Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Mitokondri onları sitozolik Ca şekillendirmek için 2+ hücre içinde sinyal sağlayan (2+ Ca) kalsiyum tecrit kendi iç zarı (Δ Ψm) arasında elektrokimyasal potansiyeli kullanabilir. Floresan boyalar ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler eş zamanlı olarak ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m için bir yöntem tarif eder.
Apart ATP üreten önemli rolleri dışında, mitokondri de (Ca 2+) sıkıca hücre içi Ca 2 + konsantrasyonu düzenleyen tamponlar, yerel kalsiyum gibi hareket ederler. Bunu yapmak için, mitokondri Ca 2+ ayırmak için kendi iç zarı (ΔΨ m) arasında elektrokimyasal potansiyelini kullanmak. Mitokondriye Ca 2 + akını oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) kompleksleri ile elektron transferini artırmak, sitrik asit döngüsünün üç oran sınırlayıcı dehidrojenazları uyarır. Bu uyarım pozitif kalsiyum iyonları mitokondrial matriks içine mitokondri iç zarı çapraz olarak geçici dağılır ΔΨ m, korur.
Biz konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler aynı anda ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m burada bir yöntem açıklanmaktadır. Hücreleri permeabilizing, mitokondriyal Ca 2+ canfloresan boya tetrametilrodamin kullanılarak ΔΨ m, metil ester, perklorat (TMRM) ölçümü ile, floresan Ca2 + göstergesi Fluo-4 AM kullanılarak ölçülebilmektedir. Bu sistemin avantajı, floresan boyalar arasında çok az spektral örtüşme aynı zamanda, doğru mitokondriyal Ca + 2 ve ölçüm ΔΨ m sağlayan olmasıdır. Ca2 + alikotları dizisel ilavesini kullanarak, mitokondriyal Ca 2 + alımı izlenebilir ve Ca2 + mitokondriyal membran geçirgenliği geçiş ve ΔΨ kaybını indükleyen edildiği konsantrasyon saptanmıştır m.
Mitokondri yerel Ca 2 + tampon 1 olarak hareket ederek hücre içi Ca2 + konsantrasyonu düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Ca 2 +, Ca 2 + uniporter yoluyla mitokondri iç zarının (ΔΨ m) 2 arasında var olan elektrokimyasal gradyan tarafından yönlendirilen bir süreç mitokondri girer. Bir kez mitokondrial matriks içinde, Ca 2 + sitrik asit döngüsü 3 üç hız sınırlayıcı dehidrojenazları uyararak oksidatif fosforilasyonu aktif hale getirebilirsiniz. Bu uyarım pozitif kalsiyum iyonları mitokondrial matriks içine mitokondri iç zarı çapraz olarak geçici dağılır ΔΨ m, korur. Mitokondri içinde Ca2 + konsantrasyonu çok yüksek olursa, mitokondriyal geçirgenlik ΔΨ m dağılımı ile sonuçlanan başlatılabilir, cessatioOksidatif fosforilasyon, n ve yolları 4 sinyal hücre ölümünün indüklenmesi.
mitokondri hücresel kalsiyum mekansal tamponlama oynadıkları önemli rol mitokondriyal kalsiyum doğru izlenmesi kritik hale getirir. Çeşitli yöntemler Rodamin bazlı boyaların kullanımı dahil mitokondriyal kalsiyum, izlemek için kurulmuştur. Böyle bir boya, Rhod-2, AM, 6 mitokondriyal Ca 2 + düzeyleri 5 ölçmek için mitokondri bölümleme oldukça etkilidir. Bazı boya lipozomlar gibi diğer organellere birikir, ya da hücre sitozol kalır Ancak dikkat etmek gerekir. Bununla birlikte, alt analizler mitokondri 7'den olanlardan bu sinyalleri ayırt edilmesi için kullanılabilir.
Mitokondriyal kalsiyum izlemek için başka bir teknik floresan muhabiri 8 oluşturur kullanır > Yukarı. Bu genetik olarak kodlanmış prob yararı özellikle, örneğin, insan COX alt birim VIII N-terminal hedefleme sinyali endojen N-terminali peptidi kullanılarak mitokondri hedef olabilir. Bu sistem 9 sinyalizasyon mitokondriyal kalsiyum araştırmak için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır mitokondriyal hedefli aequorin probu oluşturmak için istihdam edilmiştir. Bu genetik olarak kodlanmış prob ana dezavantajı, geçici ekspresyonu ile hücre içine gereken (belirli hücre tipleri için uygun değildir ve değişken sonuçları üretebilir) veya sabit bir sentezleme sistemleri (ki zaman alıcı) oluşturarak olmasıdır.
Yukarıda özetlenen sorunları aşmak için, biz aynı anda mitokondriyal Ca 2+ ve ΔΨ m ölçmek için yeni bir protokol geliştirmiştir. Bu protokol, permeabilize hücrelerin ekzojen kalsiyum ekler daha önce tarif edilen yönteme dayalıdırs = "xref"> 10. Bizim protokol diğer yöntemlere göre üç ana avantajı vardır: Birincisi, biz Flu-4, AM ve TMRM mitokondriyal Ca 2+ ve ΔΨ m, çok farklı spektral özelliklere sahip iki boyalar izlemek için kullanın; ikincisi, hücreler Flu-4 sinyali sadece mitokondriyal Ca tespit edilir +2 ve Ca +2 diğer organellere veya hücre sitoplazmada lokalize olmayan şekilde permeabilize; ve üçüncüsü, Flu-4 kullanımı 2+ mitokondriyal Ca tespit etmek için genetik olarak kodlanmış problar kullanılarak eğer mevcut herhangi bir hücre transfeksiyon veya transformasyon sorunları inkâr, hızlı ve basit hücre boyama sağlar.
Hücrelerin hazırlanması 1.
TMRM ve Flu-4 Görüntüleme için 2. Tamponlar
TMRM ve Fluo-4 AM 3. Hücrelerin boyanması
4. Hücre Görüntüleme
5. Görüntü Analizi
6. Final Ücretsiz Ca 2 + İyon Konsantrasyon [Ca2 +] Hesaplanması
Biz kalsiyum 12 artış tampon 143B hücre mitokondri yeteneği üzerinde bir MT-ND5 mutasyonunun etkilerini incelemek için bu protokolü kullanılır. Burada gösterilen örnekte, kontrol 143B hücrelerinin TMRM ve Flu-4 ile yüklendi, digitonin permeabilization önce Am. Görüntüleme 5 dakika sonra, 1 sekiz ardışık eklemeler: CaCI2 ekzojen 40 mM, 100 seyreltme Son serbest Ca2 + iyonu konsantrasyonu, yapılmıştır [Ca2 ...
Kalsiyum kas kasılması, nöronal sinyalleşme ve hücre çoğalması 13 de dahil olmak üzere bir çok hücre süreçlerinde, çok önemli bir rol oynar. Hücre kalsiyum konsantrasyonlarında artışlar genellikle doğrudan ATP nesil 3 yükseltmek için mitokondrial oksidatif fosforilasyonu teşvik edebilmek kalsiyum ile enerji talebi ile ilişkilidir. Etkili bir mitokondriyal kalsiyum birikimini izlemek ve bu fonksiyon genetik faktörler ve farmakolojik ajanların hem n...
The authors declare that they have no competing financial interests.
Finansal destek için Dr. Kirstin Elgass ve teknik yardım için Monash Micro Görüntüleme Dr Sarah Creed ve Wellcome Trust ve Tıbbi Araştırma Konseyi UK teşekkür ederim. MMcK Avustralya Araştırma Konseyi Gelecek Bursu Programı (FT120100459), William Buckland Vakfı, Avustralya Mitokondriyal Hastalık Vakfı (AMDF), Tıbbi Araştırma ve Monash Üniversitesi Hudson Enstitüsü desteklenmektedir. Bu eser Victoria Hükümeti Operasyonel Altyapısının Desteklenmesi Programı tarafından desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır