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Method Article
As mitocôndrias pode utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (Δ Ψm) para sequestrar cálcio (Ca2 +), o que lhes permite moldar citosólica de Ca 2+ de sinalização dentro da célula. Descreve-se um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca 2+ de fixação e ΔΨ m em células vivas utilizando corantes fluorescentes e microscopia confocal.
Para além do seu papel fundamental na geração de ATP, mitocôndrias também actuar como cálcio local (Ca 2+), tampões para regular firmemente concentração intracelular de Ca2 +. Para fazer isso, as mitocôndrias utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (ΔΨ m) para sequestrar Ca 2+. O influxo de Ca2 + para as mitocôndrias estimula três desidrogenases limitantes da velocidade do ciclo do ácido cítrico, aumentando a transferência de electrões através da fosforilação oxidativa (FOX) complexos. Esta estimulação mantém ΔΨ m, que é temporariamente dissipada como os iões de cálcio positivos atravessar a membrana mitocondrial interna na matriz mitocondrial.
Descrevemos aqui um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca 2+ captação e ΔΨ m em células vivas usando microscopia confocal. Por permeabilização das células, o Ca 2+ mitocondrial podeser medida utilizando o indicador fluorescente de Ca 2+ Fluo-4, AM, com medição de ΔΨ m utilizando o corante fluorescente de tetrametilrodamina, éster metílico, perclorato (TMRM). A vantagem deste sistema é que existe muito pouca sobreposição espectral entre os corantes fluorescentes, permitindo uma medição precisa de Ca 2+ e mitocondrial ΔΨ m simultaneamente. Utilizando a adição sequencial de alíquotas de Ca 2+, Ca 2+ mitocondrial captação pode ser monitorizada, e a concentração na qual Ca 2+ induz a transição da permeabilidade da membrana mitocondrial e a perda de ΔΨ m determinada.
As mitocôndrias desempenham um papel importante na regulação da concentração intracelular de Ca2 +, agindo como locais de Ca2 + tampões 1. Ca 2+ entra as mitocôndrias através da uniporter Ca2 +, um processo conduzido por o gradiente electroquímico que existe através da membrana mitocondrial interna (ΔΨ m) 2. Uma vez dentro da matriz mitocondrial, Ca2 + pode activar a fosforilação oxidativa, estimulando três desidrogenases limitantes da velocidade do ciclo de ácido cítrico 3. Esta estimulação mantém ΔΨ m, que é temporariamente dissipada como os iões de cálcio positivos atravessar a membrana mitocondrial interna na matriz mitocondrial. Se a concentração de Ca 2+ no interior da mitocôndria se torna muito alta, a transição de permeabilidade mitocondrial pode ser iniciado, resultando na dissipação de ΔΨ m, o cessatioN da fosforilação oxidativa e a indução de morte celular percursos de sinalização 4.
O importante papel que as mitocôndrias jogar no tamponamento espacial de cálcio celular faz com que o monitoramento preciso do cálcio mitocondrial crítica. Vários métodos têm sido estabelecido para controlar ccio mitocondrial, incluindo a utilização de corantes à base de rodamina. Um tal tintura, Rhod-2, AM, é bastante eficaz no particionamento para a mitocôndria para medir mitocondriais níveis de Ca 2+ 5, 6. No entanto, o cuidado deve ser usado como algum corante irá acumular em outras organelas, tais como lipossomas, ou permanecer no citoplasma celular. No entanto, análises a jusante pode ser utilizado para distinguir estes sinais dos da mitocôndria 7.
Uma outra técnica para monitorar cálcio mitocondrial utiliza repórter fluorescente constrói 8 -se>. O benefício destas sondas geneticamente codificados é que eles podem ser especificamente dirigidas para a mitocôndria utilizando péptidos endógenos N-terminais, por exemplo o sinal de direccionamento do terminal N da subunidade de COX VIII humano. Este sistema tem sido empregado para gerar uma sonda aequorina alvejado-mitocondrial, que revelou-se extremamente útil para a investigação de cálcio mitocondrial sinalização 9. A principal desvantagem destas sondas geneticamente codificados é que eles têm de ser introduzidos nas células por expressão transitória (que não é viável para certos tipos de células e pode produzir resultados variáveis) ou através da criação de sistemas de expressão estáveis (que é demorado).
Para contornar os problemas acima referidos, temos desenvolvido um novo protocolo para medir mitocondrial Ca 2+ e ΔΨ m simultaneamente. Este protocolo baseia-se num método anteriormente descrito que adiciona cálcio exógeno para as células permeabilizadass = "xref"> 10. Nosso protocolo tem três vantagens principais em relação a outros métodos: em primeiro lugar, usamos Fluo-4, AM e TMRM para monitorar Ca 2+ e mitocondrial ΔΨ m, dois corantes que têm propriedades espectrais muito distintas; Em segundo lugar, as células são permeabilizadas de modo a que o sinal de Fluo-4 apenas está detectando mitocondrial de Ca2 + e de Ca2 + não localizada para outros organelos ou o citosol da célula; e em terceiro lugar, a utilização de Fluo-4 para detectar Ca 2+ mitocondrial permite a coloração de células rápido e simples, eliminando qualquer problema de transfecção de células ou de transformação que existem se utilizando sondas geneticamente codificados.
1. Preparação de células
2. Tampões para TMRM e Fluo-4 Imagem
3. A coloração de células com TMRM e Fluo-4, AM
Imagem 4. celular
Análise 5. Imagem
6. Cálculo do final gratuito Ca2 + Ion Concentração [Ca 2+]
Nós temos usado este protocolo para examinar os efeitos de uma mutação MT-ND5 sobre a capacidade das mitocôndrias de células 143B para o buffer aumenta em cálcio 12. No exemplo mostrado aqui, células 143B de controlo foram carregadas com Fluo-TMRM e 4, antes de SOU permeabilização com digitonina. Após 5 min de imagiologia, oito adições sequenciais de uma diluição 1: 100 de 40 mM de CaCl2 exógenos foram feitos, com o Ca 2+
O cálcio desempenha um papel fundamental em muitos processos celulares, incluindo a contracção do músculo, sinalização neuronal e a proliferação celular 13. Aumentos nas concentrações de cálcio celular são frequentemente associados com a demanda de energia, com o cálcio capaz de estimular diretamente a fosforilação oxidativa mitocondrial para aumentar a geração de ATP 3. Portanto, é essencial que nós temos a capacidade de controlar eficazmente o acúmulo...
The authors declare that they have no competing financial interests.
Agradecemos Dr Kirstin Elgass e Dr Sarah Creed de Monash Micro Imaging para assistência técnica, eo Wellcome Trust and Medical Research Council do Reino Unido para apoio financeiro. MMcK é suportado do futuro regime Australian Research Council Fellowship (FT120100459), o Buckland Fundação William, O mitocondrial Disease Foundation australiano (AMDF), O Instituto Hudson de Pesquisa Médica e da Universidade de Monash. Este trabalho foi apoiado pelo regime de apoio infra-estrutura operacional Governo de Victoria.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
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