ הדמיה (למשל קובץ .oif) ImageJ. הקישו על כלי הבחירה לבחור אזור של (ROI) ריבית המכיל המיטוכונדריה. השתמש אות TMRM הראשונית כדי לבחור את ההחזר על ההשקעה.
3. להרחיב 'לנתח> כלים> מנהל ROI', לחץ על 'הוסף' כדי לכלול את ההחזר על ההשקעה שנבחרו למדידת עוצמת. ROIs המרובה ניתן לבחור על תמונה אחת למדידה. שלבים קודמים חזרו על פעולה עד כל ROIהים נוסף מנהל ROI.
4. לחץ על 'עוד> מדוד רב', ודא כי 'מדוד כל הפרוסות' נבחרה וכי "שורה אחת לכל פרוסה 'אינה מסומנת, ולאחר מכן לחץ על' אישור 'כדי לקבל טבלה של עוצמת פלורסנט הממוצע של אותות TMRM ו Fluo-4 לכל ROI בכל נקודת זמן.
5. השתמש נתונים מכל ROIs לחשב את העוצמות הממוצעות ואת סטיית התקן של TMRM אותות Fluo-4.

6. חישוב הריכוז חינם Ca ^{2 +} היון הסופי [Ca ^{2 +]}

1. ריכוז יון חינם Ca ^{2 +} [Ca ^{2 +]} בפתרון הדמיה IM ניתן לקבוע באמצעות תוכנה כגון Maxchelator WEBMAXC המורחבת ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) או chelator ^11. לדוגמה, הגדר את המשתנים WEBMAXC EXTENDED כדלקמן: טמפרטורה = 24 ° C, pH = 7.1, כוח יוני = 0.162, EGTA = 0.002 M, HEDTA = 0.01 M, Ca ^{2 +} = 0.0004 M ו- Mg ²⁺ = 0.0078 מ 'התוצאה הוא ריכוז יון סופי חינם Ca ^{2 +} [Ca ^{2 +]} של 62 ננומטר . שים לב תוכניות אלה לא יכולים לקחת בחשבון כל משתנות, כמו טוהר מגיב, דיוק של מדידות ונחישות pH. השיטה המדויקת ביותר לקביעת ריכוז חינם Ca ^{2 +} היא להשתמש אלקטרודה סלקטיבית ²⁺ מכויל Ca.

תוצאות

השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לבחון את ההשפעות של מוטציה MT-ND5 על היכולת של המיטוכונדריה בתא 143B למאגר עליות סידן ^12. בדוגמה המוצגת כאן, תאים 143B שליטה הועמסו עם TMRM ו Fluo-4, AM לפני permeabilization עם digitonin. אחרי 5 דקות של הדמיה, שמונה תוספות רציפות של די?...

Discussion

סידן משחק תפקיד קריטי בתהליכים סלולריים רבים, כוללים התכווצות שרירים, איתות עצבה תא התפשטות ^13. עליות שריכוז יוני הסידן התא הקשורים לעתים קרובות עם הביקוש לאנרגיה, עם סידן מסוגל לעורר זרחון חמצוני המיטוכונדריה ישירות לגדל דור ה- ATP ^3. לכן זה חי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin/0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641