형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

요약

미토콘드리아는 그들이 세포질 칼슘을 형성하는 ^{2 +} 세포 내 신호 전달 수 ^{(2 +} 칼슘)을 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (Δ _Ψm)에서 전기 잠재력을 활용할 수 있습니다. 우리는 형광 염료 및 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 ^칼슘 흡수 및 ΔΨ _분하는 방법을 설명합니다.

초록

외에도 ATP를 생성하는 자신의 중요한 역할에서, 미토콘드리아는 ^(칼슘) 단단히 세포 내 ^칼슘 농도를 조절하는 버퍼 지역 칼슘 역할을합니다. 이렇게하려면 미토콘드리아는 ^칼슘을 격리한다 그들의 내막 (ΔΨ _분)에 걸쳐 전기 잠재력을 활용합니다. 미토콘드리아에 칼슘 ^이온의 유입은 산화 적 인산화 (OXPHOS) 착체를 통해 전자 전달을 증가 시트르산 사이클의 세 속도 제한게나 제를 자극한다. 이 자극은 양의 칼슘 이온이 미토콘드리아 매트릭스로 미토콘드리아 내막을 통과 일시적 소산 ΔΨ _분을 유지한다.

우리는 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 ^칼슘 흡수 및 ΔΨ의 _m 여기하는 방법을 설명합니다. 세포를 permeabilizing, 미토콘드리아 칼슘에 의해 ²⁺ 수형광 염료를 사용하여 테트라 메틸 ΔΨ _m의 메틸 에스테르, 퍼클로레이트 (TMRM)의 측정을, 형광 ^칼슘 지표 FLUO-4 AM을 사용하여 측정 될 수있다. 이 시스템의 이점은 형광 염료 사이의 아주 작은 스펙트럼 오버랩 동시에 정확한 미토콘드리아의 Ca ²⁺ 및 측정 ΔΨ의 _m을 수 있다는 것이다. ^칼슘 분취의 순차 첨가를 사용하여 미토콘드리아 ^칼슘 흡수를 모니터 할 수 있으며, ^{칼슘 미토콘드리아} 막 투과성 전이 및 ΔΨ의 손실을 유도하는 농도 결정 _해요.

서문

미토콘드리아는 지역 ^칼슘 버퍼 ^1로 작용하여 세포 내 ^칼슘 농도를 조절하는데 중요한 역할을한다. 칼슘은 ^{2 +,} 칼슘 ^{2 +} uniporter 통해 미토콘드리아 내막 (ΔΨ _분) ^2에서 존재하는 전기 화학적 구배에 의해 구동되는 과정을 미토콘드리아로 들어갑니다. 일단 미토콘드리아 매트릭스 내부, ^칼슘은 구연산 사이클 ^(3)의 세 가지 속도 제한 탈수소 효소를 자극하여 산화 적 인산화를 활성화 할 수 있습니다. 이 자극은 양의 칼슘 이온이 미토콘드리아 매트릭스로 미토콘드리아 내막을 통과 일시적 소산 ΔΨ _분을 유지한다. 미토콘드리아 내의 칼슘 ^이온 농도가 매우 높아지면, 미토콘드리아 투과성 천이 ΔΨ의 _m의 손실의 결과로, 초기화 될 수 있으며, cessatio산화 적 인산화 n 및 ⁴ 경로 ^신호 세포사의 유도.

미토콘드리아는 세포 칼슘의 공간 버퍼링에서 재생 중요한 역할은 미토콘드리아 칼슘의 정확한 모니터링이 중요합니다. 다양한 방법 로다 계 염료의 사용을 포함 미토콘드리아 칼슘을 모니터하기 위해 설립되었다. 그러한 염료, 루비로드-2, ^{AM은 6} 미토콘드리아 ^칼슘 레벨 ^5를 측정하는 미토콘드리아에 파티션에 매우 효과적이다. 몇몇 염료는 리포좀과 같은 다른 소기관에 축적 또는 세포 세포질에 남아 그러나, 치료가 사용되어야한다. 그럼에도 불구하고, 하류 분석 미토콘드리아 ⁷ 것과 이러한 신호들을 구별하기 위해 사용될 수있다.

미토콘드리아 칼슘을 모니터링하는 다른 기술은 형광 리포터 ^(8)를 구성 이용한다 >입니다. 이러한 유 전적으로 인코딩 된 프로브의 이점은 특히, 예를 들어 인간 COX 소단위 VIII의 N- 말단 타겟팅 신호 내인성 N 말단 펩티드를 이용하여 미토콘드리아를 타겟팅 할 수 있다는 것이다. 이 시스템은 ^{9 신호} 미토콘드리아 칼슘 조사 매우 유용 입증되었다 미토콘드리아 타겟팅 쿼린 프로브를 생성하는데 사용되어왔다. 이러한 유 전적으로 인코딩 된 프로브의 주요 단점은 일시적인 발현에 의해 세포 내로 도입 될 필요가 (특정 세포 유형에 대해 가능하지 가변 결과를 얻을 수 있음) 또는 안정한 발현 시스템 (이는 시간이 소비된다) 만들어 있다는 것이다.

위에 설명 된 문제를 회피하기 위해, 우리는 동시에 미토콘드리아 ^칼슘과 ΔΨ _m을 측정하는 새로운 프로토콜을 개발했다. 이 프로토콜은 투과성이 세포에 외인성 칼슘을 추가하는 전술 한 방법에 기초S = "외부 참조"> 10. 우리의 프로토콜은 다른 방법을 통해 세 가지 주요 이점이있다 : 첫째로, 우리는 FLUO-4, AM 및 TMRM는 미토콘드리아 ^칼슘과 ΔΨ _분, 매우 독특한 스펙트럼 특성을 갖는 두 개의 염료를 모니터링하는 데 사용할; 둘째, 세포는 FLUO-4 신호는 미토콘드리아 칼슘 감지하는 ^{2 +와 칼슘이} 다른 세포 소기관이나 세포의 세포질에 지역화되지 않도록 투과성이있다; 셋째, FLUO-4의 사용 ²⁺ 미토콘드리아 칼슘 감지 유 전적으로 인코딩 된 프로브를 사용하는 경우 존재하는 세포 또는 형질 전환 문제를 부정 빠르고 간단한 세포 염색을 허용한다.

프로토콜

세포의 1. 준비

1. 10cm 세포 배양 접시에 세포 또는 75cm 성장 5 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS) 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S가 보충 배지 [10 ㎖ 둘 베코 변형 이글스 중간 (DMEM)에서 ^두 플라스크 ) 37 ° C / 5 % CO _2에서.
2. 세포를 수확하려면 다음 5 ml의 1 배 인산염 완충 생리 식염수 (1X PBS)로 세척, 흡인에 의해 용지를 제거합니다. 다음 (w / v)의 트립신 / 0.25 %를 1.5 ml의 0.25 %를 추가, 흡인 1X PBS를 제거 (/ w를 v)의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 2 분 동안 37 ° C / 5 % CO _2에서 배양한다. 접시를 누르거나 다음 5 ml의 배양 배지에 재현 탁, 세포를 제거하기 위해 조심스럽게 플라스크.
3. 혈구에 재현 탁하고 세포를 12 μl를 첨가하여 세포를 카운트.
4. 요리 또는 공 촛점 이미징 챔버 커버 슬립에 플레이트 세포.
   참고 :이 거꾸로 현미경과 함께 사용하도록 설계되었습니다 적합한 플라스틱이나 유리 바닥을해야합니다.
5. 플레이트 세포 일 때문에~ 80 %의 컨 플루 이미징 당일 달성된다. 예를 들어, 약 2 × ¹⁰⁴ (143B)의 골육종 세포 촬상 전에 8 웰 챔버 슬라이드 1 일 잘 하나에 도금 될 수있다.
6. 세포 부착 및 복구 할 수 있도록 37 ° C / 5 % CO _2에서 하룻밤 동안 세포를 인큐베이션.

TMRM 및 FLUO-4 영상 2. 버퍼

1. 156 mM의 NaCl을 3 밀리미터의 KCl, 2 mM의 _{황산을 포함하는} 기록 솔루션 (RS)를 준비 1.25 밀리미터 KH ₂ PO _4, 10mM의 D-글루코오스, 2 mM의 _CaCl2를 10 mM의 HEPES pH를 7.35. -20 ºC에서 분취에 보관 RS.
2. 준비 세포 내 중간 (IM) 6 mM의 NaCl을 130 밀리미터의 KCl, 7.8 밀리미터의 MgCl _2, 1 mM의 KH ₂ PO _4, 0.4 mM의 _CaCl2를, 2 mM의 EGTA, 10mM의 HEDTA, 2 mM의 말산, 2 mM의 글루타메이트, 2 밀리미터 포함 ADP와 20 mM의 HEPES pH가 7.1. 말산, 글루탐산 ADP 200 mM의 스톡 용액은 별도로 제조 분취하고 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 세인트ocks은 사용 전에 IM에 첨가 될 수있다.
3. ²⁺ 자유 행크 완충 염 용액 (HBSS)을 얻을 수있다 Ca는 상업적 공급자로부터 미리 제조. 에틸렌 글리콜 비스 (β 아미노 에틸 에테르)를 첨가 -N, N, N ', 500 μM의 최종 농도 N'- 테트라 아세트산 (EGTA).
4. 100 % 메탄올의 10 밀리미터 테트라 메틸, 메틸 에스테르, 퍼클로레이트 (TMRM)의 스톡 용액을 제조 하였다. 이 주식에서 증류수 H ₂ O 2 μM의 작업 재고를 확인
5. 100 % 에탄올 중 10 mM의 베라파밀의 스톡 용액을 제조 하였다.
6. 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 FLUO -4- 아세 톡시 메틸 에스터 (FLUO-4 AM)의 스톡 용액 (V / w) 1 ㎎ / ㎖를 준비한다.
   참고 : FLUO-4, AM은 ^{칼슘 결합에} 형광을 증가 전시회 칼슘 지표입니다. FLUO-4는 불소로 치환 두 염소 치환체, FLUO-3의 아날로그이다. 이것은 488 nm에서의 형광 증가 여기 높은 형광 신호 레벨을 초래한다. 그만큼AM 에스테르 기 세포막을 투과 할 수있는 대전 된 FLUO-4 분자를 초래한다. 세포 내부되면 AM 에스터 셀 내에 갇혀 FLUO-4 충전 된 형태의 결과 특이성 에스 테라 제에 의해 분해된다.
7. 100 % 에탄올에 1 mM의 카본 시안화 P-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)의 스톡 용액을 제조 하였다.
8. 증류수 H ₂ O의 주식 25 ㎎ / ㎖의 용액 (w / v)의 디기 토닌 준비
9. DMSO 100 μM의 쌥시 가르 긴의 재고 솔루션을 준비합니다.
10. 증류 H ₂ O. 40mm의 염화칼슘 _{(CaCl2를)의} 스톡 용액을 준비

TMRM 및 FLUO-4 AM 셀들 3. 염색법

1. 20 nM의 TMRM와 RS 염색 솔루션을 준비, 5 μg의 / ㎖ (W / V) FLUO-4, AM 및 플루로 닉 F-127 RS에서와 같은 0.005 % 계면 활성제.
   참고 :이 계면 활성제 FLUO-4, AM의 가용화를 용이하게하는 비이 온성 폴리올이다. 참고 : 10 μM 베라파밀 inhibi 또한 첨가 될 수있다이 세포 유형에서 발현된다면 세포막 다제 수송하여 t TMRM 보 분석된다.
2. 피펫으로 세포 배양 배지를 제거하고 PBS 1 배 100 μL 세척.
3. 피펫 1X PBS를 제거하고, 실온에서 45 분 동안 250 ㎕의 RS의 염색 액에 세포를 배양한다.
   주 : FLUO-4, AM은 셀에 진입하면, AM 에스테르 셀룰러 에스 테라 제에 의해 분해된다. 실온에서 배양하면 FLUO-4, AM은 미토콘드리아를 입력 할 수 있도록, 에스 테라 제 활성을 억제한다.
4. 피펫에 의해 RS의 염색 액을 제거하고 초과 FLUO-4, AM 및 TMRM을 제거하기 위해 칼슘 2 ⁺ μL (100)에 무료 HBSS를 세포를 씻는다.
5. 25 μg의 / ml의 IM 이미징 솔루션을 준비 디기 토닌 (/ V w), 200 nM의 TMRM 및 IM 1 μM의 쌥시 가르 긴.
   참고 디기 토닌의 농도가 발생하지 미토콘드리아 내막의 permeabilization을 위해 조정될 필요가있다. 이것은 강도를 평가함으로써 실험적으로 결정될 수있다디기 토닌 상이한 농도에서 TMRM 신호.
6. 피펫으로 칼슘 2 ⁺ 무료 HBSS를 제거하고 세포 IM 이미징 솔루션의 300 μl를 추가합니다. 10 분 동안 실온에서 평형 셀을 떠난다. 셀은 _{염화칼슘이} 추가와 이미징을위한 준비가되어 있습니다.

4. 세포 이미징

1. 반전 레이저 스캐닝 공 초점 현미경에 접시 또는 IM 이미징 솔루션 세포와 챔버 커버 슬립을 놓습니다.
2. TMRM 및 FLUO-4의 여기 및 방출 스펙트럼에 대한 현미경 레이저에 설정을 사용합니다. 예를 들어, 각각 TMRM 및 FLUO-4를 가진시키기 위해 543 nm의 HE-(NE)와 473 nm의 아르곤 레이저 라인을 사용한다. 셀 어떤 광 손실을 최소화하기 위해 약 5 %의 낮은 레이저 파워를 사용한다.
3. 이미지마다 25 초를 스캔 현미경을 설정합니다. 10 분 동안 스캔 세포는 TMRM와 FLUO-4 신호를 기준 판독 값을 설정합니다.
   주 : FLUO-4 신호가 휴식 칼슘 승낙에 약하거나 탐지 할 수있다식료품.
4. IM 이미징 솔루션의 300 μl를 직접 세포에 40 mM의 _CaCl2를 원액의 3 μl를 추가 (1 : 100 희석)와 피펫으로 가볍게 섞는다. 추가하고, 필요한 경우 _{CaCl2를 혼합하면서} 화상 검색을 일시 정지.
   주 : 최종 자유 ^칼슘 이온 농도 ^[칼슘 상기 IM 촬상 용액 등 Maxchelator WEBMAXC 같은 소프트웨어를 사용하여 계산 될 수 EXTENDED ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) 또는 킬레이트 ^11. 최종 자유 ^칼슘 이온 농도를 계산하는 방법에 대한 자세한 설명은 [캘리포니아 ^2+] 아래의 (6)에 기재되어있다.
5. 약 4 분의 이미지 스캔을 계속하고 일반적으로 약 8 10 추가에 도달 원하는 TMRM 또는 FLUO-4 신호까지 염화칼슘 ₂ 추가 매 4 분을 반복합니다.
6. 1 mM의 FCCP 100 희석 (최종 C : 피펫을 사용하여 1을 추가직접 세포에 oncentration 10 μM)는 ΔΨ _분을 발산합니다. 또 5 분 동안 이미지 세포. 실험은 이제 완료됩니다.

5. 이미지 분석

1. 이미지가 완료되면 http://downloads.openmicroscopy.org/bio에서 바이오 형식 플러그인 (다운로드 'bioformats_package.jar'로 예시 ImageJ에 소프트웨어, 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 FLUO-4와 TMRM 신호의 강도를 판정 -formats /과에 저장 'C : 프로그램 파일 ImageJ에 플러그인'폴더).
2. ImageJ에있는 (예를 들어 .oif 파일) 이미징 파일을 엽니 다. 미토콘드리아가 포함 된 선택 도구를 클릭하고 관심 (ROI)의 영역을 선택합니다. 투자 수익 (ROI)을 선택합니다 초기 TMRM 신호를 사용합니다.
3. 열기 '분석> 도구> 투자 수익 (ROI) 관리자'강도 측정을위한 선택 투자 수익 (ROI)을 포함하는 '추가'를 클릭합니다. 복수의 ROI는 측정을위한 하나의 이미지를 선택할 수 있습니다. 모든 ROI 때까지 반복하여 이전 단계s는 투자 수익 (ROI) 관리자에 추가되었습니다.
4. '더보기> 멀티 측정'을 클릭 선택 '모든 조각을 측정합니다'있는지 확인하고 '조각 당 하나의 행이'선택 해제되어 있는지, 다음 TMRM 및 FLUO-4 신호의 평균 형광 강도의 표를 얻기 위해 '확인'을 클릭 각 시점에서 각 ROI합니다.
5. TMRM 및 FLUO-4 신호 강도의 평균과 표준 편차를 계산하기 위해 모든 ROI들로부터 데이터를 사용한다.

6. 최종 무료 ^칼슘 이온 농도 [칼슘 ^{2 +]} 계산

1. 유리 ^칼슘 이온 농도 IM 촬상 용액 ^[칼슘]는 Maxchelator WEBMAXC EXTENDED (같은 소프트웨어를 사용하여 결정될 수있다 http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) 또는 킬레이트 ^11. = 온도를 24 ° C, pH가 7 예를 들어, 다음과 같이 WEBMAXC의 변수 확장 설정합니다.1, 이온 강도 = 0.162, EGTA = 0.002 M, HEDTA = 0.01 M, 칼슘 2 ⁺ = 0.0004 M과의 Mg ²⁺ = 0.0078 M.이 최종 무료 ^칼슘 이온 농도 [칼슘 2 ^+] 62 nM의의 결과 . 이 프로그램은 시약의 순도 측정과 pH를 측정의 정확도로, 계정에 모든 변수를 취할 수 없습니다. 유리 칼슘 ^이온 농도를 결정하는 가장 정확한 방법은 교정 된 ^칼슘 선택성 전극을 사용하는 것이다.

결과

우리는 칼슘 ^(12)의 증가를 버퍼링 143B 세포 미토콘드리아의 능력에 MT-ND5 돌연변이의 영향을 조사하기 위해 프로토콜을 사용 하였다. 여기에 도시 된 예에서, 제어부 (143B) 세포 TMRM FLUO-4와 함께로드하고, 디기 토닌와 permeabilization 전에 AM. 촬상 5 분 후, 1 여덟 순차 추가 : _CaCl2를 40 mM의 외인성 100 희석 최종 자유 ^칼슘 이온 농도로 만?...

토론

칼슘은 근육 수축, 신경 신호 전달 및 세포 증식 ^(13)를 포함한 많은 세포 공정에서 중요한 역할을한다. 세포의 칼슘 농도의 증가는 종종 직접 ATP 생성 ^3을 높이기 위해 미토콘드리아의 산화 적 인산화를 자극 할 수 칼슘, 에너지 수요와 연결되어 있습니다. 우리가 효과적으로 미토콘드리아 칼슘 축적을 모니터링하고,이 기능은 유전 적 요인 및 약리학 적 제제 모...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641