Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Özet

Mitokondri onları sitozolik Ca şekillendirmek için ²⁺ hücre içinde sinyal sağlayan ⁽²⁺ Ca) kalsiyum tecrit kendi iç zarı (Δ _Ψm) arasında elektrokimyasal potansiyeli kullanabilir. Floresan boyalar ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler eş zamanlı olarak ölçüm mitokondri Ca ^{2 +} alımı ve ΔΨ _m için bir yöntem tarif eder.

Özet

Apart ATP üreten önemli rolleri dışında, mitokondri de (Ca ²⁺⁾ sıkıca hücre içi Ca ^{2 +} konsantrasyonu düzenleyen tamponlar, yerel kalsiyum gibi hareket ederler. Bunu yapmak için, mitokondri Ca ²⁺ ayırmak için kendi iç zarı (ΔΨ _m) arasında elektrokimyasal potansiyelini kullanmak. Mitokondriye Ca ^{2 +} akını oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) kompleksleri ile elektron transferini artırmak, sitrik asit döngüsünün üç oran sınırlayıcı dehidrojenazları uyarır. Bu uyarım pozitif kalsiyum iyonları mitokondrial matriks içine mitokondri iç zarı çapraz olarak geçici dağılır ΔΨ _m, korur.

Biz konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler aynı anda ölçüm mitokondri Ca ^{2 +} alımı ve ΔΨ _m burada bir yöntem açıklanmaktadır. Hücreleri permeabilizing, mitokondriyal Ca ²⁺ canfloresan boya tetrametilrodamin kullanılarak ΔΨ _m, metil ester, perklorat (TMRM) ölçümü ile, floresan Ca2 ⁺ göstergesi Fluo-4 AM kullanılarak ölçülebilmektedir. Bu sistemin avantajı, floresan boyalar arasında çok az spektral örtüşme aynı zamanda, doğru mitokondriyal Ca ^{+ 2} ve ölçüm ΔΨ _m sağlayan olmasıdır. Ca2 ⁺ alikotları dizisel ilavesini kullanarak, mitokondriyal Ca ^{2 +} alımı izlenebilir ve Ca2 ⁺ mitokondriyal membran geçirgenliği geçiş ve ΔΨ kaybını indükleyen edildiği konsantrasyon saptanmıştır _m.

Giriş

Mitokondri yerel Ca ^{2 +} tampon ¹ olarak hareket ederek hücre içi Ca2 ⁺ konsantrasyonu düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Ca ^{2 +,} Ca ^{2 +} uniporter yoluyla mitokondri iç zarının (ΔΨ _m) ² arasında var olan elektrokimyasal gradyan tarafından yönlendirilen bir süreç mitokondri girer. Bir kez mitokondrial matriks içinde, Ca ^{2 +} sitrik asit döngüsü ³ üç hız sınırlayıcı dehidrojenazları uyararak oksidatif fosforilasyonu aktif hale getirebilirsiniz. Bu uyarım pozitif kalsiyum iyonları mitokondrial matriks içine mitokondri iç zarı çapraz olarak geçici dağılır ΔΨ _m, korur. Mitokondri içinde Ca2 ⁺ konsantrasyonu çok yüksek olursa, mitokondriyal geçirgenlik ΔΨ _m dağılımı ile sonuçlanan başlatılabilir, cessatioOksidatif fosforilasyon, n ve yolları ⁴ sinyal hücre ölümünün indüklenmesi.

mitokondri hücresel kalsiyum mekansal tamponlama oynadıkları önemli rol mitokondriyal kalsiyum doğru izlenmesi kritik hale getirir. Çeşitli yöntemler Rodamin bazlı boyaların kullanımı dahil mitokondriyal kalsiyum, izlemek için kurulmuştur. Böyle bir boya, Rhod-2, ^{AM, 6} mitokondriyal Ca ^{2 +} düzeyleri ⁵ ölçmek için mitokondri bölümleme oldukça etkilidir. Bazı boya lipozomlar gibi diğer organellere birikir, ya da hücre sitozol kalır Ancak dikkat etmek gerekir. Bununla birlikte, alt analizler mitokondri ^7'den olanlardan bu sinyalleri ayırt edilmesi için kullanılabilir.

Mitokondriyal kalsiyum izlemek için başka bir teknik floresan muhabiri ⁸ oluşturur kullanır > Yukarı. Bu genetik olarak kodlanmış prob yararı özellikle, örneğin, insan COX alt birim VIII N-terminal hedefleme sinyali endojen N-terminali peptidi kullanılarak mitokondri hedef olabilir. Bu sistem ⁹ sinyalizasyon mitokondriyal kalsiyum araştırmak için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır mitokondriyal hedefli aequorin probu oluşturmak için istihdam edilmiştir. Bu genetik olarak kodlanmış prob ana dezavantajı, geçici ekspresyonu ile hücre içine gereken (belirli hücre tipleri için uygun değildir ve değişken sonuçları üretebilir) veya sabit bir sentezleme sistemleri (ki zaman alıcı) oluşturarak olmasıdır.

Yukarıda özetlenen sorunları aşmak için, biz aynı anda mitokondriyal Ca ²⁺ ve ΔΨ _m ölçmek için yeni bir protokol geliştirmiştir. Bu protokol, permeabilize hücrelerin ekzojen kalsiyum ekler daha önce tarif edilen yönteme dayalıdırs = "xref"> 10. Bizim protokol diğer yöntemlere göre üç ana avantajı vardır: Birincisi, biz Flu-4, AM ve TMRM mitokondriyal Ca ²⁺ ve ΔΨ _m, çok farklı spektral özelliklere sahip iki boyalar izlemek için kullanın; ikincisi, hücreler Flu-4 sinyali sadece mitokondriyal Ca tespit edilir ⁺² ve Ca ⁺² diğer organellere veya hücre sitoplazmada lokalize olmayan şekilde permeabilize; ve üçüncüsü, Flu-4 kullanımı ²⁺ mitokondriyal Ca tespit etmek için genetik olarak kodlanmış problar kullanılarak eğer mevcut herhangi bir hücre transfeksiyon veya transformasyon sorunları inkâr, hızlı ve basit hücre boyama sağlar.

Protokol

Hücrelerin hazırlanması 1.

1. 10 cm hücre kültür kaplarına hücreleri ya da 75 cm büyütün% 5 (h / h) cenin sığır serumu (FBS) ve 1 x penisilin / streptomisin (s / s ile takviye edilmiş kültür ortamı [10 mi Dulbecco Değiştirilmiş Kartal Ortamı (DMEM) 'de ² şişe )] 37 ° C /% 5 _CO2 de.
2. hücreleri hasat etmek için, daha sonra, 5 ml 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (1 x PBS) ile yıkamak, aspirasyon ile ortamı çıkarın. Daha sonra, (ağ / hac) tripsin /% 0.25, 1.5 ml% 0.25 ekleyin aspirasyonla 1x PBS çıkarın (a / h) etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 2 dakika için 37 ° C /% 5 _CO2 inkübe edilir. çanak dokunun veya daha sonra 5 ml kültür ortamında tekrar süspansiyon, hücreleri çıkarmak için hafifçe şişe.
3. Bir hemasitometre üzerine yeniden süspanse hücrelerin 12 ul ekleyerek hücreleri saymak.
4. yemekler veya konfokal görüntüleme için odacıklı lamelleri Levha hücreleri.
   Not: Bu ters çevrilmiş mikroskop ile kullanılmak için dizayn edilmiştir, uygun bir plastik ya da cam alt olacaktır.
5. Plaka hücreleri inci böylece~% 80 konflüansa görüntüleme gününde elde edilir. Örneğin, yaklaşık 2 x 10 ⁴ 143B osteosarkom hücreleri görüntüleme önce 8 oyuklu oda slayt bir gün tek bir oyuk içine kaplama olabilir.
6. Hücreler takmak ve kurtarmak için izin 37 ° C /% 5 CO ₂ gecede hücreleri inkübe.

TMRM ve Flu-4 Görüntüleme için 2. Tamponlar

1. 156 mM NaCI, 3 mM KCI, 2 mM MgSO ₄ içeren Telaffuz Solüsyonu (SC) hazırlanması 1.25 mM KH ₂ PO _4, 10 mM D-glukoz, 2 mM _CaCl2 ve 10 mM HEPES pH 7.35. -20 ° C'de alikotları saklayın RS.
2. Hazırlama Hücre içi Orta (IM), 6 mM NaCI, 130 mM KCI, 7.8 mM _MgCI2, 1 mM KH ₂ PO _4, 0.4 mM _CaCl2, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2mM malat, 2 mM glutamat, 2 mM ihtiva eden ADP ve 20 mM HEPES pH 7.1. malat, glutamat ve ADP 200 mM stok çözeltileri, ayrı olarak hazırlanır bölünmüştür ve -20 ° C'de muhafaza edilebilir. Bunlar stocks kullanımdan hemen önce IM eklenebilir.
3. ^{2 +} serbest Hank tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) elde edilebilir Ca ticari satıcılardan önceden hazırlanmış. etilen glikol-bis (β-aminoetil eter) ekleyin -N, N, N ', 500 uM nihai konsantrasyona kadar N'-tetraasetik asit (EGTA).
4. % 100 metanol içinde 10 mM tetrametilrodamin, metil ester, perklorat (TMRM) içindeki bir stok çözelti hazırlayın. Bu stoktan, distile H ₂ O 2 mcM bir çalışma stok yapmak
5. % 100 etanol içinde 10 mM Verapamil bir stok çözelti hazırlayın.
6. dimetil sülfoksit (DMSO) içinde Fluo-4 asetoksimetil ester (Fluo-4 AM) stok çözeltisi (ağırlık / hacim), 1 mg / ml hazırlayın.
   Not: Fluo-4 AM Ca2 ⁺ bağlanma üzerine artmış floresan arzeden bir kalsiyum göstergesidir. Fluo-4 florin ile ikame iki klorin ikame edici ile, fluo-3, bir analogudur. Bu, 488 nm'de artan flüoresans uyarma ve daha yüksek floresans sinyali seviyeleri ile sonuçlanır.AM ester grubu hücre zarlarının nüfuz edebilir yüksüz Fluo-4 molekülüne sonuçlanır. hücre içinde bir kez, AM ester hücre içinde tutulur Flu-4 yüklü bir biçimde elde edilen, spesifik olmayan esterazlarla ayrılır.
7. % 100 etanol içinde 1 mM karbonil siyanit p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) içindeki bir stok çözelti hazırlayın.
8. Damıtılmış _H2O içinde bir stok 25 mg / ml çözelti (ağ / hac) digitonin hazırlanması
9. DMSO içinde 100 uM thapsigargin bir stok çözelti hazırlayın.
10. Damıtılmış _H2O 40 mM kalsiyum klorür _(CaCl2) bir stok çözelti hazırlayın

TMRM ve Fluo-4 AM 3. Hücrelerin boyanması

1. 20 nM TMRM RS boyama çözeltisi hazırlayın, 5 ug / ml (a / h) Fluo-4 AM ve Pluronic F-127, RS gibi% 0.005 yüzeyaktif madde.
   NOT: Bu yüzey aktif Flu-4, GM çözünürlüğünü kolaylaştırır iyonik olmayan bir polioldür. Not: 10 uM Verapamil, aynı zamanda inhibitörlerinin eklenebilirBu hücre tipinde ifade edilir, eğer plazma zarı çoklu ilaç taşıyıcı T TMRM verme analiz edilir.
2. pipetle hücreler kültür ortamı çıkarın ve PBS 1X 100 ul ile yıkayın.
3. Pipetle 1 x PBS alınır ve oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 250 ul RS boyama çözeltisi içinde hücreler inkübe edin.
   Not: Fluo-4 AM hücre girdiğinde, AM ester, hücresel esterazlarla ayrılır. Oda sıcaklığında inkübe Fluo-4 AM mitokondri girmesine izin esteraz aktivitesini inhibe eder.
4. Pipet ile RS boyama çözüm çıkarın ve aşırı Flu-4, AM ve TMRM kaldırmak için Ca ^{2 +} ul 100 ücretsiz HBSS hücreleri yıkayın.
5. 25 ug / ml İM görüntüleme çözeltisi hazırlayın digitonin (w / v), 200 nM TMRM ve IM 1 uM thapsigargin.
   Not: digitonin konsantrasyonu oluşmaz mitokondriyal iç membran bu geçirgenliği sağlamak üzere ayarlanması gerekebilir. Bu yoğunluk değerlendirerek ampirik olarak saptanabilirdigitonin farklı konsantrasyonlarda TMRM sinyali.
6. Pipet ile Ca ^{2 +} ücretsiz HBSS çıkarın ve hücrelere IM görüntüleme çözümü 300 ul ekleyin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında dengelenmeye hücreleri bırakın. Hücreler artık _CaCl2 eklemelerle görüntüleme için hazırız.

4. Hücre Görüntüleme

1. ters bir lazer tarama konfokal mikroskop üzerine çanak veya IM görüntüleme çözümü hücrelerin ile odacıklı lamel yerleştirin.
2. TMRM ve Flu-4 eksitasyon ve emisyon spektrumları mikroskop lazer ayarı kullanın. Örneğin, sırasıyla TMRM ve Fluo-4 heyecanlandırmak için 543 nm He-Ne ve 473 nm argon lazer çizgileri kullanıyoruz. hücrelere herhangi bir fotoğraf zararı en aza indirmek için yaklaşık% 5 düşük lazer gücü kullanın.
3. görüntüleri her 25 sn tarama mikroskobu ayarlayın. 10 dakika tarama hücreleri TMRM ve Flu-4 sinyaller için temel okumalar kurmak.
   NOT: Flu-4 sinyal istirahat kalsiyum konsantrasyonlarda ise zayıf ya da saptanamayan olabilirerzak.
4. Hızlı görüntüleme çözeltisi 300 ul doğrudan hücrelere 40 mM _CaCl2 stok solüsyonu 3 ul ekle (1: 100 dilüsyon) ve bir pipet ile yavaşça karıştırın. Ekleme ve gerekirse CaCl ₂ karıştırma sırasında görüntü tarama Pause.
   NOT: Son ücretsiz Ca ^{2 +} iyonu konsantrasyonu [Ca ^{2 +]} IM görüntüleme çözümü gibi Maxchelator WEBMAXC gibi yazılımları kullanarak hesaplanabilir UZATILDI ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) ya da Şelatör ^11. Son serbest Ca2 ⁺ iyonu konsantrasyonu hesaplanması için ayrıntılı bir açıklaması [Ca2 ^+], aşağıda Bölüm 6'da tarif edilmektedir.
5. Yaklaşık 4 dakika boyunca görüntü taramaya devam, sonra genellikle yaklaşık 8 ila 10 eklemeler, ulaşıldığında istenilen TMRM veya Flu-4 sinyalleri kadar _CaCl2 eklemeler her 4 dk tekrarlayın.
6. 1 mM FCCP 100 seyreltme (nihai C: Bir pipet kullanarak, 1 ekleyinşirketinden hücrelere bağlı yoğunlaşma 10 uM) ΔΨ _m kaybeder. 5 dakika daha Görüntü hücreleri. Deney şimdi bitti.

5. Görüntü Analizi

1. Görüntüleme işlemi tamamlandıktan sonra, http://downloads.openmicroscopy.org/bio Bio-Biçimleri eklentisi (indir 'bioformats_package.jar' ile örnek ImageJ yazılım, görüntü analiz yazılımı kullanılarak Fluo-4 ve TMRM sinyallerin yoğunluğunu belirlemek -formats / ve kaydedin 'C: Program Files ImageJ eklentileri' klasörü).
2. ImageJ (örneğin bir .oif dosyası) görüntüleme dosyasını açın. mitokondri içeren seçim aracını tıklayın ve faiz (ROI) bir bölge seçin. ROI seçmek için ilk TMRM sinyalini kullanın.
3. Aç 'Analiz> Araçlar> ROI Yöneticisi', yoğunluk ölçümü için seçilen ROI eklemek için 'Ekle' düğmesini tıklayın. Birden fazla ROI ölçümü için tek bir görüntü seçilebilir. Tüm ROI kadar önceki adımları yineleyins ROI Manager eklenmiştir.
4. 'Daha fazla> Çok Tedbir tıklayın seçildiğinde' tüm dilimleri ölçün 'olduğundan emin olun ve' Dilim Başına Bir Satır 'seçilmemiş olduğunu, daha sonra TMRM ve Flu-4 sinyallerin ortalama floresan yoğunluğu bir tablo elde etmek için' Tamam'ı tıklayın her zaman noktasında her ROI için.
5. TMRM ve Flu-4 sinyaller için ortalama yoğunluğu ve standart sapmayı hesaplamak için tüm ROI verileri kullanır.

6. Final Ücretsiz Ca ^{2 +} İyon Konsantrasyon [Ca2 ^+] Hesaplanması

1. Serbest Ca2 ⁺ iyonu konsantrasyonu, İM görüntüleme çözelti içinde [Ca2 ^+] gibi Maxchelator WEBMAXC GENİŞLETİLMİŞ (gibi bir yazılımı kullanılarak belirlenebilir http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) ya da kelat yapıcı ^11. = Sıcaklık 24 ° C, pH = 7: Örneğin, şu şekilde WEBMAXC değişkenleri genişletilmiş bir dizi.1, iyonik kuvvet = 0.162, EGTA = 0.002 M, HEDTA = 0.01 M, Ca ^{2 +} = 0.0004 M, Mg ^{+ 2} = 0.0078 M Bu nihai serbest Ca2 ⁺ iyonu konsantrasyonu [Ca ^{+ 2]} 62 nM ile sonuçlanır . Bu programlar, reaktif saflık, ölçümler ve pH tespiti doğruluğu olarak dikkate her değişken alamaz unutmayın. Ücretsiz Ca ^{2 +} konsantrasyonunun belirlenmesi için en doğru yöntem kalibre Ca ²⁺ seçici elektrot kullanmaktır.

Sonuçlar

Biz kalsiyum ¹² artış tampon 143B hücre mitokondri yeteneği üzerinde bir MT-ND5 mutasyonunun etkilerini incelemek için bu protokolü kullanılır. Burada gösterilen örnekte, kontrol 143B hücrelerinin TMRM ve Flu-4 ile yüklendi, digitonin permeabilization önce Am. Görüntüleme 5 dakika sonra, 1 sekiz ardışık eklemeler: _CaCI2 ekzojen 40 mM, 100 seyreltme Son serbest Ca2 ⁺ iyonu konsantrasyonu, yapılmıştır [Ca2 ^...

Tartışmalar

Kalsiyum kas kasılması, nöronal sinyalleşme ve hücre çoğalması ¹³ de dahil olmak üzere bir çok hücre süreçlerinde, çok önemli bir rol oynar. Hücre kalsiyum konsantrasyonlarında artışlar genellikle doğrudan ATP nesil ³ yükseltmek için mitokondrial oksidatif fosforilasyonu teşvik edebilmek kalsiyum ile enerji talebi ile ilişkilidir. Etkili bir mitokondriyal kalsiyum birikimini izlemek ve bu fonksiyon genetik faktörler ve farmakolojik ajanların hem n...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin/0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641