Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Resumo

As mitocôndrias pode utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (Δ _Ψm) para sequestrar cálcio ^{(Ca2 +),} o que lhes permite moldar citosólica de Ca ²⁺ de sinalização dentro da célula. Descreve-se um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca ²⁺ de fixação e ΔΨ _m em células vivas utilizando corantes fluorescentes e microscopia confocal.

Resumo

Para além do seu papel fundamental na geração de ATP, mitocôndrias também actuar como cálcio local (Ca ^2+), tampões para regular firmemente concentração intracelular ^{de Ca2 +.} Para fazer isso, as mitocôndrias utilizar o potencial electroquímico através da membrana seu interior (ΔΨ _m) para sequestrar Ca ^2+. O influxo de ^{Ca2 +} para as mitocôndrias estimula três desidrogenases limitantes da velocidade do ciclo do ácido cítrico, aumentando a transferência de electrões através da fosforilação oxidativa (FOX) complexos. Esta estimulação mantém ΔΨ _m, que é temporariamente dissipada como os iões de cálcio positivos atravessar a membrana mitocondrial interna na matriz mitocondrial.

Descrevemos aqui um método para medir simultaneamente mitocôndrias Ca ²⁺ captação e ΔΨ _m em células vivas usando microscopia confocal. Por permeabilização das células, o Ca ²⁺ mitocondrial podeser medida utilizando o indicador fluorescente de Ca ²⁺ Fluo-4, AM, com medição de ΔΨ _m utilizando o corante fluorescente de tetrametilrodamina, éster metílico, perclorato (TMRM). A vantagem deste sistema é que existe muito pouca sobreposição espectral entre os corantes fluorescentes, permitindo uma medição precisa de Ca ²⁺ e mitocondrial ΔΨ _m simultaneamente. Utilizando a adição sequencial de alíquotas de Ca ^2+, Ca ²⁺ mitocondrial captação pode ser monitorizada, e a concentração na qual Ca ²⁺ induz a transição da permeabilidade da membrana mitocondrial e a perda de ΔΨ _m determinada.

Introdução

As mitocôndrias desempenham um papel importante na regulação da concentração intracelular ^{de Ca2 +,} agindo como locais ^{de Ca2 +} tampões ^1. Ca ²⁺ entra as mitocôndrias através da uniporter ^{Ca2 +,} um processo conduzido por o gradiente electroquímico que existe através da membrana mitocondrial interna (ΔΨ _m) ^2. Uma vez dentro da matriz mitocondrial, ^{Ca2 +} pode activar a fosforilação oxidativa, estimulando três desidrogenases limitantes da velocidade do ciclo de ácido cítrico ^3. Esta estimulação mantém ΔΨ _m, que é temporariamente dissipada como os iões de cálcio positivos atravessar a membrana mitocondrial interna na matriz mitocondrial. Se a concentração de Ca ²⁺ no interior da mitocôndria se torna muito alta, a transição de permeabilidade mitocondrial pode ser iniciado, resultando na dissipação de ΔΨ _m, o cessatioN da fosforilação oxidativa e a indução de morte celular percursos de sinalização ^4.

O importante papel que as mitocôndrias jogar no tamponamento espacial de cálcio celular faz com que o monitoramento preciso do cálcio mitocondrial crítica. Vários métodos têm sido estabelecido para controlar ccio mitocondrial, incluindo a utilização de corantes à base de rodamina. Um tal tintura, Rhod-2, AM, é bastante eficaz no particionamento para a mitocôndria para medir mitocondriais níveis de Ca ^{2+ 5, 6.} No entanto, o cuidado deve ser usado como algum corante irá acumular em outras organelas, tais como lipossomas, ou permanecer no citoplasma celular. No entanto, análises a jusante pode ser utilizado para distinguir estes sinais dos da mitocôndria ^7.

Uma outra técnica para monitorar cálcio mitocondrial utiliza repórter fluorescente constrói ⁸ -se>. O benefício destas sondas geneticamente codificados é que eles podem ser especificamente dirigidas para a mitocôndria utilizando péptidos endógenos N-terminais, por exemplo o sinal de direccionamento do terminal N da subunidade de COX VIII humano. Este sistema tem sido empregado para gerar uma sonda aequorina alvejado-mitocondrial, que revelou-se extremamente útil para a investigação de cálcio mitocondrial sinalização ^9. A principal desvantagem destas sondas geneticamente codificados é que eles têm de ser introduzidos nas células por expressão transitória (que não é viável para certos tipos de células e pode produzir resultados variáveis) ou através da criação de sistemas de expressão estáveis ​​(que é demorado).

Para contornar os problemas acima referidos, temos desenvolvido um novo protocolo para medir mitocondrial Ca ²⁺ e ΔΨ _m simultaneamente. Este protocolo baseia-se num método anteriormente descrito que adiciona cálcio exógeno para as células permeabilizadass = "xref"> 10. Nosso protocolo tem três vantagens principais em relação a outros métodos: em primeiro lugar, usamos Fluo-4, AM e TMRM para monitorar Ca ²⁺ e mitocondrial ΔΨ _m, dois corantes que têm propriedades espectrais muito distintas; Em segundo lugar, as células são permeabilizadas de modo a que o sinal de Fluo-4 apenas está detectando mitocondrial ^{de Ca2 +} e ^{de Ca2 +} não localizada para outros organelos ou o citosol da célula; e em terceiro lugar, a utilização de Fluo-4 para detectar Ca ²⁺ mitocondrial permite a coloração de células rápido e simples, eliminando qualquer problema de transfecção de células ou de transformação que existem se utilizando sondas geneticamente codificados.

Protocolo

1. Preparação de células

1. Cultivar células em placas de cultura celular de 10 cm ou 75 cm ² frascos em meio de cultura [10 ml de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 5% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS) e 1x penicilina / estreptomicina (P / S )] a 37 ° C / 5% de CO _2.
2. Para colher as células, meios remover por aspiração, em seguida, lava-se com 5 ml de 1x tampão de fosfatos salino (PBS 1x). Remover PBS 1x por aspiração, em seguida, adicionar 1,5 ml de 0,25% (w / v) de tripsina / 0,25% (w / v) de ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) e incubar a 37 ° C / 5% de CO ₂ durante 2 min. Toque prato ou frasco suavemente para remover as células, em seguida, ressuspender em 5 ml de meio de cultura.
3. Contar as células por adição de 12 ul de células ressuspensas em um hemocitómetro.
4. células da placa em pratos ou lamelas de câmaras de imagem confocal.
   NOTA: Estes terão um fundo de plástico ou de vidro adequado que tenha sido desenvolvido para utilização com microscópios invertidos.
5. células da placa de modo them ~ 80% de confluência é alcançada no dia da imagiologia. Por exemplo, cerca de 2 x 10 células de osteossarcoma ⁴ 143B pode ser plaqueadas em um poço de uma corrediça de 8 poços um dia antes da câmara de imagiologia.
6. Incubar as células durante a noite a 37 ° C / 5% de _CO2 para permitir que as células fixar e recuperar.

2. Tampões para TMRM e Fluo-4 Imagem

1. Prepare ficha Solução (RS) contendo NaCl 156 mM, KCl a 3 mM, MgSO ₄ 2 mM, 1,25 mM _de KH ₂ PO _4, 10 mM de D-glucose, _CaCl2 e 10 mM de HEPES 2 mM pH 7,35. Armazene RS em alíquotas a -20 ºC.
2. Prepare intracelular médio (IM) contendo NaCl 6 mM, KCl 130 mM, MgCl 7,8 mM, _2, mM de KH ₂ PO _4, mM CaCl 0,4 _2, EGTA 2 mM, HEDTA 10 mM, malato 2 mM, glutamato 1 mM 2, 2 mM ADP e 20 mM de HEPES pH 7,1. 200 mM de soluções de reserva de malato, o glutamato e o ADP pode ser preparado separadamente, aliquotados, e armazenados a -20 ° C. estes stocks podem ser adicionados ao IM imediatamente antes da utilização.
3. Ca ²⁺ solução salina tamponada de Hank livre de (HBSS) pode ser obtida pré-preparados a partir de fornecedores comerciais. Adicionar ácido etilenoglicol-bis (éter β-aminoetil) -N, N, N ', N' -tetra-acético (EGTA) para uma concentração final de 500 uM.
4. Prepara-se uma solução estoque de 10 mM de tetrametilrodamina, éster metílico, perclorato (TMRM) em metanol a 100%. Deste estoque, fazer um estoque de trabalho de 2 M em _H2O destilada
5. Prepara-se uma solução estoque de 10 mM de Verapamil em 100% de etanol.
6. Prepare 1 mg / ml (p / v) solução stock de Fluo-4 éster de acetoximetilo (Fluo-4, AM) em sulfóxido de dimetilo (DMSO).
   NOTA: Fluo-4, AM é um indicador de cálcio que exibe aumento da fluorescência mediante Ca ²⁺ vinculativo. Fluo-4 é um análogo de fluo-3, com os dois substituintes de cloro substituídos por átomos de flúor. Isto resulta num aumento da excitação de fluorescência a 488 nm e os níveis de sinal de fluorescência mais elevados. ogrupo éster AM resulta numa Fluo-4 molécula não carregada que pode permear as membranas celulares. Uma vez dentro da célula, o éster de AM é clivada por esterases inespecíficas, resultando numa forma carregada de Fluo-4, que está preso no interior da célula.
7. Prepara-se uma solução de reserva de 1 mM de p-carbonil cianeto Trifluormetoxifenilidrazona (FCCP) em etanol a 100%.
8. Prepara-se uma solução estoque de 25 mg / ml (w / v) de digitonina em _H2O destilada
9. Prepara-se uma solução stock de 100 uM em DMSO tapsigargina.
10. Prepara-se uma solução estoque de 40 mM de cloreto de cálcio _(CaCl2) em _H2O destilada

3. A coloração de células com TMRM e Fluo-4, AM

1. Preparar a solução de coloração RS com 20 nM de TMRM, 5 ug / ml (w / v) de Fluo-4, AM e 0,005% de tensioactivo, tal como Pluronic F-127 em RS.
   NOTA: Este agente tensioactivo não iónico é um poliol que facilita a solubilização de Fluo-4, AM. Nota: 10 uM verapamil também pode ser adicionado à inhibit TMRM exportação pelo transportador multidroga membrana plasmática se for expresso no tipo celular a ser analisado.
2. Remover o meio de cultura de células com uma pipeta e lava-se com 100 ul de PBS 1x.
3. Remover PBS 1x com uma pipeta e incubar as células na solução de coloração RS 250 uL durante 45 min à temperatura ambiente.
   Observação: Uma vez que o Fluo-4, AM entra na célula, o éster de AM é clivada por esterases celulares. A incubação à temperatura ambiente inibe a actividade de esterase, permitindo Fluo-4, AM para introduzir as mitocôndrias.
4. Remova a solução RS coloração com uma pipeta e lavar as células em 100 ul ^{de Ca2 +} livre HBSS para remover o excesso de Fluo-4, AM e TMRM.
5. Prepare solução de imagem primário com 25 ug / ml digitonina (v / w), 200 nM TMRM e 1 PM thapsigargin no IM.
   NOTA: A concentração de digitonina pode necessitar de ser ajustada para assegurar que a permeabilização da membrana interna mitocondrial não ocorre. Isto pode ser determinado empiricamente através da avaliação da intensidadedo sinal de TMRM em diferentes concentrações de digitonina.
6. Remover o ^{Ca2 +} livre HBSS por pipeta e adicionar 300 ul de solução de imagem IM para as células. Deixar células para equilibrar à temperatura ambiente durante 10 min. As células são agora pronto para geração de imagens com CaCl ₂ adições.

Imagem 4. celular

1. Coloque prato ou lamela câmaras com células em solução de imagem IM em um microscópio confocal de varredura a laser invertido.
2. Use a configuração sobre os lasers de microscópio para a excitação e emissão espectros de TMRM e Fluo-4. Por exemplo, use 543 nm He-Ne e 473 nm linhas de laser de argônio para excitar TMRM e Fluo-4, respectivamente. Utilizar uma fonte de laser de baixa de cerca de 5% a minimizar qualquer foto-dano para as células.
3. Definir microscópio para digitalizar imagens a cada 25 seg. células de digitalização durante 10 min para estabelecer as leituras da linha de base para o TMRM e Fluo-4 sinais.
   NOTA: O sinal de Fluo-4 pode ser fraco ou indetectável no descanso concent cálciorações.
4. Adicione 3 mL de solução de estoque 40 mM de _CaCl2 directamente para as células em 300 ul de solução de imagem IM (uma diluição 1: 100) e misturar cuidadosamente com uma pipeta. Pausar a digitalização de imagem, enquanto a adição e mistura do CaCl _2, se necessário.
   NOTA: O ^{Ca2 +} livre concentração de íons final [Ca ^2+] na solução de imagem IM pode ser calculada usando softwares como o Maxchelator WEBMAXC prolongado ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) ou quelante ^11. Uma descrição detalhada de como calcular o Ca ²⁺ concentração final íon livre [Ca ^2+] é descrito no ponto 6 abaixo.
5. Continuar a digitalização de imagens para aproximadamente 4 min, em seguida, repita CaCl ₂ adições a cada 4 min até o TMRM desejado ou Fluo-4 sinais são alcançados, geralmente em torno de 8 a 10 adições.
6. Usando uma pipeta, adicionar uma diluição 1: 100 de FCCP 1 mM (final Concentration de 10 uM) directamente para as células para dissipar ΔΨ _m. células de imagem por mais 5 min. O experimento foi concluída.

Análise 5. Imagem

1. Depois de imagem estiver concluído, determinar a intensidade dos sinais de Fluo-4 e TMRM usando o software de análise de imagem, por exemplo software ImageJ com o plugin Bio-Formatos (download 'bioformats_package.jar' do http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / e guardá-lo no "C: Program Files ImageJ plugins 'pasta).
2. Abra o arquivo de imagem (por exemplo, um arquivo de .oif) em ImageJ. Clique na ferramenta de seleção e selecione uma região de interesse (ROI) que contém mitocôndrias. Use o sinal TMRM inicial para selecionar o ROI.
3. Abrir "Analisar> Ferramentas> ROI Manager ', clique em' Adicionar 'para incluir o ROI selecionados para medição da intensidade. Várias ROIs pode ser seleccionado de uma única imagem para medição. etapas anteriores Repita até que todos ROIs foram adicionados ao Gestor de ROI.
4. Clique em "Mais> Medida multi ', certifique-se de que" Medir todas as fatias' é selecionado e que "uma linha por Slice 'não está selecionada, clique em' OK 'para obter uma tabela de intensidade de fluorescência média das TMRM e fluo-4 sinais para cada ROI em cada ponto de tempo.
5. Use dados de todos os ROIs para calcular as intensidades média e desvio padrão para o TMRM e Fluo-4 sinais.

6. Cálculo do final gratuito ^{Ca2 +} Ion Concentração [Ca ^2+]

1. A concentração de ^{Ca2 +} íon livre [Ca ^2+] na solução de imagem IM pode ser determinada usando softwares como o Maxchelator WEBMAXC prolongado ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) ou quelante ^11. Por exemplo, definir as variáveis ​​em WEBMAXC prolongada da seguinte maneira: Temperatura = 24 ° C, pH = 7.1, força iónica = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, ^{Ca2 +} H = 0,0004 e = 0,0078 Mg ²⁺ M. Isto resulta num livre de Ca ²⁺ concentração final de iões de [Ca ^2+] de 62 nM . Note-se que estes programas não podem ter em conta todas as variáveis, tais como a pureza de reagente, a precisão das medições e determinação do pH. O método mais preciso para a determinação da concentração de ^{Ca2 +} livre é a utilização de um eléctrodo de Ca ²⁺ calibrado selectiva.

Resultados

Nós temos usado este protocolo para examinar os efeitos de uma mutação MT-ND5 sobre a capacidade das mitocôndrias de células 143B para o buffer aumenta em cálcio ^12. No exemplo mostrado aqui, células 143B de controlo foram carregadas com Fluo-TMRM e 4, antes de SOU permeabilização com digitonina. Após 5 min de imagiologia, oito adições sequenciais de uma diluição 1: 100 de 40 mM de _CaCl2 exógenos foram feitos, com o Ca ²⁺

Discussão

O cálcio desempenha um papel fundamental em muitos processos celulares, incluindo a contracção do músculo, sinalização neuronal e a proliferação celular ^13. Aumentos nas concentrações de cálcio celular são frequentemente associados com a demanda de energia, com o cálcio capaz de estimular diretamente a fosforilação oxidativa mitocondrial para aumentar a geração de ATP ^3. Portanto, é essencial que nós temos a capacidade de controlar eficazmente o acúmulo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin/0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641