Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente

Resumen

Las mitocondrias pueden utilizar el potencial electroquímico a través de su membrana interna (Δ _Ψm) para secuestrar calcio (Ca2 ^+), lo que les permite dar forma Ca ²⁺ citosólico de señalización dentro de la célula. Se describe un método para medir simultáneamente las mitocondrias Ca ²⁺ absorción y ΔΨ _m en células vivas utilizando colorantes fluorescentes y microscopía confocal.

Resumen

Aparte de su papel esencial en la generación de ATP, las mitocondrias también actúan como amortiguadores de calcio locales para regular fuertemente la concentración intracelular ^de Ca2 ⁺ (Ca2 ^+). Para hacer esto, mitocondrias utilizan el potencial electroquímico a través de su membrana interna (ΔΨ _m) para secuestrar Ca ^{2 +.} La afluencia de Ca2 ⁺ en la mitocondria estimula tres deshidrogenasas que limitan la velocidad del ciclo del ácido cítrico, el aumento de la transferencia de electrones a través de la fosforilación oxidativa (fosforilación oxidativa) complejos. Esta estimulación mantiene ΔΨ _m, que se disipa temporalmente como los iones de calcio positivos cruzar la membrana interna mitocondrial en la matriz mitocondrial.

Se describe aquí un método para medir simultáneamente las mitocondrias Ca ²⁺ absorción y ΔΨ _m en células vivas mediante microscopía confocal. Por permeabilización de las células, Ca ^{2 +} mitocondrial puedemedirse utilizando el Ca ^{2 +} indicador fluorescente Fluo-4 AM, con la medición de ΔΨ _m usando el colorante fluorescente tetrametilrodamina, éster metílico, el perclorato (TMRM). El beneficio de este sistema es que hay muy poco solapamiento espectral entre los colorantes fluorescentes, lo que permite una medición precisa de Ca ^{2 +} mitocondrial y ΔΨ _m simultáneamente. Uso de la adición secuencial de Ca ²⁺ alícuotas, Ca ^{2 +} mitocondrial captación pueden ser monitoreados, y la concentración a la que Ca2 ⁺ induce la transición de la permeabilidad de la membrana mitocondrial y la pérdida de ΔΨ _m determinado.

Introducción

Las mitocondrias juegan un papel importante en la regulación de la concentración intracelular de Ca2 ^+, actuando como locales Ca ^{2 +} buffers ^1. Ca ²⁺ entra en la mitocondria a través de la uniporter Ca2 ^+, un proceso impulsado por el gradiente electroquímico que existe a través de la membrana interna mitocondrial (ΔΨ _m) ^2. Una vez dentro de la matriz mitocondrial, Ca ²⁺ puede activar la fosforilación oxidativa mediante la estimulación de tres deshidrogenasas limitantes de la velocidad del ciclo del ácido cítrico ^3. Esta estimulación mantiene ΔΨ _m, que se disipa temporalmente como los iones de calcio positivos cruzar la membrana interna mitocondrial en la matriz mitocondrial. Si la concentración ^{de Ca2 +} dentro de las mitocondrias se vuelve muy alta, la transición de permeabilidad mitocondrial puede ser iniciado, dando lugar a la disipación de ΔΨ _m, la cessation de la fosforilación oxidativa y la inducción de la muerte celular vías ⁴ de señalización.

El importante papel que las mitocondrias desempeñan en el búfer espacial de calcio celular hace que la supervisión precisa de calcio mitocondrial crítica. Se han establecido varios métodos para controlar de calcio mitocondrial, incluyendo el uso de colorantes a base de rodamina. Uno de estos colorantes, Rhod-2, AM, es muy eficaz en la partición a la mitocondria para medir los niveles ^{de Ca2 +} mitocondrial ^{5, 6.} Sin embargo, se debe tener cuidado ya que algunos de colorante se acumulará en otros orgánulos, tales como liposomas, o permanecer en el citosol de la célula. Sin embargo, los análisis posteriores se pueden emplear para distinguir estas señales a los de la mitocondria ^7.

Otra técnica para controlar de calcio mitocondrial utiliza reportero fluorescente construye ⁸ arriba>. El beneficio de estas sondas codificados genéticamente es que pueden ser dirigidos específicamente a la mitocondria mediante el uso de péptidos endógenos N-terminal, por ejemplo, la señal de direccionamiento N-terminal de la subunidad VIII de la COX humano. Este sistema se ha empleado para generar una sonda aequorina mitocondrial de orientación que ha demostrado ser extremadamente útil para la investigación mitocondrial de señalización ⁹ de calcio. El principal inconveniente de estas sondas codificados genéticamente es que necesitan para ser introducido en las células por la expresión transitoria (que no es factible para ciertos tipos de células y pueden producir resultados variables) o mediante la creación de sistemas de expresión estables (que está consumiendo tiempo).

Para evitar los problemas descritos anteriormente, hemos desarrollado un nuevo protocolo para medir mitocondrial ^de Ca2 ⁺ y ΔΨ _m simultáneamente. Este protocolo se basa en un método descrito previamente que añade calcio exógeno a células permeabilizadass = "xref"> 10. Nuestro protocolo tiene tres ventajas principales con respecto a otros métodos: en primer lugar, utilizamos Fluo-4 AM y TMRM para supervisar Ca ^{2 +} mitocondrial y ΔΨ _m, dos colorantes que tienen propiedades espectrales muy distintas; En segundo lugar, las células se permeabilizaron de modo que la señal de Fluo-4 solamente está detectando mitocondrial Ca ^{2 +} y Ca2 ⁺ no localiza en otros orgánulos o el citosol de la célula; y en tercer lugar, el uso de Fluo-4 para detectar Ca ^{2 +} mitocondrial permite la tinción celular rápido y simple, anulando cualquier problema de transfección de células o de transformación que existen si el uso de sondas codificados genéticamente.

Protocolo

1. Preparación de las células

1. Se cultivan las células en 10 cm placas de cultivo celular o 75 cm ² frascos en medios de cultivo [10 ml de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 5% (v / v) de suero bovino fetal (FBS) y 1 x penicilina / estreptomicina (p / s )] a 37 ° C / 5% de CO _2.
2. Para cosechar las células, retirar el medio por aspiración, luego se lava con 5 ml de 1x tampón fosfato salino (PBS 1x). Eliminar 1x PBS por aspiración, a continuación, añadir 1,5 ml 0,25% (w / v) de tripsina / 0,25% (w / v) de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se incuba a 37 ° C / 5% de _CO2 durante 2 min. Toque plato o frasco suavemente para eliminar las células, a continuación, volver a suspender en medios de cultivo de 5 ml.
3. Recuento de células mediante la adición de 12 l de células resuspendidas en un hemocitómetro.
4. células de la placa en platos o cubreobjetos con cámaras de imagen confocal.
   NOTA: Estos tendrán un fondo de plástico o vidrio adecuado que ha sido diseñado para su uso con microscopios invertidos.
5. células de la placa por lo THen ~ se consigue 80% de confluencia en el día de obtención de imágenes. Por ejemplo, aproximadamente 2 x 10 ⁴ células de osteosarcoma 143B se pueden sembrar en un pocillo de una una jornada de 8 así porta con cámara antes de exponer.
6. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C / 5% de CO ₂ para permitir que las células se unan y se recuperan.

2. Tampones para TMRM y Fluo-4 Imaging

1. Preparar la solución de registro (RS) que contiene NaCl 156 mM, KCl 3 mM, 2 mM MgSO _4, 1,25 mM KH ₂ PO _4, 10 mM D-glucosa, 2 mM CaCl ₂ y HEPES 10 mM pH 7,35. RS almacenar en alícuotas a -20 ºC.
2. Preparar intracelular Medio (IM) que contiene NaCl 6 mM, KCl 130 mM, 7,8 mM MgCl _2, mM KH ₂ PO _4, 0,4 mM CaCl _2, EGTA 2 mM, mM HEDTA 10, malato 2 mM, glutamato 1 mM 2, 2 mM ADP y HEPES 20 mM pH 7,1. 200 mM de soluciones stock de malato, glutamato y ADP se pueden preparar por separado, en alícuotas y se almacenaron a -20 ° C. estos stocks se pueden añadir a la IM justo antes del uso.
3. Ca solución de sal tamponada ²⁺ libre de Hank (HBSS) se puede obtener pre-preparado a partir de proveedores comerciales. Añadir ácido etilenglicol-bis (éter de β-aminoetil) -N, N, N ', N'-tetraacético (EGTA) a una concentración final de 500 mM.
4. Preparar una solución madre de 10 mM tetrametilrodamina, éster de metilo, perclorato (TMRM) en 100% de metanol. De esta población, hacer una reserva de trabajo de 2 M en _H2O destilada
5. Preparar una solución madre de verapamilo 10 mM en 100% de etanol.
6. Preparar un 1 mg / ml (p / v) solución madre de éster Fluo-4 acetoximetil (Fluo-4 AM) en dimetilsulfóxido (DMSO).
   NOTA: Fluo-4 AM es un indicador de calcio que presenta una mayor fluorescencia tras la unión a Ca2 ^+. Fluo-4 es un análogo de fluo-3, con los dos sustituyentes de cloro reemplazado por átomos de flúor. Esto da como resultado un aumento de la excitación de fluorescencia a 488 nm y los niveles de señal de fluorescencia más altas. losgrupo éster AM resulta en una molécula sin carga Fluo-4 que puede penetrar en las membranas celulares. Una vez dentro de la célula, el éster AM se escinde por las esterasas no específicas, lo que resulta en una forma cargada de Fluo-4 que está atrapado dentro de la célula.
7. Preparar una solución madre de 1 mM carbonil cianuro de p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) en 100% de etanol.
8. Preparar una solución madre de 25 mg / ml (w / v) de digitonina en _H2O destilada
9. Preparar una solución madre de 100 thapsigargin mu M en DMSO.
10. Preparar una solución madre de cloruro de calcio 40 mM (CaCl ₂₎ en _H2O destilada

3. La tinción de células con TMRM y Fluo-4, AM

1. Preparar la solución RS tinción con 20 nM TMRM, 5 g / ml (w / v) Fluo-4, AM y 0,005% de tensioactivo tal como Pluronic F-127 en RS.
   NOTA: Este tensioactivo es un poliol no iónico que facilita la solubilización de Fluo-4, AM. Nota: 10 M verapamilo también se puede añadir a inhibit TMRM exportación por el transportador de múltiples fármacos membrana plasmática si se expresa en el tipo celular que se está analizando.
2. Retire el medio de cultivo de células con una pipeta y se lava con 100 l de PBS 1x.
3. Eliminar 1x PBS mediante una pipeta y se incuba células en solución de tinción RS 250 l durante 45 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Una vez que el Fluo-4, AM entra en la célula, el éster AM se escinde por esterasas celulares. Incubando a temperatura ambiente inhibe la actividad de esterasa, permitiendo Fluo-4, AM para entrar en la mitocondria.
4. Retire la solución RS tinción mediante una pipeta y lavar las células en 100 l ^de Ca2 ⁺ libre de HBSS para eliminar el exceso de Fluo-4 AM y TMRM.
5. Preparar solución de imagen IM con 25 g / ml de digitonina (v / w), 200 nM y 1 TMRM thapsigargin mu M en IM.
   NOTA: puede ser necesario ajustar para asegurar que la permeabilización de la membrana interna mitocondrial no se produce la concentración de digitonina. Esto se puede determinar empíricamente mediante la evaluación de la intensidadde la señal de TMRM a diferentes concentraciones de digitonina.
6. Retire el Ca2 ⁺ libre de HBSS mediante una pipeta y añadir 300 l de solución de imagen IM a las células. Deja células que se equilibre a temperatura ambiente durante 10 min. Las células están listas para imágenes con CaCl ₂ adiciones.

4. Cell Imaging

1. Introducir la cápsula o cubreobjetos cámaras con células en solución de imágenes IM en un microscopio confocal de barrido láser invertida.
2. Utilice el ajuste de los láseres microscopio para detectar la excitación y espectros de emisión de TMRM y Fluo-4. Por ejemplo, utilice 543 nm de He-Ne y 473 líneas de láser de argón nm para excitar TMRM y Fluo-4, respectivamente. Utilice una fuente de láser de baja de aproximadamente 5% para reducir al mínimo cualquier foto-daño a las células.
3. Establecer microscopio para escanear imágenes cada 25 segundos. escaneo de células durante 10 minutos para establecer lecturas de referencia para el Fluo-4 señales y TMRM.
   NOTA: La señal de Fluo-4 puede ser débil o indetectable en la que descansa concent calcioraciones.
4. Añadir 3 l de CaCl ₂ solución madre 40 mM directamente a las células en 300 l de solución de imágenes IM (una dilución 1: 100) y se mezcla suavemente con una pipeta. Una pausa en la exploración de la imagen, mientras que la adición y mezcla del _CaCl2 si es necesario.
   NOTA: La concentración de iones Ca2 ⁺ libre final [Ca ^{2 +]} en la solución de imagen IM puede calcularse utilizando software como Maxchelator WEBMAXC EXTENDIDO ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) o quelante ^11. Una descripción detallada de cómo calcular la concentración de iones Ca2 ⁺ libre final ^de [Ca2 ^+] se describe en la sección 6 a continuación.
5. Continuar escaneado de imágenes por aproximadamente 4 minutos, y luego repetir CaCl ₂ adiciones cada 4 minutos hasta que la TMRM deseado o Fluo-4 señales se alcanzan, por lo general alrededor de 8 a 10 adiciones.
6. Con una pipeta, añadir una dilución 1: 100 de FCCP 1 mM (c definitivaoncentración de 10 mM) directamente a las células para disipar ΔΨ _m. celdas de imagen para otros 5 minutos. El experimento ha finalizado.

Análisis 5. Imagen

1. Una vez que se haya completado la imagen, determinar la intensidad de las señales de Fluo-4 y TMRM utilizando el software de análisis de imágenes, por ejemplo, software ImageJ con el plugin Bio-formatos (Descargar 'bioformats_package.jar' de http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / y guardarlo en el "C: archivos de programa ImageJ plugins 'carpeta).
2. Abra el archivo de imagen (por ejemplo, un archivo de .oif) en ImageJ. Haga clic en la herramienta de selección y seleccionar una región de interés (ROI) que contiene mitocondrias. Utilice la señal de TMRM inicial para seleccionar el retorno de la inversión.
3. Abrir 'Análisis> Herramientas> Administrador de retorno de la inversión ", haga clic en Añadir para incluir el ROI seleccionada para la medición de la intensidad. Varias regiones de interés pueden ser seleccionados en una sola imagen para la medición. Repita los pasos anteriores hasta que todos ROIs se han agregado al Administrador de retorno de la inversión.
4. Haga clic en "Más> Medida de múltiples ', asegúrese de que« medida de todas las divisiones' se selecciona y que 'una fila por rebanada' no está seleccionada, haga clic en 'Aceptar' para obtener una tabla de intensidad de fluorescencia media de las TMRM y Fluo-4 señales para cada ROI en cada punto de tiempo.
5. Utilizar los datos de todas las regiones de interés para calcular las intensidades promedio y desviación estándar para la TMRM y Fluo-4 señales.

6. Cálculo de la Concentración final libre de iones Ca2 ⁺ [Ca2 ^+]

1. La concentración de iones Ca2 ⁺ libre de [Ca ^{2 +]} en la solución de imagen IM puede determinarse utilizando software como Maxchelator WEBMAXC EXTENDIDO ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) o quelante ^11. Por ejemplo, establecer las variables en WEBMAXC amplía del modo siguiente: Temperatura = 24 ° C, pH = 7.1, La fuerza iónica = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca ²⁺ = 0,0004 M y Mg ²⁺ = 0,0078 M. Esto resulta en una concentración de iones ^de Ca2 ⁺ libre final ^de [Ca2 ^+] de 62 nM . Tenga en cuenta que estos programas no pueden tener en cuenta todas las variables, tales como la pureza del reactivo, la precisión de las mediciones y la determinación del pH. El método más preciso para determinar la concentración ^de Ca2 ⁺ libre es el uso de un electrodo selectivo de Ca ²⁺ calibrada.

Resultados

Hemos utilizado este protocolo para examinar los efectos de una mutación de MT-ND5 en la capacidad de las mitocondrias de células 143B para amortiguar los aumentos en el calcio ^12. En el ejemplo que se muestra aquí, las células 143B de control se cargaron con TMRM y Fluo-4 AM antes de permeabilización con digitonina. Después de 5 min de formación de imágenes, ocho adiciones secuenciales de un 1: se hicieron dilución 100 de 40 mM CaCl ₂...

Discusión

El calcio juega un papel fundamental en muchos procesos celulares, incluyendo la contracción muscular, la señalización neuronal y la proliferación celular ^13. Los aumentos en las concentraciones de calcio de células se asocian a menudo con la demanda de energía, con el calcio capaz de estimular directamente la fosforilación oxidativa mitocondrial para aumentar la generación de ATP ^3. Por tanto, es esencial que tengamos la capacidad de controlar con eficacia la acum...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641