Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המיטוכונדריה יכול לנצל את הפוטנציאל אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי שלהם (Δ Ψm) כדי לעקל סידן (Ca 2 +), המאפשר להם לעצב Ca cytosolic 2+ איתות בתוך התא. אנו מתארים שיטה המיטוכונדריה מדידה בו זמנית ספיגת Ca 2 + ו ΔΨ מ בתאים חיים באמצעות צבעי ניאון ו מיקרוסקופיה confocal.

Abstract

מלבד התפקיד החיוני שלהם ביצירת ATP, המיטוכונדריה גם לשמש סידן מקומי (Ca 2 +) מאגרים להסדיר בחוזקה ריכוז תאיים Ca 2 +. לשם כך, המיטוכונדריה לנצל את הפוטנציאל אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי שלהם (ΔΨ מ ') כדי לעקל Ca 2+. זרם של Ca 2 + לתוך המיטוכונדריה מגרה שלושה דהידרוגנאז שער הגבלת של מעגל החומצה הציטרית, הגדלת העברת אלקטרונים דרך זרחון חמצוני (OXPHOS) תסביכים. גירוי זה מפעיל כיום ΔΨ מ ', אשר מתפזר באופן זמני כמו יוני סידן החיובי לחצות את הקרום הפנימי של המיטוכונדריה לתוך המטריצה המיטוכונדריה.

אנו מתארים כאן שיטה המיטוכונדריה מדידה בו זמנית ספיגת Ca 2 + ו ΔΨ מ בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ confocal. על ידי permeabilizing התאים, Ca המיטוכונדריה 2+ יכוללהימדד באמצעות Ca 2 + אינדיקטור Fluo-4, בבוקר, עם מדידת ΔΨ מ באמצעות אסתר tetramethylrhodamine, מתיל צבע פלואורסצנטי ניאון, פרכלורט (TMRM). היתרון של מערכת זו הוא כי יש חפיפה ספקטרלית מעט מאוד בין צבעי ניאון, המאפשר מדידה מדויקת של המיטוכונדריה Ca 2 + ו ΔΨ מ זמנית. באמצעות תוספת הרציפים של aliquots Ca 2 +, Ca 2 + המיטוכונדריה ספיגה ניתן לנטר, ואת הריכוז שבו Ca 2 + גורם מעבר חדירות קרום המיטוכונדריה ואובדן ΔΨ אני נחוש.

Introduction

המיטוכונדריה לשחק תפקיד חשוב בוויסות ריכוז תאיים Ca 2 + על ידי מתנהג כמו מאגרים מקומיים Ca 2 + 1. Ca 2 + מזין את המיטוכונדריה דרך uniporter Ca 2+, תהליך מונע על ידי שיפוע אלקטרוכימיים שקיים על פני הקרום הפנימי של המיטוכונדריה ΔΨ) 2. פעם בתוך מטריקס המיטוכונדריה, Ca 2 + יכול להפעיל זרחון חמצוני ידי גירוי שלושה דהידרוגנאז ומגביל הקצב של מחזור חומצת לימון 3. גירוי זה מפעיל כיום ΔΨ מ ', אשר מתפזר באופן זמני כמו יוני סידן החיובי לחצות את הקרום הפנימי של המיטוכונדריה לתוך המטריצה המיטוכונדריה. אם ריכוז Ca 2 + בתוך המיטוכונדריה הופך להיות מאוד גבוה, מעבר חדירות המיטוכונדריה יכול להיות יזם, וכתוצאה מכך את הפיזור מ ΔΨ, את cessation של זרחון חמצוני האינדוקציה של מוות של תאי מסלולי איתות 4.

התפקיד החשוב כי המיטוכונדריה לשחק חציצה המרחבי של סידן הסלולר הופך את הניטור המדויק של סידן המיטוכונדריה קריטי. שיטות שונות הוקמו לפקח סידן המיטוכונדריה, כולל את השימוש של צבעים המבוססים rhodamine. צבע אחד כזה, רוד-2, AM, הוא די יעיל מחיצות למיטוכונדריה כדי למדוד את רמות Ca 2+ המיטוכונדריה 5, 6. עם זאת, הטיפול חייב לשמש קצת צבע יצטברו אברונים אחרים, כגון ליפוזומים, או להישאר cytosol התא. אף על פי כן, ניתוחים במורד הזרם יכול להיות מועסק על מנת להבחין אותות אלה מאלה מהמיטוכונדריה 7.

טכניקה נוספת לפקח סידן המיטוכונדריה מנצלת כתב ניאון בונה 8 עד>. היתרון של בדיקות המקודדות גנטי אלה הוא שהם יכולים להיות ממוקדים במיוחד אל המיטוכונדריה באמצעות פפטידים אנדוגני N-terminal, למשל אות מיקוד N-terminal של VIII למקטע אדם COX. מערכת זו כבר מועסקת על מנת ליצור בדיקת aequorin במיקוד המיטוכונדריה אשר הוכיחה מאוד שימושי לחקירת סידן המיטוכונדריה איתות 9. החסרון העיקרי של בדיקות מקודדות גנטי אלה הוא שהם צריכים להיות מוחדרים לתאים על ידי ביטוי חולף (וזה לא ריאלי עבור סוגי תאים מסוימים יכולים לייצר תוצאות משתנות) או באמצעות יצירת מנגנוני ביטוי יציבים (אשר זמן רב).

כדי לעקוף את הבעיות שתוארו לעיל, פיתחנו פרוטוקול חדש למדידת המיטוכונדריה Ca 2 + ו ΔΨ מ זמנית. פרוטוקול זה מבוסס על שיטה שתוארה לעיל המוסיפה סידן אקסוגניים לתאי permeabilizeds = "Xref"> 10. יש הפרוטוקול שלנו יש שלושה יתרונות עיקריים על פני שיטות אחרות: ראשית, אנו משתמשים Fluo-4, בבוקר TMRM לפקח Ca המיטוכונדריה 2 + ו מ ΔΨ, שני צבעים שיש תכונות ספקטרליות ברורות מאוד; ושנית, התאים permeabilized כך שהאות Fluo-4 רק מזהה המיטוכונדריה Ca 2+ ולא Ca 2+ מקומי אברונים אחרים או cytosol התא; ושלישי, השימוש Fluo-4 לזהות Ca המיטוכונדריה 2+ מאפשר מכתים תא מהיר ופשוט, שלילת בעיות transfection או טרנספורמציה תא קיימות אם באמצעות בדיקות מקודדות גנטי.

Protocol

1. הכנת תאים

  1. לגדל תאים על תרבות מנות תא 10 ס"מ או 75 ס"מ 2 צלוחיות בתקשורת תרבות [10 מ"ל בינוני הנשרים Modified של Dulbecco (DMEM) בתוספת 5% (v / v) בסרום שור עוברית (FBS) ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין (P / S )], בעמ '37 ° C / 5% CO 2.
  2. כדי לקצור תאים, להסיר התקשורת על ידי שאיפה, ולאחר מכן לשטוף עם 5 מ"ל סליין 1x פוספט שנאגרו (1x PBS). הסר PBS 1x ידי שאיפה, ולאחר מכן להוסיף 1.5 מ"ל 0.25% (w / v) טריפסין / 0.25% (w / v) חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ו לדגור על 37 ° C / 5% CO 2 למשך 2 דקות. הקש צלחת או בקבוק בעדינות כדי להסיר תאים, resuspend אז התקשורת והתרבות 5 מ"ל.
  3. ספירת תאים על ידי הוספת 12 μl של תאים resuspended על hemocytometer.
  4. פלייט תאי מנות או coverslips תאי הדמיה confocal.
    הערה: אלה יהיו בתחתית פלסטיק או זכוכית מתאימה אשר תוכננה לשימוש עם מיקרוסקופים הפוכים.
  5. פלייט תאים כך הב ~ 80% confluency מושגת ביום הדמיה. לדוגמה, כ 2 x 10 4 תאים אוסטאוסרקומה 143B יכול להיות מצופה לתוך אחד טוב של יום אחד שקופיות קאמרית 8 היטב לפני הדמיה.
  6. תאים דגירה לילה בשעה 37 ° C / 5% CO 2 כדי לאפשר לתאים לצרף ולשחזר.

2. חוצצים הדמיה TMRM ו Fluo-4

  1. הכן פתרון שיא (RS) המכיל 156 mM NaCl, KCl 3 מ"מ, 2 מ"מ MgSO 4, 1.25 מ"מ KH 2 4 PO, 10 מ"מ D- גלוקוז, 2 מ"מ CaCl 2 ו -10 מ"מ HEPES pH 7.35. RS חנות aliquots ב -20 ºC.
  2. הכן תאיים בינוני (IM) המכיל 6 מ"מ NaCl, 130 מ"מ KCl, 7.8 מ"מ MgCl 2, 1 מ"מ KH 2 4 PO, 0.4 מ"מ CaCl 2, 2 מ"מ EGTA, 10 מ"מ HEDTA, 2 malate מ"מ, 2 מ"מ גלוטמט, 2 מ"מ ADP ו 20 מ"מ HEPES pH 7.1. 200 פתרונות מ"מ המניות של malate, גלוטמט ADP ניתן להכין בנפרד, aliquoted, ומאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס. אלה stocks ניתן להוסיף אל IM רק לפני השימוש.
  3. Ca 2 + חינם תמיסת המלח שנאגרה של האנק (HBSS) ניתן להשיג מוכן מראש מספקי מסחרי. התוספת bis אתילן גליקול (אתר β-aminoethyl) -N, N, N ', חומצה N'-tetraacetic (EGTA) לריכוז סופי של 500 מיקרומטר.
  4. הכן פתרון מניות של 10 מ"מ tetramethylrhodamine, מתיל אסטר, פרכלורט (TMRM) מתנול 100%. ממלאי זה, להפוך מלאה עבודה של 2 מיקרומטר H המזוקק 2 O.
  5. הכן פתרון מניות של 10 מ"מ Verapamil ב 100% אתנול.
  6. הכן 1 מ"ג / מ"ל ​​(w / v) פתרון המניות של אסתר acetoxymethyl Fluo-4 (Fluo-4, בבוקר) ב sulfoxide דימתיל (DMSO).
    הערה: Fluo-4, בבוקר הוא אינדיקטור סידן שמספק גדל קרינה על מחייב Ca 2 +. Fluo-4 הוא אנלוגי של fluo-3, עם שני מתמירים כלור שהחליפו fluorines. התוצאה היא עירור קרינה גדל ב 488 ננומטר ורמות אותות קרינה גבוהות יותר. ההאסטר AM תוצאות במולקולת Fluo-4 טעונים שיכולים לחדור קרום התא. פעם בתוך התא, האסטר AM הוא בקע ידי esterases הספציפי, וכתוצאה מכך צורה טעונה של Fluo-4 כי הוא לכוד בתוך התא.
  7. כן פתרון מניות של p-trifluoromethoxyphenylhydrazone ציאניד קרבוניל 1 מ"מ (FCCP) באתנול 100%.
  8. הכן פתרון המניות של 25 מ"ג / מ"ל (w / v) digitonin ב H מזוקקים 2 O.
  9. כן פתרון מניות של 100 מיקרומטר thapsigargin ב DMSO.
  10. כן פתרון מניות של סידן כלורי 40 מ"מ (CaCl 2) ב H המזוקק 2 O.

מכתים 3. תאים עם TMRM ו Fluo-4, בבוקר

  1. הכן פתרון מכתים RS עם 20 ננומטר TMRM, 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​(w / v) Fluo-4, בבוקר פעילי שטח 0.005% כגון Pluronic F-127 RS.
    הערה: פעילי שטח זהו polyol nonionic המאפשרת solubilization של Fluo-4, בבוקר. הערה: 10 מיקרומטר Verapamil ניתן להוסיף גם inhibit TMRM ליצוא על ידי טרנספורטר multidrug קרום הפלזמה אם זה מתבטא בסוג התא להיות מנותח.
  2. הסר מדיה תרבות מן התאים על ידי פיפטה ולשטוף עם 100 μl 1x PBS.
  3. הסר PBS 1x ידי פיפטה דגירה תאים בתמיסה מכתים 250 μl RS במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: לאחר Fluo-4, בבוקר נכנס לתא, האסטר AM הוא ביקע ידי esterases הסלולר. דוגרים בטמפרטורת החדר מעכב פעילות אסטראז, המאפשר Fluo-4, בבוקר להיכנס המיטוכונדריה.
  4. הסר פתרון מכתים RS ידי פיפטה ולשטוף תאים 100 μl Ca 2 + חינם HBSS להסיר Fluo-4 עודף, בבוקר TMRM.
  5. הכן פתרון הדמיה IM עם 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​(w / v) digitonin, 200 ננומטר TMRM ו -1 מיקרומטר thapsigargin ב IM.
    הערה: ריכוז digitonin ייתכן שיהיה צורך מותאם על מנת להבטיח כי permeabilization של הקרום הפנימי של המיטוכונדריה אינו מתרחש. זה יכול להיקבע באופן אמפירי על ידי בחינה של עוצמתשל האות TMRM בריכוזים שונים של digitonin.
  6. הסר את HBSS Ca 2+ בחינם על ידי פיפטה ולהוסיף 300 μl של פתרון הדמיה IM אל התאים. השאירו תאים לאזן בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. תאים מוכנים כעת הדמיה עם תוספות 2 CaCl.

דימות של תא 4.

  1. מניחים צלחת או coverslip תאיים עם תאים בתמיסה הדמיה IM על מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר הפוכה.
  2. השתמש בהגדרה על לייזרים מיקרוסקופ עבור ספקטרום עירור ופליטה של ​​TMRM ו Fluo-4. לדוגמה, השתמש 543 ננומטר הוא Ne-ו 473 קווי לייזר ארגון ננומטר לרגש TMRM ו Fluo-4 בהתאמה. השתמש כוח לייזר נמוך של כ 5% כדי למזער כל נזק התמונה אל התאים.
  3. גדר מיקרוסקופ כדי לסרוק תמונות כל 25 שניות. תאי סריקה במשך 10 דקות כדי להקים קריאות בסיס עבור TMRM אותות Fluo-4.
    הערה: אות Fluo-4 יכולה להיות חלשה או בלתי מורגשת בבית concent סידן נחמנות.
  4. הוסף 3 μl של 40 מניות פתרון מ"מ CaCl 2 ישירות אל התאים ב 300 μl של פתרון הדמיה IM (דילול 1: 100) ומערבבים בעדינות עם טפטפת. השהה את סריקת תמונות תוך הוספת לערבב את CaCl 2 במידת הצורך.
    הערה: ריכוז יון חינם Ca 2 + הסופי [Ca 2 +] בפתרון הדמיה IM יכול להיות מחושב באמצעות תוכנה כגון Maxchelator WEBMAXC המורחבת ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) או chelator 11. תיאור מפורט של איך לחשב את ריכוז יון חינם הסופי Ca 2 + [Ca 2 +] מתואר בסעיף 6 להלן.
  5. המשך סריקת תמונות עבור כ 4 דקות, ולאחר מכן לחזור CaCl 2 תוספות כל 4 דקות עד TMRM הרצוי או אותות Fluo-4 הם הגיעו, בדרך כלל סביב 8 עד 10 תוספות.
  6. בעזרת פיפטה, להוסיף דילול 1: 100 של 1 מ"מ FCCP (ג הסופיoncentration של 10 מיקרומטר) ישירות אל התאים להתפוגג מ ΔΨ. תאי תמונה עבור 5 דקות נוספות. הניסוי הסתיים.

ניתוח תמונה 5.

  1. לאחר הדמיה תושלם, לקבוע את עוצמת האותות Fluo-4 ו TMRM באמצעות תוכנת ניתוח התמונה, למשל ImageJ תוכנה עם תוסף ביו-פורמטים (הורדה 'bioformats_package.jar' מ http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / ולשמור אותו: בתיקייה 'C Program Files ImageJ plugins').
  2. פתח את קובץ הדמיה (למשל קובץ .oif) ImageJ. הקישו על כלי הבחירה לבחור אזור של (ROI) ריבית המכיל המיטוכונדריה. השתמש אות TMRM הראשונית כדי לבחור את ההחזר על ההשקעה.
  3. להרחיב 'לנתח> כלים> מנהל ROI', לחץ על 'הוסף' כדי לכלול את ההחזר על ההשקעה שנבחרו למדידת עוצמת. ROIs המרובה ניתן לבחור על תמונה אחת למדידה. שלבים קודמים חזרו על פעולה עד כל ROIהים נוסף מנהל ROI.
  4. לחץ על 'עוד> מדוד רב', ודא כי 'מדוד כל הפרוסות' נבחרה וכי "שורה אחת לכל פרוסה 'אינה מסומנת, ולאחר מכן לחץ על' אישור 'כדי לקבל טבלה של עוצמת פלורסנט הממוצע של אותות TMRM ו Fluo-4 לכל ROI בכל נקודת זמן.
  5. השתמש נתונים מכל ROIs לחשב את העוצמות הממוצעות ואת סטיית התקן של TMRM אותות Fluo-4.

6. חישוב הריכוז חינם Ca 2 + היון הסופי [Ca 2 +]

  1. ריכוז יון חינם Ca 2 + [Ca 2 +] בפתרון הדמיה IM ניתן לקבוע באמצעות תוכנה כגון Maxchelator WEBMAXC המורחבת ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) או chelator 11. לדוגמה, הגדר את המשתנים WEBMAXC EXTENDED כדלקמן: טמפרטורה = 24 ° C, pH = 7.1, כוח יוני = 0.162, EGTA = 0.002 M, HEDTA = 0.01 M, Ca 2 + = 0.0004 M ו- Mg 2+ = 0.0078 מ 'התוצאה הוא ריכוז יון סופי חינם Ca 2 + [Ca 2 +] של 62 ננומטר . שים לב תוכניות אלה לא יכולים לקחת בחשבון כל משתנות, כמו טוהר מגיב, דיוק של מדידות ונחישות pH. השיטה המדויקת ביותר לקביעת ריכוז חינם Ca 2 + היא להשתמש אלקטרודה סלקטיבית 2+ מכויל Ca.

תוצאות

השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לבחון את ההשפעות של מוטציה MT-ND5 על היכולת של המיטוכונדריה בתא 143B למאגר עליות סידן 12. בדוגמה המוצגת כאן, תאים 143B שליטה הועמסו עם TMRM ו Fluo-4, AM לפני permeabilization עם digitonin. אחרי 5 דקות של הדמיה, שמונה תוספות רציפות של די?...

Discussion

סידן משחק תפקיד קריטי בתהליכים סלולריים רבים, כוללים התכווצות שרירים, איתות עצבה תא התפשטות 13. עליות שריכוז יוני הסידן התא הקשורים לעתים קרובות עם הביקוש לאנרגיה, עם סידן מסוגל לעורר זרחון חמצוני המיטוכונדריה ישירות לגדל דור ה- ATP 3. לכן זה חי...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

אנו מודים ד"ר Kirstin Elgass וד"ר שרה קריד מ מונש Micro Imaging לקבלת סיוע טכני, ואת האמון Wellcome ואת המועצה למחקר רפואי בבריטניה לתמיכה כספית. MMcK נתמכת בתכנית אחוות העתיד המועצה למחקר האוסטרלי (FT120100459), קרן ויליאם באקלנד, קרן מחלות מיטוכונדריאלי אוסטרלי (AMDF), מכון הדסון למחקר רפואי אוניברסיטת מונאש. עבודה זו נתמכה על ידי תכנית תמיכת תשתית מבצעית הממשלה ויקטוריאני.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher10566016
fetal bovine serum (FBS)ThermoFisher16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)ThermoFisher10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)ThermoFisher15140122
0.25% Trypsin / 0.25% EDTAThermoFisher25200056
8-well chambered coverslipibidi80826
NaClSigma-Aldrich793566
KClSigma-AldrichP9541 
MgSO4Sigma-Aldrich746452
KH2PO4Sigma-Aldrich795488
D-glucoseSigma-AldrichG8270 
CaCl2Sigma-Aldrich746495
HEPESSigma-AldrichH3375 
MgCl2Sigma-AldrichM2670 
EGTASigma-AldrichE4378 
HEDTASigma-AldrichH8126 
malateSigma-AldrichM1000
glutamateSigma-AldrichG1626
ADPSigma-AldrichA5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) ThermoFisher14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)ThermoFisherT668
VerapamilSigma-AldrichV4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)ThermoFisherF14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)ThermoFisherD12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)Sigma-AldrichC2920
digitoninSigma-AldrichD141
thapsigarginSigma-AldrichT9033
Pluronic F-127 ThermoFisherP3000MP 
hemacytometerVWR631-0925
10 cm cell culture dishesCorningCOR430167
75 cm2 cell culture flasksCorningCOR430641

References

  1. Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology. 23, 84-94 (2008).
  2. Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
  3. Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).
  4. Duchen, M. R. Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).
  5. Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus. J. Physiol. 522, 375-390 (2000).
  6. Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria. Cell. 82, 415-424 (1995).
  7. Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).
  8. Pozzan, T., Rudolf, R. Measurements of mitochondrial calcium in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).
  9. Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
  10. Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state. Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).
  11. Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions. BioTechniques. 12, 870-879 (1992).
  12. McKenzie, M., Duchen, M. R. Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids. PLoS One. 11, e0154371 (2016).
  13. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
  14. Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein. J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).
  15. Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. . 2. n. d. Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).
  16. Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration. Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

119confocal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved