线粒体钙和线粒体膜的同时测量通过荧光显微镜活细胞的潜在

摘要

线粒体可以利用在其内的膜（Δ _膜电势 ）的电化学势螯合钙（Ca ^2+），允许它们塑造细胞内的Ca ²⁺的细胞内信号传导。我们描述了使用荧光染料和共聚焦显微镜同时测量线粒体的Ca ²⁺摄取和ΔΨ _微米活细胞的方法。

摘要

除了在产生的ATP其重要作用，线粒体还充当本地钙（Ca ^2+）缓冲器，以紧密地调节细胞内Ca ²⁺浓度。要做到这一点，线粒体利用电化学势在其内膜（ΔΨ _米 ）隔离^的 Ca ^{2+。 的} Ca ²⁺的流入线粒体刺激三羧酸循环三个限速脱氢酶，通过氧化磷酸化（OXPHOS）配合增加的电子转移。这种刺激保持ΔΨ _男 ，作为正钙离子越过线粒体内膜进入线粒体基质被暂时消散。

我们在这里描述了使用共聚焦显微镜同时测量线粒体的Ca ²⁺摄取和ΔΨ _微米活细胞的方法。由透化细胞，线粒体^的 Ca ²⁺能使用荧光^钙指示剂的Fluo-4，AM被测定，与使用荧光染料四甲（TMRM）ΔΨ _男 ，甲酯，高氯酸盐测量。本系统的好处是，有荧光染料之间很少光谱重叠，使线粒体的Ca精确测量²⁺和ΔΨ _米同时。使用顺序除^钙等分，线粒体^钙的摄取可以被监控，并在其中^钙诱导线粒体膜通透性过渡和ΔΨ的损失浓度_中号决定。

引言

线粒体通过充当本地^的 Ca ²⁺缓冲液¹在调节细胞内Ca ²⁺浓度的一个重要的角色。钙^离子通过^钙单向转运体进入线粒体，通过跨线粒体内膜（ΔΨ _米 ^）2存在电化学梯度驱动的方法。一旦线粒体基质内，钙^离子可通过刺激三羧酸循环³三限速脱氢酶激活氧化磷酸化。这种刺激保持ΔΨ _男 ，作为正钙离子越过线粒体内膜进入线粒体基质被暂时消散。如果线粒体内的Ca ²⁺浓度变得非常高，线粒体通透性转换可以启动，导致ΔΨ _米耗散，cessatio氧化磷酸化的n和细胞死亡的信号传导途径⁴的诱导。

线粒体在细胞中钙的缓冲空间发挥的重要作用，使线粒体钙的准确的监测非常重要。各种方法已被建立并监控线粒体钙，包括使用基于若丹明染料。一个这样的染料，RHOD-2，AM是在分区到线粒体相当有效测量线粒体^的 Ca ²⁺水平^5,6。然而，必须注意用作某些染料将在其他细胞器，如脂质体的积累，或保留在细胞胞质溶胶。然而，下游分析可被用来从那些从线粒体⁷区分这些信号。

监测线粒体钙另一种技术利用荧光记者构造⁸ 了>。这些基因编码的探针的好处是，它们可以通过使用内源性N-末端肽，例如人COX VIII亚基的N-末端的定位信号进行具体靶向线粒体。该系统已被用来产生已经证明了线粒体调查钙信号⁹是非常有用的线粒体靶向探针水母发光蛋白。这些基因编码的探针的主要缺点是，它们需要被引入到由瞬时表达的细胞（其是不适合某些细胞类型可行，并且能够产生不同的结果），或者通过创建稳定表达系统（这是耗时）。

为了规避上述问题，我们已经开发出一种新的协议，同时测量线粒体^钙和ΔΨ _米此协议是基于添加了外源钙到透化的细胞一前述方法S ="外部参照"> 10。我们的协议比其他方法三大优势:首先，我们使用荧光- 4，AM和TMRM监测线粒体^钙和_ΔΨm，即具有非常独特的光谱特性两种染料;其次，将细胞透化，以使的Fluo-4信号仅检测线粒体的Ca ²⁺和不^钙定位于其它细胞器或细胞胞质溶胶;第三，使用的Fluo-4的检测线粒体^的 Ca ²⁺允许快速和简单的细胞染色，否定存在如果使用遗传编码的探针的任何细胞转染或转化的问题。

研究方案

1.细胞的制备

1. 生长10 1cm池培养皿的细胞或75cm ²的烧瓶中补充有5％（体积/体积）胎牛血清（FBS）和1×青霉素/链霉素（P / S培养基[10毫升Dulbecco氏改良的Eagles培养基（DMEM）中）]，在37℃/ 5％CO _2。
2. 收获细胞，通过抽吸除去培养基，然后用5ml 1×磷酸盐缓冲盐水（1×PBS）洗涤。通过抽吸除去1×PBS中，然后加入1.5毫升0.25％（重量/体积）胰蛋白酶/ 0.25％（重量/体积）乙二胺四乙酸（EDTA），并在37℃/ 5％CO ₂孵育2分钟。点击菜或烧瓶轻轻除去细胞，然后悬浮在5毫升培养基。
3. 加入12微升悬浮细胞到血细胞计数器的细胞。
4. 板块细胞菜肴或共焦成像腔盖玻片。
   注意:这些将有一个合适的塑料或玻璃底已设计用于倒置显微镜的使用。
5. 板细胞，使日在〜80％汇合上成像的天来实现。例如，大约2×10 ^4个 143B骨肉瘤细胞可以接种到成像之前的8孔腔室载玻片一天一个阱。
6. 孵育细胞过夜，在37℃/ 5％CO _2，以允许细胞附着和恢复。

2.缓冲器，用于TMRM和荧光 - 4数字影像

1. 制备含有156 mM氯化钠，3毫米氯化钾，2mM的_硫酸镁 ，记录溶液（RS） - 1.25毫KH ₂ PO _4，10mM的D-葡萄糖，2mM的_氯化钙和10mM的HEPES pH值7.35。 RS储存在-20ºC等分。
2. 制备细胞内中等（IM）含有6毫摩尔NaCl，130毫摩尔的KCl，7.8毫的MgCl _2，1mM的KH ₂ PO _4，0.4mM的_氯化钙 ，2毫EGTA，10mM的HEDTA，2毫苹果酸盐，2mM的谷氨酸，2毫ADP和20mM HEPES pH值7.1。苹果酸盐，谷氨酸盐和ADP的的200mM储备溶液可以单独制备，等分并储存在-20℃。这些STocks可以只使用前加入到IM。
3. 从商业供应商^的 Ca ²⁺游离Hank氏缓冲盐溶液（HBSS）中，可以得到的预制备。添加乙二醇 - 双（β氨基乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA），以500μM的最终浓度。
4. 制备在100％甲醇的10mM四甲甲酯，高氯酸根（TMRM）的贮备溶液。从这种股票使2μm的工作原液在蒸馏水H ₂ O
5. 制备的10mM维拉帕米在100％乙醇中的储备溶液。
6. 制备为1mg / ml（重量/体积）的二甲亚砜（DMSO）的Fluo-4乙酰氧基甲基酯（的Fluo-4，AM）的储备溶液。
   注:荧光- 4，AM是在结合钙^离子表现出增加的荧光钙指标。的Fluo-4是FLUO-3的类似物，由氟取代的两个氯取代基。这导致在488纳米增加的荧光激发和更高的荧光信号水平。该AM酯基团产生的是能够渗透细胞膜不带电的荧光 - 4分子。一旦进入细胞内，在AM酯通过非特异性酯酶裂解，导致在被截留在细胞内的Fluo-4的充电形式。
7. 制备在100％乙醇1mM的羰基氰化物对 - trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）的贮备溶液。
8. 制备的25毫克/毫升的蒸馏水H ₂ O储备溶液（重量/体积）毛地黄皂苷
9. 制备100μM的毒胡萝卜素的DMSO储备溶液。
10. 在蒸馏H ₂ O制备的40毫氯化钙（氯化钙_2）的储备溶液

3. TMRM和荧光 - 4，AM细胞染色

1. 用20nM的TMRM制备RS染色溶液，5微克/毫升（重量/体积）的Fluo-4，AM和0.005％表面活性剂，如尼克F-127的RS。
   注:这种表面活性剂是一种非离子型多元醇，其促进的Fluo-4，AM的溶解。注:也可加入10μM的维拉帕米到INHIBI吨TMRM出口通过质膜药转运如果它是在细胞类型中表达所分析。
2. 通过吸移管除去从细胞培养基，并用100微升1×PBS洗涤。
3. 通过吸移管除去1×PBS中并孵育在250微升的RS染色溶液的细胞在室温下45分钟。
   注意:一旦的Fluo-4，AM进入细胞中，AM酯通过蜂窝酯酶裂解。在室温下温育抑制酯酶的活性，允许的Fluo-4，AM进入线粒体。
4. 通过吸移管除去RS染色液和洗涤细胞在100μl ^的 Ca ²⁺的HBSS以除去过量的Fluo-4，AM和TMRM。
5. 用25微克/毫升制备的IM成像溶液（重量/体积）毛地黄皂苷，200nM的TMRM和在IM1μM的毒胡萝卜素。
   注:毛地黄皂苷的浓度可能需要进行调整，以确保线粒体内膜不会发生的那透。这可凭经验通过评估强度来确定在不同浓度的毛地黄皂苷的TMRM信号。
6. 用移液管除去^的 Ca ²⁺的HBSS，并添加300微升的IM成像溶液到细胞中。离开细胞在室温下平衡10分钟。细胞现在已经准备好与_氯化钙补充成像。

4.细胞成像

1. 将菜或在IM成像解决方案细胞腔盖玻片上倒置激光扫描共聚焦显微镜。
2. 使用显微镜激光器TMRM和的Fluo-4的激发和发射光谱的设置。例如，使用543纳米的氦氖和473纳米的氩激光线分别以激发TMRM和的Fluo-4。使用大约5％的低激光功率，以最小化对细胞的任何光损伤。
3. 设置显微镜扫描图像每25秒。扫描单元10分钟以建立用于TMRM和的Fluo-4的信号的基线读数。
   注:荧光 - 4的信号可能是在静息钙concent微弱或无法检测口粮。
4. 加入3微升的40mM的CaCl ₂储备溶液直接向细胞中加入300μl的IM成像溶液（1:100稀释），并用移液管轻轻混匀。暂停图像扫描同时加入，如果需要混合的CaCl _2。
   注:最终的游离钙^离子浓度的离子钙^离子浓度在IM成像解决方案可以使用软件进行计算，如Maxchelator WEBMAXC扩展（ http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ）或螯合剂^11。如何计算最终的游离钙^离子离子浓度的详细描述钙^离子浓度在下面第6条所述。
5. 持续约4分钟图像扫描，然后重复_氯化钙增加每4分钟，直到所需的TMRM或荧光- 4信号到达，通常在8到10加法。
6. 使用吸管，加入1:100稀释1 mM的FCCP的（决赛Concentration 10μM）直接向细胞消散ΔΨ _微米 。图像细胞再5分钟。实验已经结束。

5.图像分析

1. 一旦成像完成后，确定使用图像分析软件的Fluo-4和TMRM信号的强度，对于具有生物格式的插件（下载'bioformats_package.jar"从http://downloads.openmicroscopy.org/bio例如ImageJ的软件 - 格式/并将其保存在"C: Program Files文件的ImageJ 插件"文件夹）。
2. 打开ImageJ的影像文件（例如一个.oif文件）。点击选择工具，并选择感兴趣区域（ROI）的区域包含线粒体。使用初始TMRM信号来选择投资回报率。
3. 打开"分析>工具>投资回报率经理"，单击"添加"，以包括强度测量选定的投资回报率。多个ROI可以测量单个图像上进行选择。重复上述步骤，直到所有的投资回报率■找被添加到的ROI管理器。
4. 点击"更多>多措施"，确保"衡量所有切片"被选中，那是一排每片"被选中，然后点击"确定"，以获得TMRM和荧光 - 4信号的平均荧光强度的表在每个时间点每个ROI。
5. 从所有ROI使用数据来计算用于TMRM和的Fluo-4的信号的平均强度和标准偏差。

6.计算最终游离钙^离子离子浓度钙^离子浓度

1. 游离^钙离子浓度的[Ca ^2+]在IM成像解决方案可以使用软件，如Maxchelator WEBMAXC扩展（待定http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ）或螯合剂^11。例如，设置WEBMAXC变量EXTENDED如下:温度= 24℃，pH值为7。1，离子强度= 0.162，EGTA = 0.002男，HEDTA = 0.01男， ^钙 = 0.0004 M和镁^离子 = 0.0078 M.这将导致最终的游离钙^离子浓度的离子钙^离子浓度 62纳米。请注意，这些程序可以不考虑每一个变量，如试剂的纯度，测量和pH测定精度。用于确定游离Ca ²⁺浓度的最准确的方法是使用经过校准的^钙选择性电极。

结果

我们已经使用该协议来检查上143B细胞线粒体的钙¹²缓冲的增加的能力的MT-ND5突变的影响。在这里所示的例子中，控制143B细胞加载TMRM和的Fluo-4，用毛地黄皂苷透化之前AM。 5分钟成像之后，一个1的8个连续的增补:100稀释的40毫摩尔外源性的CaCl ₂被做了，与最终游离Ca ²⁺离子浓度计算^[2+钙。

讨论

钙起着在许多细胞过程，包括肌肉收缩，神经元信号传导和细胞增殖¹³的关键作用。在细胞钙离子浓度的增加往往与能源需求有关，与钙能直接刺激线粒体氧化磷酸化，以提高ATP生成^3。因此，重要的是，我们必须有效地监测线粒体钙累积，并且能够以比较如何这个功能是由遗传因素和药剂的影响的能力。

该协议中的关键步骤

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin/0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641