Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente

Riepilogo

I mitocondri possono utilizzare il potenziale elettrochimico attraverso la loro membrana interna (Δ _Ψm) di sequestrare il calcio (Ca ^2+), permettendo loro di modellare Ca citosolico ^{2 +} Segnalazione all'interno della cellula. Descriviamo un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca ²⁺ di assorbimento e ΔΨ _m in cellule vive con coloranti fluorescenti e microscopia confocale.

Abstract

Oltre al loro ruolo fondamentale nel generare ATP, i mitocondri fungono anche da calcio locale (Ca ²⁺⁾ buffer per regolare strettamente concentrazione intracellulare di Ca ^2+. Per fare questo, mitocondri utilizzano il potenziale elettrochimico attraverso la membrana interna (ΔΨ _m) di sequestrare Ca ^2+. L'afflusso di Ca ²⁺ nei mitocondri stimola tre deidrogenasi rate-limiting del ciclo dell'acido citrico, aumentare il trasferimento di elettroni attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) complessi. Questa stimolazione mantiene ΔΨ _m, che viene temporaneamente dissipata come gli ioni di calcio positivi attraversare la membrana mitocondriale interna nella matrice mitocondriale.

Descriviamo qui un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca ²⁺ di assorbimento e ΔΨ _m in cellule vive usando la microscopia confocale. Con permeabilizzante le cellule, Ca ²⁺ mitocondriale puòessere misurata utilizzando la fluorescenza Ca ²⁺ indicatore Fluo-4, AM, con la misura di _m ΔΨ utilizzando il tetramethylrhodamine colorante fluorescente, estere metilico, perclorato (TMRM). Il vantaggio di questo sistema è che c'è poca sovrapposizione spettrale tra i coloranti fluorescenti, consentendo una misurazione precisa della mitocondriale Ca ²⁺ e ΔΨ _m simultaneamente. Utilizzando l'aggiunta sequenziale di Ca ²⁺ aliquote, Ca ²⁺ mitocondriale assorbimento possono essere monitorati, e la concentrazione alla quale Ca ²⁺ induce mitocondriale transizione di permeabilità della membrana e la perdita di ΔΨ _M determinato.

Introduzione

I mitocondri svolgono un ruolo importante nella regolazione intracellulare concentrazione di Ca ^2+, agendo come locali Ca ²⁺ buffer ^1. Ca ²⁺ entra nei mitocondri attraverso il Ca ²⁺ uniporter, un processo guidato dal gradiente elettrochimico che esiste attraverso la membrana mitocondriale interna (ΔΨ _m) ^2. Una volta all'interno della matrice mitocondriale, Ca ²⁺ può attivare fosforilazione ossidativa stimolando tre deidrogenasi rate-limiting del ciclo dell'acido citrico ^3. Questa stimolazione mantiene ΔΨ _m, che viene temporaneamente dissipata come gli ioni di calcio positivi attraversare la membrana mitocondriale interna nella matrice mitocondriale. Se il Ca ²⁺ concentrazione ai mitocondri diventa molto alta, transizione di permeabilità mitocondriale può essere avviata, con conseguente dissipazione di ΔΨ _m, la cessation di fosforilazione ossidativa e l'induzione della morte cellulare vie di segnalazione ^4.

Il ruolo importante che i mitocondri giocano nel buffer spaziale del cellulare di calcio rende il monitoraggio accurato del calcio mitocondriale critica. Vari metodi sono stati stabiliti per monitorare calcio mitocondriale, compreso l'uso di coloranti a base di rodamina. Uno di questi dye, Rhod-2, AM, è molto efficace nel partizionamento ai mitocondri per misurare mitocondriali di Ca ²⁺ livelli ^{5, 6.} Tuttavia, la cura deve essere utilizzato come una tintura si accumulerà in altri organelli, come liposomi, o rimanere nel citosol delle cellule. Tuttavia, analisi a valle possono essere impiegati per distinguere questi segnali da quelli dai mitocondri ^7.

Un'altra tecnica per monitorare il calcio mitocondriale utilizza reporter fluorescente costrutti ⁸ up>. Il vantaggio di queste sonde geneticamente codificati è che possono essere specificamente mirata ai mitocondri utilizzando endogeni peptidi N-terminali, ad esempio il segnale di targeting N-terminale della subunità COX umana VIII. Questo sistema è stato impiegato per generare una sonda equorina mitocondriale targeting che si è dimostrata estremamente utile per studiare calcio mitocondriale segnalazione ^9. L'inconveniente principale di queste sonde geneticamente codificate è che hanno bisogno di essere introdotti nelle cellule di espressione transitoria (che non è fattibile per alcuni tipi di cellule e possono produrre risultati variabili) o attraverso la creazione di sistemi di espressione stabili (che richiede molto tempo).

Per aggirare i problemi di cui sopra, abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per misurare mitocondriale Ca ²⁺ e ΔΨ _m contemporaneamente. Questo protocollo si basa su un metodo precedentemente descritto che aggiunge calcio esogeno per cellule permeabilizzates = "xref"> 10. Il nostro protocollo ha tre vantaggi principali rispetto ad altri metodi: in primo luogo, usiamo Fluo-4, AM e TMRM per monitorare Ca ²⁺ mitocondriale e ΔΨ _m, due coloranti che hanno ben distinte proprietà spettrali; in secondo luogo, le cellule vengono permeabilizzate modo che il segnale Fluo-4 è solo rilevando mitocondriale Ca ²⁺ e non Ca ²⁺ localizzato ad altri organelli o citosol delle cellule; e in terzo luogo, l'uso di Fluo-4 per rilevare Ca ²⁺ mitocondriale consente per la colorazione delle cellule veloce e semplice, negando eventuali problemi di trasfezione cellulare o trasformazione esistenti se si usano sonde geneticamente codificati.

Protocollo

1. Preparazione di cellule

1. Crescere le cellule in 10 cm piatti di coltura cellulare o 75 cm ² palloni in terreni di coltura [10 ml di Dulbecco Eagles Modificati (DMEM) integrato con il 5% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) e 1x penicillina / streptomicina (p / s )] a 37 ° C / 5% CO _2.
2. Per raccogliere le cellule, rimuovere il supporto per aspirazione, quindi lavare con 5 ml di 1x tampone fosfato (PBS 1x). Rimuovere 1x PBS mediante aspirazione, quindi aggiungere 1,5 ml di 0,25% (w / v) Tripsina / 0,25% (w / v) di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare a 37 ° C / 5% di CO ₂ per 2 min. Toccare piatto o pallone delicatamente per rimuovere le cellule, poi risospendere in terreni di coltura 5 ml.
3. Contare le cellule con l'aggiunta di 12 ml di cellule risospese su un emocitometro.
4. cellule piastra in piatti o lamelle camerata per l'imaging confocale.
   NOTA: Questi avranno un idoneo fondo in plastica o vetro che è stato progettato per l'utilizzo con microscopi invertiti.
5. cellule piastra in modo tha ~ 80% di confluenza viene raggiunto il giorno di imaging. Ad esempio, circa 2 x 10 ⁴ cellule di osteosarcoma 143B possono essere placcati in un pozzetto di un 8-ben scorrevole camera di un giorno prima di imaging.
6. Incubare le cellule per una notte a 37 ° C / 5% di CO ₂ per consentire cellule per fissare e recuperare.

2. Tamponi per TMRM e Fluo-4 Imaging

1. Preparare Record Solution (RS) contenente 156 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM MgSO _4, 1,25 mm KH ₂ PO _4, 10 mm D-glucosio, 2 mM CaCl ₂ e 10 mm HEPES pH 7,35. Conservare RS in aliquote a -20 ° C.
2. Preparare intracellulare Medium (IM) contenente 6 mM NaCl, 130 mm KCl, 7,8 mm MgCl _2, 1 mM KH ₂ PO _4, 0,4 mm CaCl _2, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2 mM malato, 2 mM glutammato, 2 mM ADP e 20 mM HEPES pH 7.1. 200 mm soluzioni stock di malato, glutammato e ADP possono essere preparati separatamente, aliquotati e conservati a -20 ° C. questi stgreggi possono essere aggiunti a GI appena prima dell'uso.
3. Ca soluzione salina tamponata ²⁺ libero di Hank (HBSS) può essere ottenuto pre-preparato da fornitori commerciali. Aggiungere etilene glicol-bis (β-amminoetil etere) -N, N, N ', N'-tetraacetico (EGTA) ad una concentrazione finale di 500 mM.
4. Preparare una soluzione madre di 10 mm tetramethylrhodamine, estere metilico, perclorato (TMRM) in 100% di metanolo. A partire da questa, fare una scorta di lavoro di 2 micron di H ₂ O. distillata
5. Preparare una soluzione madre di 10 mm Verapamil in 100% di etanolo.
6. Preparare una 1 mg / ml (p / v) Soluzione di Fluo-4 estere acetossimetil (Fluo-4, AM) in dimetilsolfossido (DMSO).
   NOTA: Fluo-4, AM è un indicatore di calcio che esibisce aumento di fluorescenza dal legame Ca ^2+. Fluo-4 è un analogo di fluo-3, con i due sostituenti cloro sostituiti da fluori. Ciò si traduce in un aumento di eccitazione di fluorescenza a 488 nm e superiori livelli del segnale di fluorescenza. IlAM gruppo estereo traduce in un uncharged Fluo-4 molecola che può permeare le membrane cellulari. Una volta all'interno della cellula, l'estere AM viene scisso dalle esterasi non specifiche, risultante in una forma carica di Fluo-4 che è intrappolato all'interno della cellula.
7. Preparare una soluzione madre di 1 mm di carbonile cianuro di p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) in 100% di etanolo.
8. Preparare una soluzione stock di 25 mg / ml (w / v) digitonina in H ₂ O. distillata
9. Preparare una soluzione stock di 100 micron thapsigargin in DMSO.
10. Preparare una soluzione madre di 40 mm cloruro di calcio (CaCl ₂₎ in H ₂ O. distillata

3. La colorazione delle cellule con TMRM e Fluo-4, AM

1. Preparare la soluzione RS colorazione con 20 nM TMRM, 5 ug / ml (w / v) Fluo-4, AM e 0,005% di tensioattivo come Pluronic F-127 in RS.
   NOTA: Questo tensioattivo non ionico è un poliolo che facilita la solubilizzazione di Fluo-4, AM. Nota: 10 micron Verapamil può anche essere aggiunto alla inibizionet TMRM esportazione dal trasportatore multidrug membrana plasmatica se espressa nel tipo di cellula in fase di analisi.
2. Rimuovere terreni di coltura dalle cellule per pipetta e lavare con 100 ml PBS 1X.
3. Rimuovere 1x PBS mediante pipetta e incubare cellule in 250 microlitri soluzione RS colorazione per 45 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Una volta che il Fluo-4, AM entra nella cellula, l'estere AM viene scisso dalle esterasi cellulari. Incubazione a temperatura ambiente inibisce l'attività esterasi, permettendo Fluo-4, AM per inserire i mitocondri.
4. Rimuovere la soluzione RS colorazione dalla pipetta e lavare le cellule in 100 ml di Ca ²⁺ libera HBSS per rimuovere l'eccesso Fluo-4, AM e TMRM.
5. Preparare la soluzione di imaging IM con 25 mg / ml (w / v) digitonina, 200 Nm TMRM e 1 micron tapsigargina in IM.
   NOTA: La concentrazione di digitonina può avere bisogno di essere regolato per garantire che permeabilizzazione della membrana mitocondriale interna non si verifica. Questo può essere determinato empiricamente valutando l'intensitàdel segnale TMRM a differenti concentrazioni di digitonina.
6. Rimuovere il Ca ²⁺ libera HBSS dalla pipetta e aggiungere 300 ml di soluzione di imaging IM alle cellule. Lasciare cellule equilibrare a temperatura ambiente per 10 min. Le cellule sono ora pronti per l'imaging con CaCl ₂ aggiunte.

4. Imaging cellulare

1. Mettere piatto o vetrino camerata con le cellule in soluzione di imaging IM su un microscopio confocale a scansione laser invertito.
2. Utilizzare impostazione laser microscopio per l'eccitazione ed emissione spettri TMRM e Fluo-4. Ad esempio, utilizzare 543 nm He-Ne e 473 linee laser ad argon nm per eccitare rispettivamente TMRM e Fluo-4. Utilizzare una potenza laser basso di circa il 5% di minimizzare una foto-danni alle cellule.
3. Impostare microscopio per eseguire la scansione di immagini ogni 25 secondi. celle di scansione per 10 minuti per stabilire le letture di base per la TMRM e Fluo-4 segnali.
   NOTA: Il segnale Fluo-4 può essere debole o non rilevabile a riposo concent calciorazioni.
4. Aggiungere 3 ml di 40 mM CaCl ₂ soluzione madre direttamente alle cellule in 300 ml di soluzione di imaging IM (una diluizione 1: 100) e mescolare delicatamente con una pipetta. Mettere in pausa la scansione di immagini, mentre l'aggiunta e la miscelazione del CaCl _2, se necessario.
   NOTA: La Ca ²⁺ concentrazione finale libera ioni [Ca ^2+] nella soluzione di imaging IM può essere calcolata utilizzando software come Maxchelator WEBMAXC estesa ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) o chelante ^11. Una descrizione dettagliata di come calcolare il Ca ²⁺ concentrazione finale libera ioni [Ca ^2+] è descritto nella sezione 6 di seguito.
5. Continuare la scansione di immagini per circa 4 minuti, quindi ripetere CaCl ₂ aggiunte ogni 4 minuti fino a quando il TMRM desiderato o Fluo-4 segnali vengono raggiunti, di solito circa 8 a 10 aggiunte.
6. Usando una pipetta, aggiungere una diluizione 1: 100 di 1 mm FCCP (finale concentration di 10 micron) direttamente alle cellule per dissipare ΔΨ _m. celle di immagine per un ulteriore 5 min. L'esperimento è ormai finito.

Analisi 5. Immagine

1. Una volta che l'imaging è completa, determinare l'intensità dei segnali Fluo-4 e TMRM utilizzando software di analisi delle immagini, ad esempio il software ImageJ con il plugin Bio-Formati (scaricare 'bioformats_package.jar' dal http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / e salvarlo nella 'C: Program Files ImageJ plugins' cartella).
2. Aprire il file di immagini (ad esempio un file .oif) in ImageJ. Fare clic sullo strumento di selezione e selezionare una regione di interesse (ROI) che contiene mitocondri. Utilizzare il segnale TMRM iniziale per selezionare il ROI.
3. Apri 'Analizza> Strumenti> ROI Manager', fare clic su 'Add' per includere il ROI selezionata per la misurazione dell'intensità. ROI multipli possono essere selezionati in una singola immagine per la misurazione. Ripetere passaggi precedenti fino a quando tutte ROIs sono stati aggiunti al ROI Manager.
4. Fare clic su 'Altro> Misura Multi', fare in modo che 'Misura tutte le sezioni' sia selezionata e che 'una riga per ogni fetta' non è selezionata, cliccare su 'OK' per ottenere un tavolo di intensità della fluorescenza media dei TMRM e Fluo-4 segnali per ogni ROI in ogni punto.
5. Utilizzare i dati da tutte le ROI per calcolare l'intensità media e deviazione standard per la TMRM e Fluo-4 segnali.

6. Calcolo del Finale libero Ca ²⁺ Ion Concentrazione [Ca ^2+]

1. Il Ca ²⁺ concentrazione di ioni liberi [Ca ^2+] nella soluzione di imaging IM può essere determinata utilizzando software come Maxchelator WEBMAXC estesa ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) o chelante ^11. Ad esempio, impostare le variabili in WEBMAXC prolungato nel modo seguente: Temperatura = 24 ° C, pH = 7.1, ionico forza = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca ²⁺ = 0,0004 M e Mg ²⁺ = 0,0078 M. Questo si traduce in una Ca ²⁺ concentrazione di ioni liberi finale [Ca ^2+] di 62 Nm . Si noti che questi programmi non possono tener conto di tutte le variabili, come ad esempio il reagente purezza, precisione delle misure e determinazione del pH. Il metodo più preciso per determinare la libera Ca ²⁺ concentrazione è quello di utilizzare un elettrodo selettivo Ca ²⁺ calibrato.

Risultati

Abbiamo usato questo protocollo per esaminare gli effetti di una mutazione MT-ND5 sulla capacità dei mitocondri delle cellule 143B per tamponare gli aumenti di calcio ^12. Nell'esempio mostrato qui, le cellule 143B di controllo sono stati caricati con TMRM e Fluo-4, sono davanti a permeabilizzazione con digitonina. Dopo 5 minuti di immagini, otto aggiunte sequenziali di un diluizione 1: 100 di 40 mm esogeni CaCl ₂ sono stati fatti, con la c...

Discussione

Il calcio gioca un ruolo fondamentale in molti processi cellulari, tra cui la contrazione muscolare, la segnalazione neuronale e proliferazione cellulare ^13. Aumento delle concentrazioni di calcio delle cellule sono spesso associati con la domanda di energia, con il calcio in grado di stimolare direttamente fosforilazione ossidativa mitocondriale per aumentare la produzione di ATP ^3. E 'quindi essenziale che abbiamo la capacità di controllare efficacemente l'accum...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641