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Neste Artigo

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Resumo

As mitocôndrias pode utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (Δ Ψm) para sequestrar cálcio (Ca2 +), o que lhes permite moldar citosólica de Ca 2+ de sinalização dentro da célula. Descreve-se um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca 2+ de fixação e ΔΨ m em células vivas utilizando corantes fluorescentes e microscopia confocal.

Resumo

Para além do seu papel fundamental na geração de ATP, mitocôndrias também actuar como cálcio local (Ca 2+), tampões para regular firmemente concentração intracelular de Ca2 +. Para fazer isso, as mitocôndrias utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (ΔΨ m) para sequestrar Ca 2+. O influxo de Ca2 + para as mitocôndrias estimula três desidrogenases limitantes da velocidade do ciclo do ácido cítrico, aumentando a transferência de electrões através da fosforilação oxidativa (FOX) complexos. Esta estimulação mantém ΔΨ m, que é temporariamente dissipada como os iões de cálcio positivos atravessar a membrana mitocondrial interna na matriz mitocondrial.

Descrevemos aqui um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca 2+ captação e ΔΨ m em células vivas usando microscopia confocal. Por permeabilização das células, o Ca 2+ mitocondrial podeser medida utilizando o indicador fluorescente de Ca 2+ Fluo-4, AM, com medição de ΔΨ m utilizando o corante fluorescente de tetrametilrodamina, éster metílico, perclorato (TMRM). A vantagem deste sistema é que existe muito pouca sobreposição espectral entre os corantes fluorescentes, permitindo uma medição precisa de Ca 2+ e mitocondrial ΔΨ m simultaneamente. Utilizando a adição sequencial de alíquotas de Ca 2+, Ca 2+ mitocondrial captação pode ser monitorizada, e a concentração na qual Ca 2+ induz a transição da permeabilidade da membrana mitocondrial e a perda de ΔΨ m determinada.

Introdução

As mitocôndrias desempenham um papel importante na regulação da concentração intracelular de Ca2 +, agindo como locais de Ca2 + tampões 1. Ca 2+ entra as mitocôndrias através da uniporter Ca2 +, um processo conduzido por o gradiente electroquímico que existe através da membrana mitocondrial interna (ΔΨ m) 2. Uma vez dentro da matriz mitocondrial, Ca2 + pode activar a fosforilação oxidativa, estimulando três desidrogenases limitantes da velocidade do ciclo de ácido cítrico 3. Esta estimulação mantém ΔΨ m, que é temporariamente dissipada como os iões de cálcio positivos atravessar a membrana mitocondrial interna na matriz mitocondrial. Se a concentração de Ca 2+ no interior da mitocôndria se torna muito alta, a transição de permeabilidade mitocondrial pode ser iniciado, resultando na dissipação de ΔΨ m, o cessatioN da fosforilação oxidativa e a indução de morte celular percursos de sinalização 4.

O importante papel que as mitocôndrias jogar no tamponamento espacial de cálcio celular faz com que o monitoramento preciso do cálcio mitocondrial crítica. Vários métodos têm sido estabelecido para controlar ccio mitocondrial, incluindo a utilização de corantes à base de rodamina. Um tal tintura, Rhod-2, AM, é bastante eficaz no particionamento para a mitocôndria para medir mitocondriais níveis de Ca 2+ 5, 6. No entanto, o cuidado deve ser usado como algum corante irá acumular em outras organelas, tais como lipossomas, ou permanecer no citoplasma celular. No entanto, análises a jusante pode ser utilizado para distinguir estes sinais dos da mitocôndria 7.

Uma outra técnica para monitorar cálcio mitocondrial utiliza repórter fluorescente constrói 8 -se>. O benefício destas sondas geneticamente codificados é que eles podem ser especificamente dirigidas para a mitocôndria utilizando péptidos endógenos N-terminais, por exemplo o sinal de direccionamento do terminal N da subunidade de COX VIII humano. Este sistema tem sido empregado para gerar uma sonda aequorina alvejado-mitocondrial, que revelou-se extremamente útil para a investigação de cálcio mitocondrial sinalização 9. A principal desvantagem destas sondas geneticamente codificados é que eles têm de ser introduzidos nas células por expressão transitória (que não é viável para certos tipos de células e pode produzir resultados variáveis) ou através da criação de sistemas de expressão estáveis ​​(que é demorado).

Para contornar os problemas acima referidos, temos desenvolvido um novo protocolo para medir mitocondrial Ca 2+ e ΔΨ m simultaneamente. Este protocolo baseia-se num método anteriormente descrito que adiciona cálcio exógeno para as células permeabilizadass = "xref"> 10. Nosso protocolo tem três vantagens principais em relação a outros métodos: em primeiro lugar, usamos Fluo-4, AM e TMRM para monitorar Ca 2+ e mitocondrial ΔΨ m, dois corantes que têm propriedades espectrais muito distintas; Em segundo lugar, as células são permeabilizadas de modo a que o sinal de Fluo-4 apenas está detectando mitocondrial de Ca2 + e de Ca2 + não localizada para outros organelos ou o citosol da célula; e em terceiro lugar, a utilização de Fluo-4 para detectar Ca 2+ mitocondrial permite a coloração de células rápido e simples, eliminando qualquer problema de transfecção de células ou de transformação que existem se utilizando sondas geneticamente codificados.

Protocolo

1. Preparação de células

  1. Cultivar células em placas de cultura celular de 10 cm ou 75 cm 2 frascos em meio de cultura [10 ml de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 5% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS) e 1x penicilina / estreptomicina (P / S )] a 37 ° C / 5% de CO 2.
  2. Para colher as células, meios remover por aspiração, em seguida, lava-se com 5 ml de 1x tampão de fosfatos salino (PBS 1x). Remover PBS 1x por aspiração, em seguida, adicionar 1,5 ml de 0,25% (w / v) de tripsina / 0,25% (w / v) de ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) e incubar a 37 ° C / 5% de CO 2 durante 2 min. Toque prato ou frasco suavemente para remover as células, em seguida, ressuspender em 5 ml de meio de cultura.
  3. Contar as células por adição de 12 ul de células ressuspensas em um hemocitómetro.
  4. células da placa em pratos ou lamelas de câmaras de imagem confocal.
    NOTA: Estes terão um fundo de plástico ou de vidro adequado que tenha sido desenvolvido para utilização com microscópios invertidos.
  5. células da placa de modo them ~ 80% de confluência é alcançada no dia da imagiologia. Por exemplo, cerca de 2 x 10 células de osteossarcoma 4 143B pode ser plaqueadas em um poço de uma corrediça de 8 poços um dia antes da câmara de imagiologia.
  6. Incubar as células durante a noite a 37 ° C / 5% de CO2 para permitir que as células fixar e recuperar.

2. Tampões para TMRM e Fluo-4 Imagem

  1. Prepare ficha Solução (RS) contendo NaCl 156 mM, KCl a 3 mM, MgSO 4 2 mM, 1,25 mM de KH 2 PO 4, 10 mM de D-glucose, CaCl2 e 10 mM de HEPES 2 mM pH 7,35. Armazene RS em alíquotas a -20 ºC.
  2. Prepare intracelular médio (IM) contendo NaCl 6 mM, KCl 130 mM, MgCl 7,8 mM, 2, mM de KH 2 PO 4, mM CaCl 0,4 2, EGTA 2 mM, HEDTA 10 mM, malato 2 mM, glutamato 1 mM 2, 2 mM ADP e 20 mM de HEPES pH 7,1. 200 mM de soluções de reserva de malato, o glutamato e o ADP pode ser preparado separadamente, aliquotados, e armazenados a -20 ° C. estes stocks podem ser adicionados ao IM imediatamente antes da utilização.
  3. Ca 2+ solução salina tamponada de Hank livre de (HBSS) pode ser obtida pré-preparados a partir de fornecedores comerciais. Adicionar ácido etilenoglicol-bis (éter β-aminoetil) -N, N, N ', N' -tetra-acético (EGTA) para uma concentração final de 500 uM.
  4. Prepara-se uma solução estoque de 10 mM de tetrametilrodamina, éster metílico, perclorato (TMRM) em metanol a 100%. Deste estoque, fazer um estoque de trabalho de 2 M em H2O destilada
  5. Prepara-se uma solução estoque de 10 mM de Verapamil em 100% de etanol.
  6. Prepare 1 mg / ml (p / v) solução stock de Fluo-4 éster de acetoximetilo (Fluo-4, AM) em sulfóxido de dimetilo (DMSO).
    NOTA: Fluo-4, AM é um indicador de cálcio que exibe aumento da fluorescência mediante Ca 2+ vinculativo. Fluo-4 é um análogo de fluo-3, com os dois substituintes de cloro substituídos por átomos de flúor. Isto resulta num aumento da excitação de fluorescência a 488 nm e os níveis de sinal de fluorescência mais elevados. ogrupo éster AM resulta numa Fluo-4 molécula não carregada que pode permear as membranas celulares. Uma vez dentro da célula, o éster de AM é clivada por esterases inespecíficas, resultando numa forma carregada de Fluo-4, que está preso no interior da célula.
  7. Prepara-se uma solução de reserva de 1 mM de p-carbonil cianeto Trifluormetoxifenilidrazona (FCCP) em etanol a 100%.
  8. Prepara-se uma solução estoque de 25 mg / ml (w / v) de digitonina em H2O destilada
  9. Prepara-se uma solução stock de 100 uM em DMSO tapsigargina.
  10. Prepara-se uma solução estoque de 40 mM de cloreto de cálcio (CaCl2) em H2O destilada

3. A coloração de células com TMRM e Fluo-4, AM

  1. Preparar a solução de coloração RS com 20 nM de TMRM, 5 ug / ml (w / v) de Fluo-4, AM e 0,005% de tensioactivo, tal como Pluronic F-127 em RS.
    NOTA: Este agente tensioactivo não iónico é um poliol que facilita a solubilização de Fluo-4, AM. Nota: 10 uM verapamil também pode ser adicionado à inhibit TMRM exportação pelo transportador multidroga membrana plasmática se for expresso no tipo celular a ser analisado.
  2. Remover o meio de cultura de células com uma pipeta e lava-se com 100 ul de PBS 1x.
  3. Remover PBS 1x com uma pipeta e incubar as células na solução de coloração RS 250 uL durante 45 min à temperatura ambiente.
    Observação: Uma vez que o Fluo-4, AM entra na célula, o éster de AM é clivada por esterases celulares. A incubação à temperatura ambiente inibe a actividade de esterase, permitindo Fluo-4, AM para introduzir as mitocôndrias.
  4. Remova a solução RS coloração com uma pipeta e lavar as células em 100 ul de Ca2 + livre HBSS para remover o excesso de Fluo-4, AM e TMRM.
  5. Prepare solução de imagem primário com 25 ug / ml digitonina (v / w), 200 nM TMRM e 1 PM thapsigargin no IM.
    NOTA: A concentração de digitonina pode necessitar de ser ajustada para assegurar que a permeabilização da membrana interna mitocondrial não ocorre. Isto pode ser determinado empiricamente através da avaliação da intensidadedo sinal de TMRM em diferentes concentrações de digitonina.
  6. Remover o Ca2 + livre HBSS por pipeta e adicionar 300 ul de solução de imagem IM para as células. Deixar células para equilibrar à temperatura ambiente durante 10 min. As células são agora pronto para geração de imagens com CaCl 2 adições.

Imagem 4. celular

  1. Coloque prato ou lamela câmaras com células em solução de imagem IM em um microscópio confocal de varredura a laser invertido.
  2. Use a configuração sobre os lasers de microscópio para a excitação e emissão espectros de TMRM e Fluo-4. Por exemplo, use 543 nm He-Ne e 473 nm linhas de laser de argônio para excitar TMRM e Fluo-4, respectivamente. Utilizar uma fonte de laser de baixa de cerca de 5% a minimizar qualquer foto-dano para as células.
  3. Definir microscópio para digitalizar imagens a cada 25 seg. células de digitalização durante 10 min para estabelecer as leituras da linha de base para o TMRM e Fluo-4 sinais.
    NOTA: O sinal de Fluo-4 pode ser fraco ou indetectável no descanso concent cálciorações.
  4. Adicione 3 mL de solução de estoque 40 mM de CaCl2 directamente para as células em 300 ul de solução de imagem IM (uma diluição 1: 100) e misturar cuidadosamente com uma pipeta. Pausar a digitalização de imagem, enquanto a adição e mistura do CaCl 2, se necessário.
    NOTA: O Ca2 + livre concentração de íons final [Ca 2+] na solução de imagem IM pode ser calculada usando softwares como o Maxchelator WEBMAXC prolongado ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) ou quelante 11. Uma descrição detalhada de como calcular o Ca 2+ concentração final íon livre [Ca 2+] é descrito no ponto 6 abaixo.
  5. Continuar a digitalização de imagens para aproximadamente 4 min, em seguida, repita CaCl 2 adições a cada 4 min até o TMRM desejado ou Fluo-4 sinais são alcançados, geralmente em torno de 8 a 10 adições.
  6. Usando uma pipeta, adicionar uma diluição 1: 100 de FCCP 1 mM (final Concentration de 10 uM) directamente para as células para dissipar ΔΨ m. células de imagem por mais 5 min. O experimento foi concluída.

Análise 5. Imagem

  1. Depois de imagem estiver concluído, determinar a intensidade dos sinais de Fluo-4 e TMRM usando o software de análise de imagem, por exemplo software ImageJ com o plugin Bio-Formatos (download 'bioformats_package.jar' do http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / e guardá-lo no "C: Program Files ImageJ plugins 'pasta).
  2. Abra o arquivo de imagem (por exemplo, um arquivo de .oif) em ImageJ. Clique na ferramenta de seleção e selecione uma região de interesse (ROI) que contém mitocôndrias. Use o sinal TMRM inicial para selecionar o ROI.
  3. Abrir "Analisar> Ferramentas> ROI Manager ', clique em' Adicionar 'para incluir o ROI selecionados para medição da intensidade. Várias ROIs pode ser seleccionado de uma única imagem para medição. etapas anteriores Repita até que todos ROIs foram adicionados ao Gestor de ROI.
  4. Clique em "Mais> Medida multi ', certifique-se de que" Medir todas as fatias' é selecionado e que "uma linha por Slice 'não está selecionada, clique em' OK 'para obter uma tabela de intensidade de fluorescência média das TMRM e fluo-4 sinais para cada ROI em cada ponto de tempo.
  5. Use dados de todos os ROIs para calcular as intensidades média e desvio padrão para o TMRM e Fluo-4 sinais.

6. Cálculo do final gratuito Ca2 + Ion Concentração [Ca 2+]

  1. A concentração de Ca2 + íon livre [Ca 2+] na solução de imagem IM pode ser determinada usando softwares como o Maxchelator WEBMAXC prolongado ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) ou quelante 11. Por exemplo, definir as variáveis ​​em WEBMAXC prolongada da seguinte maneira: Temperatura = 24 ° C, pH = 7.1, força iónica = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca2 + H = 0,0004 e = 0,0078 Mg 2+ M. Isto resulta num livre de Ca 2+ concentração final de iões de [Ca 2+] de 62 nM . Note-se que estes programas não podem ter em conta todas as variáveis, tais como a pureza de reagente, a precisão das medições e determinação do pH. O método mais preciso para a determinação da concentração de Ca2 + livre é a utilização de um eléctrodo de Ca 2+ calibrado selectiva.

Resultados

Nós temos usado este protocolo para examinar os efeitos de uma mutação MT-ND5 sobre a capacidade das mitocôndrias de células 143B para o buffer aumenta em cálcio 12. No exemplo mostrado aqui, células 143B de controlo foram carregadas com Fluo-TMRM e 4, antes de SOU permeabilização com digitonina. Após 5 min de imagiologia, oito adições sequenciais de uma diluição 1: 100 de 40 mM de CaCl2 exógenos foram feitos, com o Ca 2+

Discussão

O cálcio desempenha um papel fundamental em muitos processos celulares, incluindo a contracção do músculo, sinalização neuronal e a proliferação celular 13. Aumentos nas concentrações de cálcio celular são frequentemente associados com a demanda de energia, com o cálcio capaz de estimular diretamente a fosforilação oxidativa mitocondrial para aumentar a geração de ATP 3. Portanto, é essencial que nós temos a capacidade de controlar eficazmente o acúmulo...

Divulgações

The authors declare that they have no competing financial interests.

Agradecimentos

Agradecemos Dr Kirstin Elgass e Dr Sarah Creed de Monash Micro Imaging para assistência técnica, eo Wellcome Trust and Medical Research Council do Reino Unido para apoio financeiro. MMcK é suportado do futuro regime Australian Research Council Fellowship (FT120100459), o Buckland Fundação William, O mitocondrial Disease Foundation australiano (AMDF), O Instituto Hudson de Pesquisa Médica e da Universidade de Monash. Este trabalho foi apoiado pelo regime de apoio infra-estrutura operacional Governo de Victoria.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher10566016
fetal bovine serum (FBS)ThermoFisher16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)ThermoFisher10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)ThermoFisher15140122
0.25% Trypsin / 0.25% EDTAThermoFisher25200056
8-well chambered coverslipibidi80826
NaClSigma-Aldrich793566
KClSigma-AldrichP9541 
MgSO4Sigma-Aldrich746452
KH2PO4Sigma-Aldrich795488
D-glucoseSigma-AldrichG8270 
CaCl2Sigma-Aldrich746495
HEPESSigma-AldrichH3375 
MgCl2Sigma-AldrichM2670 
EGTASigma-AldrichE4378 
HEDTASigma-AldrichH8126 
malateSigma-AldrichM1000
glutamateSigma-AldrichG1626
ADPSigma-AldrichA5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) ThermoFisher14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)ThermoFisherT668
VerapamilSigma-AldrichV4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)ThermoFisherF14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)ThermoFisherD12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)Sigma-AldrichC2920
digitoninSigma-AldrichD141
thapsigarginSigma-AldrichT9033
Pluronic F-127 ThermoFisherP3000MP 
hemacytometerVWR631-0925
10 cm cell culture dishesCorningCOR430167
75 cm2 cell culture flasksCorningCOR430641

Referências

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  2. Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
  3. Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).
  4. Duchen, M. R. Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).
  5. Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus. J. Physiol. 522, 375-390 (2000).
  6. Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria. Cell. 82, 415-424 (1995).
  7. Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).
  8. Pozzan, T., Rudolf, R. Measurements of mitochondrial calcium in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).
  9. Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
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  11. Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions. BioTechniques. 12, 870-879 (1992).
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  15. Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. . 2. n. d. Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).
  16. Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration. Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).

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