蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

要約

ミトコンドリアは、それらが細胞内の細胞質ゾルのCa ²⁺シグナル伝達を形成することができ、カルシウム（Ca ^2+）隔離する彼らの内膜_（ΔΨm）を横切って電気化学ポテンシャルを利用することができます。我々は、同時に、蛍光色素、共焦点顕微鏡を使用して、生細胞中のミトコンドリア^の Ca ²⁺取り込みおよび_ΔΨmを測定するための方法を記載します。

要約

別にATPを生成する際に、それらの本質的な役割から、ミトコンドリアはまた、地元のカルシウム（Ca ^2+）として機能緊密細胞内Ca ²⁺濃度を調節するためにバッファリングします。これを行うには、ミトコンドリアは、Ca ^2+を封鎖するために彼らの内膜_（ΔΨmの）全体に電気化学ポテンシャルを利用しています。ミトコンドリアへ^の Ca ²⁺の流入は、酸化的リン酸化（OXPHOS）錯体を介して電子伝達を増加させる、クエン酸サイクルの三律速デヒドロゲナーゼを刺激します。この刺激は、正のカルシウムイオンがミトコンドリアマトリックスにミトコンドリア内膜を横切るように一時的に放散され_ΔΨmを 、保持しています。

ここでは、同時に、共焦点顕微鏡を用いて、ミトコンドリアに生細胞におけるCa ²⁺取り込みおよび_ΔΨmを測定する方法について説明します。細胞を透過性により、ミトコンドリアのCa ²⁺することができます蛍光色素テトラメチルローダミンを用いて_、ΔΨmの、メチルエステル、過塩素酸塩（TMRM）の測定を、蛍光^の Ca ²⁺指示薬のFluo-4、AMを使用して測定します。このシステムの利点は、同時にミトコンドリア^の Ca ²⁺及び_ΔΨMの正確な測定を可能にする蛍光色素との間の非常に小さなスペクトルの重なりがあることです。 Ca ²⁺アリコートの連続添加を用いて、ミトコンドリア^の Ca ²⁺取り込みを監視することができ、およびCa ^2+は 、ミトコンドリア膜透過性遷移とΔΨの損失を誘発する濃度を決定_mです 。

概要

ミトコンドリアは、ローカル^の Ca ²⁺緩衝液¹として作用することにより、細胞内Ca ²⁺濃度の調節において重要な役割を果たしています。 Ca ²⁺のCa ²⁺ユニポーター、ミトコンドリア内膜_（ΔΨmの^）2を横切って存在する電気化学的勾配によって駆動されるプロセスを介してミトコンドリアに入ります。いったんミトコンドリアマトリックス内部に、Ca ^2+がクエン酸回路³の3律速デヒドロゲナーゼを刺激することによって、酸化的リン酸化を活性化することができます。この刺激は、正のカルシウムイオンがミトコンドリアマトリックスにミトコンドリア内膜を横切るように一時的に放散され_ΔΨmを 、保持しています。ミトコンドリア内のCa ²⁺濃度が非常に高くなる場合は、ミトコンドリア透過性転移は_、ΔΨmの損失で、その結果、開始することができ、cessatio酸化的リン酸化のNおよび経路^{4シグナル} 、細胞死の誘導。

ミトコンドリアは細胞内カルシウムの空間的なバッファリングで果たす重要な役割は、ミトコンドリアのカルシウムの正確なモニタリングが重要なことができます。様々な方法は、ローダミン系染料の使用を含む、ミトコンドリアのカルシウムを監視するために確立されています。そのような染料、Rhod-2 AMは^、6はミトコンドリアのCa ²⁺レベル^5を測定するためにミトコンドリアに分割に非常に効果的です。ただし、注意がいくつかの染料は、リポソームのような他の細胞小器官に蓄積し、または細胞質ゾルに留まるとして使用する必要があります。それにもかかわらず、下流の分析は、ミトコンドリア⁷のものから、これらの信号を区別するために使用することができます。

ミトコンドリアのカルシウムを監視するための別の技術は蛍光レポーターが^8を構築^し利用します >アップ。これらの遺伝的にコードされたプローブの利点は、特に、例えば、ヒトCOXサブユニットVIIIのN末端標的化シグナルを内因性のN末端ペプチドを用いて、ミトコンドリアを標的とすることができるということです。このシステムは^{、9シグナリング}ミトコンドリアカルシウムを調査するために非常に有用であることが証明されている、ミトコンドリア標的エクオリンプローブを生成するために使用されてきました。これらの遺伝的にコードされたプローブの主な欠点は、（特定の細胞型のために実行可能ではなく、変数の結果を生成することができる）の一過性発現によって、または（時間がかかる場合）安定な発現系を作成することにより、細胞内に導入する必要があることです。

上記概説した問題を回避するために、我々は同時に、ミトコンドリアのCa ²⁺とΔΨ _{メートルを}測定するため_の新しいプロトコルを開発しました。このプロトコルは、透過性細胞への外因性のカルシウムを追加し、以前に記載された方法に基づいていますS = "外部参照"> 10。私たちのプロトコルは、他の方法に比べて3の主な利点があります：まず、我々は、ミトコンドリアのCa ²⁺とのΔΨ _メートル 、非常に異なるスペクトル特性を有する2つの染料を監視するために、AMとTMRMをのFluo-4を使用します。第二のFluo-4信号のみがミトコンドリアのCaを検出しているように、細胞を透過処理されている²⁺およびCa ²⁺他の細胞小器官または細胞質ゾルに局在化していません。第三に、ミトコンドリアのCaを検出するためのFluo-4の使用は²⁺遺伝的にコードされたプローブを使用している場合に存在する任意の細胞トランスフェクションまたは形質転換の問題を否定する、高速かつ簡単な細胞染色を可能にします。

プロトコル

細胞の調製

1. 10〔10cmの細胞培養皿または75 cmの培養培地中で²フラスコで細胞を増殖mlの5％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）および1×ペニシリン/ストレプトマイシン（P / Sを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） ）] 37℃/ 5％CO ₂で。
2. 細胞を採取するために、その後、5ミリリットル1×リン酸緩衝生理食塩水（1×PBS）で洗浄し、吸引してメディアを取り出します。次に（w / v）のトリプシン/ 0.25％1.5 mlの0.25％を追加し、吸引によって1×PBSを取り外し（/ Wをv）のエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、2分間、37℃/ 5％CO ₂でインキュベートします。 5ミリリットルの培養培地に再懸濁した後、細胞を除去するために静かに皿やフラスコをタップします。
3. 血球計数器に再懸濁した細胞の12μLを追加することによって、細胞をカウントします。
4. 食器や共焦点イメージングのためのチャンバーカバースリップでプレートの細胞。
   注：これらは、倒立顕微鏡で使用するために設計された適切なプラスチックやガラスボトムを持っています。
5. プレート細胞番目ので、〜80％の密集度は、撮影日に達成されます。例えば、約2×10 ⁴ 143B骨肉腫細胞は、一日の撮像前に8ウェルチャンバースライドの1ウェルに播種することができます。
6. 細胞が付着し、回復できるようにするために、37℃/ 5％CO ₂で一晩細胞をインキュベートします。

TMRMとのFluo-4イメージング用2.バッファ

1. 156ミリモルのNaCl、3mMのKClを、2mMのMgSO ₄を、1.25mMのKH ₂ PO _4、10mMのD-グルコース、2mMのCaCl ₂を、10 mMのHEPES pH値7.35を含有する記録液（RS）を準備します。 -20ºCでの分量を保存するRS。
2. 6のNaCl、130mMの塩化カリウム、7.8のMgCl _2、1 mMのKH ₂ PO _4、0.4mMのCaCl ₂を、2mMのEGTA、10mMのHEDTA、2mMのリンゴ酸、2 mMのグルタミン酸、2 mMのを含む細胞内培地（IM）を準備ADPおよび20mMのHEPES pHは7.1。リンゴ酸、グルタミン酸およびADPの200mMのストック溶液を、別々に調製等分し、-20℃で保存することができます。これらの目ocksは、使用直前にIMに添加することができます。
3. Ca ²⁺フリーのハンクス緩衝塩溶液（HBSS）は、商業的供給業者から事前に準備を得ることができます。 500μMの最終濃度でエチレングリコール - ビス（βアミノエチルエーテルに）-N、N、N '、N'-四酢酸（EGTA）を加えます。
4. 100％メタノール中の10mMテトラメチルローダミン、メチルエステル、過塩素酸塩（TMRM）のストック溶液を準備します。このストックから、蒸留H ₂ O中に2μMのワーキングストックを作ります
5. 100％エタノール中10mMベラパミルのストック溶液を準備します。
6. ジメチルスルホキシド（DMSO）中のFluo-4アセトキシメチルエステル（フルオ-4、AM）の1mg / mlの（w / v）のストック溶液を調製します。
   注：フルオ4は、AMは、Ca ^2+に結合すると蛍光が増大するカルシウム指示薬です。フルオ4はフッ素で置き換えられ2個の塩素置換基で、フルオ-3のアナログです。これは、488nmで増加した蛍光励起及びより高い蛍光シグナルレベルを生じます。ザAMエステル基は、細胞膜を透過することができる非荷電のFluo-4分子をもたらします。細胞内に一旦、AMエステルは細胞内に捕捉されるのFluo-4の帯電した形で、その結果、非特異的エステラーゼによって切断されます。
7. 100％エタノール中で1 mMのカルボニルシアニドp型trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）のストック溶液を準備します。
8. 蒸留H ₂ Oの株式25 mg / mlとの溶液（w / v）のジギトニンを準備
9. DMSO中の100μMタプシガルジンのストック溶液を準備します。
10. 蒸留H ₂ O中の40mMの塩化カルシウム（CaCl _2）のストック溶液を調製します

TMRMとのFluo-4、AMを用いた細胞の3染色

1. 20 nMのTMRMとRS染色溶液を調製し、5μg/ mlの（w / vで）のFluo-4、AMおよびプルロニックF-127 RSのように0.005％の界面活性剤。
   注：この界面活性剤があるFluo-4、AMの可溶化を促進する非イオン性ポリオールです。注：10μMのベラパミルもinhibiに添加することができますそれは、分析される細胞型で発現される場合に、原形質膜の多剤輸送体によるT TMRM輸出。
2. ピペットで細胞から培養培地を取り除き、100μlの1×PBSで洗浄しました。
3. ピペットで1×PBSを削除し、室温で45分間、250μlのRS染色液中で細胞をインキュベートします。
   注：のFluo-4、AMが細胞に入ると、AMエステルは細胞のエステラーゼによって切断されます。室温でインキュベートすることのFluo-4、AMは、ミトコンドリアを入力することを可能にする、エステラーゼ活性を阻害します。
4. ピペットでRS染色溶液を除去し、過剰のFluo-4、AMおよびTMRMを削除するには、のCa ^2+μlの100のフリーHBSSを細胞を洗浄。
5. 25 / mlの（w / v）のジギトニン、200 nMのTMRMとIMで1μMのタプシガルジンとIMイメージングソリューションを準備します。
   注：ジギトニンの濃度は、ミトコンドリア内膜の透過化が起こらないことを確実にするために調整する必要があります。これは、強度を評価することによって経験的に決定することができますジギトニンの異なる濃度でTMRM信号の。
6. ピペットでのCa ²⁺フリーのHBSSを削除して、細胞へのIMイメージングソリューションの300μlのを追加します。室温で10分間平衡化した細胞を残します。細胞は、今のCaCl ₂添加物の撮像のための準備が整いました。

4.細胞イメージング

1. 倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡上に皿やIMイメージング溶液中の細胞とチャンバーカバーガラスを置きます。
2. TMRMとのFluo-4の励起および発光スペクトルのための顕微鏡レーザーの設定を使用します。例えば、それぞれTMRMとのFluo-4を励起し543nmでのHe-Ne及び473nmのアルゴンレーザーラインを使用しています。細胞への光損傷を最小限に抑えるために、約5％の低レーザーパワーを使用してください。
3. 画像ごとに25秒をスキャンするために顕微鏡を設定します。 TMRMとのFluo-4信号のベースライン測定値を確立するために10分間細胞をスキャンします。
   注：フルオ4信号は、カルシウムコンセントを休んで弱いまたは検出不能であってもよいです配給。
4. IMのイメージングソリューションの300μlの中の細胞への直接の40mMのCaCl ₂ストック溶液3μlの追加（1：100希釈）をピペットで軽く混ぜます。必要に応じてのCaCl _2を添加し、混合しながら画像のスキャンを一時停止します。
   注：Maxchelator WEBMAXCは（拡張として、最終的な遊離Ca ²⁺イオン濃度の[Ca ^2+] IM撮像溶液中でそのようなソフトウェアを用いて計算することができるhttp://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ）又はキレート化剤^11。最終の遊離Ca ²⁺イオン濃度の計算方法の詳細な説明は、の[Ca ^2+]は、以下のセクション6に記載されています。
5. 希望TMRMまたはのFluo-4の信号は、通常8〜10の追加の周りに、到達するまでのCaCl ₂の追加ごとに4分を繰り返した後、約4分間の画像走査を続けます。
6. 1 mMのFCCPの100希釈（最終C：ピペットを使用して、1を追加します。_ΔΨmを放散する細胞に直接、10μMのoncentration）。さらに5分間画像セル。実験は完了です。

5.画像解析

1. 撮像が完了すると、http://downloads.openmicroscopy.org/bioからバイオフォーマットプラグイン（ダウンロード 'bioformats_package.jar'で例示ImageJソフトウェア、画像分析ソフトウェアを使用してのFluo-4とTMRMシグナルの強度を決定します-formats /とに保存 'C：プログラムファイル ImageJのプラグイン」フォルダ）。
2. ImageJの中で（例えば.oifファイル）画像ファイルを開きます。選択ツールをクリックして、ミトコンドリアが含まれている関心領域（ROI）を選択します。 ROIを選択するには、最初のTMRM信号を使用してください。
3. 開く]> [ツール]> [ROIマネージャー分析」、強度測定のために選択されたROIを含むように「追加」をクリックします。複数のROIを測定するための単一の画像上で選択することができます。すべてのROIまで、前の手順を繰り返しますsがROI Managerに追加されました。
4. 「詳細>マルチ測定」をクリックし、「すべてのスライスを測定する 'が選択され、「スライスごとに1つの行が「選択解除されていること、そして、TMRMの平均蛍光強度のテーブルとのFluo-4の信号を得るために、「OK」をクリックしていることを確認してください各時点での各ROIのため。
5. TMRMとのFluo-4の信号の平均強度および標準偏差を計算するために、すべてのROIからのデータを使用してください。

6.最終的な無料のCa ²⁺イオン濃度の[Ca ^2+]の計算

1. 遊離Ca ²⁺イオン濃度IM撮像溶液中の[Ca ^2+]は、Maxchelator WEBMAXC EXTENDED（などのソフトウェアを用いて決定することができるhttp://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ）またはキレート剤^11。 =温度を24℃、pH値= 7：たとえば、次のようにWEBMAXCの変数がEXTENDEDに設定します。1、イオン強度= 0.162、EGTA = 0.002 M、HEDTA = 0.01 M、のCa ²⁺ = 0.0004 MおよびMg ²⁺ = 0.0078 M.これは、最終的な遊離Ca ²⁺イオン濃度62 nMでの[Ca ^2+]になります。これらのプログラムは、このような試薬の純度、測定およびpH決意の精度として、アカウントにすべての変数を取ることができないことに注意してください。遊離Ca ²⁺濃度を測定するための最も正確な方法は、較正され^た Ca ²⁺選択性電極を使用することです。

結果

私たちは、カルシウムの¹²の増加をバッファリングする143B細胞のミトコンドリアの能力にMT-ND5変異の影響を調べるために、このプロトコルを使用しています。ここに示した例では、制御143B細胞はTMRMとのFluo-4、ジギトニンで透過処理の前にAMを負荷しました。イメージングの5分後、1の8の順次追加：40mMの外因性のCaCl ₂の100希釈の[Ca ^...

ディスカッション

カルシウムは筋収縮、神経伝達および細胞増殖^13を含む多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしています。細胞カルシウム濃度の増加は、多くの場合、直接ATP世代^3を上昇させるために、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を刺激することができるカルシウムで、エネルギー需要と関連しています。我々が効果的にミトコンドリアのカルシウム蓄積を?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641