Mesure simultanée de mitochondrial Calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence

Résumé

Les mitochondries peuvent utiliser le potentiel électrochimique à travers leur membrane interne (Δ _Ψm) pour séquestrer le calcium ^{(Ca2 +),} ce qui leur permet de façonner Ca cytosolique ²⁺ de signalisation dans la cellule. Nous décrivons un procédé pour mesurer simultanément les mitochondries ^{Ca2 +} d'absorption et ΔΨ _m dans les cellules vivantes en utilisant des colorants fluorescents et de la microscopie confocale.

Résumé

En dehors de leur rôle essentiel dans la création de l' ATP, les mitochondries jouent également le rôle du calcium local ^{(Ca2 +)} tampons à bien réguler la concentration intracellulaire de ^{Ca2 +.} Pour ce faire, les mitochondries utilisent le potentiel électrochimique à travers leur membrane interne (ΔΨ _m) pour séquestrer le Ca ^2+. L'afflux de ^{Ca2 +} dans les mitochondries stimule trois déshydrogénases limitant la vitesse du cycle de l' acide citrique, ce qui augmente le transfert d'électrons à travers la phosphorylation oxydative (OXPHOS) complexes. Cette stimulation maintient ΔΨ _m, qui est temporairement dissipée sous les ions calcium positifs traversent la membrane mitochondriale interne dans la matrice mitochondriale.

Nous décrivons ici une méthode pour les mitochondries de mesure simultanément Ca ²⁺ d'absorption et ΔΨ _m dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale. En perméabilisant les cellules, Ca ²⁺ mitochondrial peutmesurer à l' aide de Ca ²⁺ indicateur fluorescent Fluo-4 AM, avec mesure de ΔΨ _m à l' aide du colorant fluorescent tétraméthylrhodamine, l' ester méthylique, le perchlorate (TMRM). L'avantage de ce système est qu'il existe très peu de chevauchement spectral entre les colorants fluorescents, ce qui permet simultanément une mesure précise de la mitochondrie Ca ²⁺ et ΔΨ _m. En utilisant l'addition séquentielle d'aliquotes de Ca ^2+, Ca ²⁺ absorption mitochondriale peut être contrôlée, et la concentration à laquelle ^{Ca2 +} mitochondrial induit une transition de perméabilité de la membrane et la perte de _m ΔΨ déterminée.

Introduction

Les mitochondries jouent un rôle important dans la régulation de la concentration intracellulaire de ^{Ca2 +} en agissant comme locaux Ca ²⁺ tampons ^1. Ca ²⁺ entre les mitochondries via le uniport Ca ^2+, un processus piloté par le gradient électrochimique qui existe à travers la membrane mitochondriale interne (ΔΨ _m) ^2. Une fois dans la matrice mitochondriale, Ca ²⁺ peut activer la phosphorylation oxydative en stimulant trois déshydrogénases limitant la vitesse du cycle de l' acide citrique ^3. Cette stimulation maintient ΔΨ _m, qui est temporairement dissipée sous les ions calcium positifs traversent la membrane mitochondriale interne dans la matrice mitochondriale. Si la concentration de ^{Ca2 +} dans les mitochondries devient très élevée, la transition de perméabilité mitochondriale peut être déclenchée, entraînant la dissipation de ΔΨ _m, la cessation de la phosphorylation oxydative et l'induction de la mort cellulaire des voies de signalisation ^4.

Le rôle important que jouent les mitochondries dans la mémoire tampon spatiale du calcium cellulaire rend le contrôle précis du calcium mitochondrial critique. Diverses méthodes ont été mis en place pour surveiller le calcium mitochondrial, y compris l'utilisation de colorants à base de rhodamine. Un tel colorant, Rhod-2, AM, est très efficace au partitionnement des mitochondries pour mesurer mitochondriales niveaux de ^{Ca2 + 5, 6.} Cependant, les soins doit être utilisé comme certains colorants accumulera dans d'autres organites, tels que les liposomes, ou de rester dans le cytosol des cellules. Cependant, des analyses en aval peuvent être utilisés pour distinguer ces signaux de ceux de la mitochondrie ^7.

Une autre technique pour surveiller le calcium mitochondrial utilise rapporteur fluorescent construit ⁸ up>. L'avantage de ces sondes codées génétiquement est qu'ils peuvent être spécifiquement ciblé vers les mitochondries en utilisant des peptides endogènes N-terminal, par exemple le signal de ciblage N-terminal de la sous-unité VIII de la COX humaine. Ce système a été utilisé pour générer une sonde aequorine mitochondriale ciblée qui a révélé extrêmement utile pour étudier le calcium mitochondrial de signalisation ^9. Le principal inconvénient de ces sondes codées génétiquement est qu'ils doivent être introduits dans les cellules par l'expression transitoire (ce qui est impossible pour certains types de cellules et peuvent produire des résultats variables) ou en créant des systèmes d'expression stables (qui prend du temps).

Pour contourner les problèmes décrits ci - dessus, nous avons développé un nouveau protocole pour mesurer mitochondrial Ca ²⁺ et ΔΨ _m simultanément. Ce protocole est basé sur une méthode décrite précédemment qui ajoute du calcium exogène à des cellules perméabiliséess = "xref"> 10. Notre protocole a trois principaux avantages par rapport aux autres méthodes: tout d' abord, nous utilisons Fluo-4, AM et TMRM pour surveiller Ca ²⁺ et mitochondrial ΔΨ _m, deux colorants qui ont des propriétés spectrales très distinctes; d' autre part, les cellules sont perméabilisées afin que le signal Fluo-4 est seulement détecter mitochondrial Ca2 ⁺ et ^{Ca2 +} non localisé à d' autres organelles ou dans le cytosol des cellules; et troisièmement, l'utilisation de Fluo-4 pour détecter Ca ²⁺ mitochondrial permet de coloration cellulaire simple et rapide, éliminant tous les problèmes de transfection ou de transformation cellulaire qui existent si l'on utilise des sondes codées génétiquement.

Protocole

1. Préparation des cellules

1. Cultiver les cellules sur 10 cm des boîtes de culture cellulaire ou flacons de 75 ^cm2 dans les milieux de culture [10 ml Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco supplémenté avec 5% (v / v) de sérum de veau fœtal (FBS) et 1x pénicilline / streptomycine (p / s )] à 37 ° C / 5% de CO _2.
2. Pour récolter les cellules, retirer le support par aspiration, puis laver avec 5 ml 1x tampon phosphate salin (PBS 1x). Retirer PBS 1x par aspiration, puis ajouter 1,5 ml de 0,25% (p / v) de trypsine / 0,25% (p / v) d' acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et on incube à 37 ° C / 5% de CO ₂ pendant 2 min. Appuyez sur plat ou flacon doucement pour éliminer les cellules, puis remettre en suspension dans 5 ml de milieux de culture.
3. Compter les cellules en ajoutant 12 pi de cellules remises en suspension sur un hémocytomètre.
4. cellules en plaques dans des boîtes ou des lamelles chambré pour l'imagerie confocale.
   NOTE: Ceux-ci auront un fond en plastique ou en verre approprié qui a été conçu pour être utilisé avec des microscopes inversés.
5. cellules de la plaque de sorte thà ~ 80% de confluence est atteinte le jour de l'image. Par exemple, environ 2 x 10 ⁴ cellules d'ostéosarcome 143B peuvent être étalées dans un puits d'une lame de chambre 8 puits un jour avant l' imagerie.
6. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C / 5% de _CO2 pour permettre aux cellules de se fixer et de se rétablir.

2. Tampons pour TMRM et Fluo-4 Imaging

1. Préparer la solution d'enregistrement (RS) contenant du NaCl 156 mM, KCl 3 mM, 2 mM de _MgSO4, 1,25 mM de KH ₂ PO ₄ 10 mM , D-glucose, 2 mM de _CaCl2 et 10 mM de HEPES à pH 7,35. Magasin RS à -20 ºC.
2. Préparer Intracellulaire moyenne (IM) contenant 6 mM de NaCl, KCl 130, 7,8 mM de _MgCl2, 1 mM de KH ₂ PO _4, 0,4 mM de _CaCl2, 2 mM d' EGTA mM HEDTA 10 mM malate de 2 mM de glutamate 2, 2 mM ADP et de l'HEPES 20 mM pH 7,1. 200 solutions mM d'actions de malate, le glutamate et l'ADP peuvent être préparés séparément, aliquotés et conservés à -20 ° C. Ces sttroupeaux peuvent être ajoutés à l'IM juste avant utilisation.
3. Ca solution saline tamponnée ²⁺ libre de Hank (HBSS) peut être obtenu de pré-préparé à partir de fournisseurs commerciaux. Ajouter de l'éthylène glycol-bis (éther β-aminoéthyl) -N, N, N ', N'-tétraacétique (EGTA) à une concentration finale de 500 uM.
4. Préparer une solution mère de tétraméthylrhodamine 10 mM, ester méthylique, perchlorate (TMRM) dans 100% de méthanol. De ce stock, faire un stock de travail de 2 uM dans l' eau distillée ₂ O.
5. Préparer une solution mère de vérapamil mM 10 dans 100% d'éthanol.
6. Préparer un 1 mg / ml (p / v) solution mère de Fluo-4 ester acétoxyméthyle (Fluo-4, AM) dans le diméthylsulfoxyde (DMSO).
   NOTE: Fluo-4 AM est un indicateur de calcium qui présente a augmenté la fluorescence lors de la liaison Ca ^2+. Fluo-4 est un analogue de Fluo-3, les deux substituants chloro remplacés par des atomes de fluor. Il en résulte une augmentation de l'excitation de fluorescence à 488 nm et des niveaux de signal de fluorescence plus élevé. leun groupe ester AM se traduit par une Fluo-4 molécules non chargées qui peuvent pénétrer dans les membranes cellulaires. Une fois dans la cellule, l'ester AM est clivée par des esterases non spécifiques, résultant en une forme chargée de Fluo-4 qui est emprisonné à l'intérieur de la cellule.
7. Préparer une solution mère de 1 mM carbonyl cyanure p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) dans 100% d'éthanol.
8. Préparer une solution mère de 25 mg / ml (p / v) digitonine en H distillée ₂ O.
9. Préparer une solution stock de 100 pM thapsigargine dans le DMSO.
10. Préparer une solution mère de 40 mM de chlorure de calcium (CaCl ₂₎ dans l' eau distillée ₂ O.

3. Coloration des cellules avec TMRM et Fluo-4, AM

1. Préparer une solution RS coloration avec 20nM TMRM, 5 ug / ml (p / v) de Fluo-4 AM et 0,005% de tensioactif tel que le Pluronic F-127 RS.
   NOTE: L'agent tensio-actif non ionique est un polyol qui facilite la solubilisation de Fluo-4 AM. Note: 10 uM vérapamil peut également être ajouté à INHIBIt TMRM exportation par le transporteur multidrogues de la membrane plasmique, si elle est exprimée dans le type de cellules en cours d'analyse.
2. Retirer les milieux de culture de cellules à la pipette et laver avec 100 pi 1x PBS.
3. Retirer PBS 1x à la pipette et laisser incuber les cellules dans une solution de coloration RS 250 pi pendant 45 min à température ambiante.
   Remarque: Une fois que le Fluo-4 AM pénètre dans la cellule, l'ester AM est clivée par des esterases cellulaires. Incubant à la température ambiante, inhibe l'activité d'estérase, ce qui permet Fluo-4 AM à pénétrer dans les mitochondries.
4. Retirer la solution RS de coloration par pipette et laver les cellules dans 100 ul de Ca ²⁺ libre HBSS pour éliminer l' excès Fluo-4, AM et TMRM.
5. Préparer une solution d'imagerie IM avec 25 pg / ml (p / v) digitonine, 200 nM TMRM et 1 uM thapsigargine dans IM.
   Remarque: la concentration de la digitonine peut devoir être ajusté pour faire en sorte que la perméabilisation de la membrane mitochondriale interne ne se produit pas. Ceci peut être déterminé de façon empirique par l'évaluation de l'intensitéTMRM du signal à différentes concentrations de digitonine.
6. Retirer le ^{Ca2 +} libre HBSS par pipette et ajouter 300 ul d' une solution IM d'imagerie vers les cellules. Laisser les cellules à l'équilibre à la température ambiante pendant 10 min. Les cellules sont maintenant prêts pour l' imagerie avec CaCl ₂ ajouts.

4. imagerie cellulaire

1. Placer un plat ou lamelle couvre-chambré avec des cellules dans une solution IM d'imagerie sur un microscope confocal à balayage laser inversée.
2. Utiliser le réglage sur les lasers à microscope pour l'excitation et l'émission de spectres TMRM et Fluo-4. Par exemple, utiliser 543 nm He-Ne et 473 nm lignes laser d'argon pour exciter TMRM et Fluo-4 respectivement. Utiliser une faible puissance laser d'environ 5% afin de minimiser toute photo-endommagement des cellules.
3. Set microscope pour numériser des images toutes les 25 sec. cellules d'analyse pour 10 min pour établir des lectures de référence pour la TMRM et Fluo-4 signaux.
   NOTE: Le signal Fluo-4 peut être faible ou indétectable au repos concent de calciumrations.
4. Ajouter 3 pi de mM _CaCl2 solution mère 40 directement aux cellules dans 300 pi de solution d'imagerie IM (1: 100 de dilution) et mélanger doucement avec une pipette. Pause de la numérisation de l' image tout en ajoutant et en mélangeant le CaCl ₂ si nécessaire.
   NOTE: La libre concentration finale d'ions Ca ²⁺ [Ca ^2+] dans la solution d'imagerie IM peut être calculé à l' aide de logiciels tels que Maxchelator WEBMAXC ETENDU ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) ou chélateur ^11. Une description détaillée de la façon de calculer la libre concentration finale d'ions Ca ²⁺ [Ca ^2+] est décrite dans la section 6 ci - dessous.
5. Poursuivre l' analyse de l' image pendant environ 4 min, puis répétez CaCl ₂ ajouts toutes les 4 min jusqu'à ce que la TMRM désirée ou Fluo-4 signaux sont atteints, généralement autour de 8 à 10 additions.
6. En utilisant une pipette, ajouter une dilution 1: 100 de 1 mM FCCP (c finaleoncentration de 10 uM) directement aux cellules de se dissiper ΔΨ _m. cellules d'image pour un autre 5 min. L'expérience est maintenant terminée.

5. Analyse de l'image

1. Une fois que l'imagerie est terminée, déterminer l'intensité des signaux Fluo-4 et TMRM en utilisant un logiciel d'analyse d'image, par exemple un logiciel ImageJ avec le plugin Bio-formats (download 'bioformats_package.jar' de http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / et enregistrez-le dans: le dossier 'C plugins Program Files ImageJ s).
2. Ouvrez le fichier d'image (par exemple un fichier .oif) dans ImageJ. Cliquez sur l'outil de sélection et sélectionnez une région d'intérêt (ROI) qui contient des mitochondries. Utilisez le signal de TMRM initial pour sélectionner le retour sur investissement.
3. Ouvrir 'Analyse> Outils> Gestionnaire de retour sur investissement », cliquez sur« Ajouter »pour inclure le ROI sélectionnée pour la mesure de l'intensité. ROIs multiples peuvent être sélectionnés sur une seule image pour la mesure. Répétez les étapes précédentes jusqu'à ce que tous les ROIs ont été ajoutés au gestionnaire de ROI.
4. Cliquez sur "Plus> Multi Mesure ', assurez-vous que« Mesurer toutes les tranches "est sélectionné et que« une ligne par tranche' est désactivée, puis cliquez sur 'OK' pour obtenir une table d'intensité de fluorescence moyenne des TMRM et Fluo-4 signaux pour chaque ROI à chaque point de temps.
5. Utiliser les données de tous les ROIs pour calculer les intensités moyennes et écart-type pour le TMRM et Fluo-4 signaux.

6. Calcul de la finale Ca ²⁺ gratuit Ion Concentration [Ca ^2+]

1. La libre Ca ²⁺ concentration d'ions [Ca ^2+] dans la solution d'imagerie IM peut être déterminée en utilisant des logiciels tels que Maxchelator WEBMAXC ETENDU ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) ou chélateur ^11. Par exemple, définir les variables dans WEBMAXC prorogés comme suit: Température = 24 ° C, pH = 7.1, la force ionique = 0,162, 0,002 M d' EGTA =, HEDTA = 0,01 M, Ca ²⁺ = 0,0004 M et Mg ²⁺ = 0,0078 M. Il en résulte une concentration en ^{Ca2 +} libre finale d'ions [Ca2 ^+] de 62 nm . Notez que ces programmes ne peuvent pas prendre en compte toutes les variables, telles que la pureté des réactifs, la précision des mesures et la détermination du pH. La méthode la plus précise pour déterminer la libre concentration Ca ²⁺ est d'utiliser une électrode sélective ^d'un Ca étalonné.

Résultats

Nous avons utilisé ce protocole pour examiner les effets d'une mutation MT-ND5 sur la capacité des mitochondries des cellules 143B au tampon augmente en calcium ^12. Dans l'exemple représenté ici, les cellules 143B de commande ont été chargées avec Fluo-TMRM et 4, AM avant de perméabilisation à la digitonine. Après 5 min d'imagerie, huit additions séquentielles d'une dilution 1: 100 de 40 mM de CaCl ₂ exogènes ont ét...

Discussion

Le calcium joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires, y compris la contraction musculaire, la signalisation neuronale et la prolifération cellulaire ^13. L' augmentation des concentrations de calcium cellulaire sont souvent associés à la demande d'énergie, avec le calcium capable de stimuler directement la phosphorylation oxydative mitochondriale pour augmenter la génération d' ATP ^3. Il est donc essentiel que nous avons la capacité d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641