ייצור של חלקיקי מתכת על ידי פעימה לייזר ablation בנוזלים: כלי לחקר מאפיינים אנטיבקטריאליים של חלקיקים

Summary

תכונות מיקרוביאלית של מתכות כגון נחושת וכסף הוכרו במשך מאות שנים. פרוטוקול זה מתאר פעימה לייזר ablation בנוזלים, שיטה של ​​סינתיזה חלקיקי מתכת המספק את היכולת לכוונן את המאפיינים של חלקיקים אלה כדי למטב את ההשפעות האנטי מיקרוביאלית שלהם.

Abstract

הופעתה של חיידקים עמידים בפני ריבוי מחלות היא דאגה קלינית עולמית המוליכה חלק מהשערה על החזרתנו לעידן "טרום אנטיביוטיקה" של הרפואה. בנוסף למאמצים לזהות תרופות מולקולות קטנות מולקולות קטנות, יש כבר עניין רב בשימוש חלקיקי מתכת כמו ציפויים עבור מכשירים רפואיים, תחבושות הפצע, ואריזת הצרכן, בשל תכונות מיקרוביאלית שלהם. מגוון רחב של שיטות זמין עבור סינתזה nanoparticle תוצאות בספקטרום רחב של תכונות כימיות ופיזיות אשר יכול להשפיע על יעילות אנטיבקטריאלית. כתב יד זה מתאר את פעימה לייזר ablation בנוזל (PLAL) שיטה כדי ליצור חלקיקים. גישה זו מאפשרת כוונון עדין של גודל nanoparticle, הרכב, ויציבות באמצעות שיטות שלאחר הקרנה, כמו גם תוספת של פעילי שטח או הרחקות נפח. על ידי שליטה בגודל החלקיקים ואת הרכב, מגוון רחב של תכונות פיסיקליות וכימיות של nanopa מתכתRtics ניתן לחקור אשר עשויים לתרום יעילות מיקרוביאלית שלהם ובכך פותחים אפיקים חדשים לפיתוח אנטיבקטריאלי.

Introduction

Nanoparticles (NPs) מוגדרים בדרך כלל כמו חלקיקים שיש להם לפחות ממד אחד כי הוא פחות מ -100 ננומטר אורך. שיטות כימית מסורתיות NP סינתזה בדרך כלל דורשים סוכני הפחתת מסוכנים, כגון borohydrides ו hydrazines. לעומת זאת, לייזר אבלציה של מטרות מתכת מוצק שקוע במדיום נוזלי (פולס לייזר ablation בנוזלים - PLAL) מספק נתיב ידידותי לסביבה עבור סינתזה NP אשר עונה על כל 12 של עקרונות הכימיה הירוקה ^{1 , 2} . ב PLAL, יעד מתכת שקוע הוא מוקרן על ידי פעימות לייזר חוזרים. כמו לייזר ablates את היעד, פלומה צפופה של אשכולות אדי אטומי הוא שוחרר לתוך המדיום הנוזלי שבו NPs במהירות coalesce. NPs המיוצרים על ידי PLAL הם מפוזרים היטב במדיום מימי ואת גודל, polydispersity, ואת ההרכב של NPs ניתן לשלוט בקלות על ידי שינוי נוזל אבלציה מימית כמו גם לייזרAmeters ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} .

מאפיינים Nanoparticle יכול להיות מכוון על ידי התאמת מספר פרמטרים לייזר, כולל: גל, גל, אורך הדופק (נסקרו בהתייחסות ⁷ ). פלואורס לייזר מחושב כאנרגיה הדופק חלקי שטח של נקודה לייזר על פני היעד. ההשפעות המדויקות של שטף על גודל polydispersity של NPs הם קצת שנויים במחלוקת. ככלל, הוכח כי במערכות לייזר פועלות "ארוכות" ו"מעטות " ^{, יש} משטרים נמוכים וגבוהים, המייצרים מגמות שליליות וחיוביות, בהתאמה ^{, 8 , 9 , 10 , 11} . גודל NPOns ניתן למדוד אמפירי באמצעות טכניקות כגון פיזור אור דינמי ומיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM), כמתואר להלן.

הבחירה של אורך גל לייזר יכולה להשפיע על המנגנונים הפיזיים שבאמצעותם NPs נוצרים. באורכי גל קצרים יותר (אולטרה סגול), פוטונים באנרגיה גבוהה מסוגלים לשבור את הקשרים הבין-אטומיים ¹² . מנגנון זה של אבלציה צילום הוא דוגמה של סינתזה NP מלמעלה למטה כי זה גורם לשחרור של קטעים קטנים במיוחד של חומר אשר נוטים לייצר דגימות polydisperse גדול יותר על מרווה בנוזל צולל ^{12 , 13 , 14} . לעומת זאת, אבלציה ליד אינפרא אדום (λ = 1,064 ננומטר) מניב מנגנון סינתזה מלמטה למעלה הנשלט על ידי אבלציה פלזמה ¹² . ספיגת לייזר על ידי המטרה משחררת אלקטרונים מתנגשים עם, ולאחר מכן בחינם, אלקטרונים מחויב. כגOllisions להגדיל, החומר הוא מיונן, ובכך הצתה פלזמה. הנוזל שמסביב מגביל את הפלסמה, משפר את יציבותה ומגדיל עוד יותר את הקליטה. כמו פלזמה מתרחבת הוא הרווה על ידי נוזל החסימה, NP הם מרוכזים עם גיאומטריות שונות ^{4 , 12 , 15} .

הבחירה של משך הדופק לייזר יכול להשפיע עוד יותר על תהליך היווצרות NP. נפוץ לייזרים ארוכים פעמו, עם משכי הדופק יותר מאשר כמה picosonds, כוללים את כל מילי, מיקרו, ננו וכמה לייזרים פעמו picosond. במשטר רוחב הפולס הזה, משך הדופק של הלייזר ארוך יותר מהזמן של איזון הפלקטרון אלקטרונים, שהוא בדרך כלל בסדר גודל של כמה picoseconds ^{4 , 16 , 17 , 18 , 19}. התוצאה היא דולף של אנרגיה לתוך המדיום אבלציה שמסביב היווצרות של NPs על ידי מנגנונים תרמיים כגון פליטת thermionic, אידוי, רותחים ונמס ^{1 , 20} .

הפעילות האנטיבקטריאלית של NPs מושפעת במידה רבה על ידי גודל החלקיקים ^{21 , 22 , 23 , 24} . כדי להגביר את הפחתת גודל monodispersity, NPs יכול להיות מוקרן בפעם השנייה באמצעות לייזר של אורך גל ליד התהודה פלסמון (SPR) של NP. קרינת לייזר האירוע נספג על ידי NP דרך עירור של SPR. פיצול של NP עשוי להתרחש באמצעות אויד תרמי ^{25 , 26} או קולומב פיצוץ ^{27 , 28} . צילום החידוש מעלההוא הטמפרטורה של NP מעל נקודת ההיתוך, וכתוצאה מכך שפיכת השכבה החיצונית של החלקיקים. הוכח כי הוספת סוכנים כגון polyvinylpyrrolidone (PVP) או נתרן dodecyl סולפט (SDS) לפתרון יכול מאוד לשפר את ההשפעות שלאחר קרינה ⁵ . ההשפעה של תוספת של מומסים שונים תוארו במספר דוחות ^{1 , 4 , 6} . הקלות של מניפולציה של המאפיינים NP ידי PLAL מעניקה שיטה חדשה לפתח מיקרוביאלית חדש NP מבוססי.

Protocol

1. מיקוד לייזר Nanosecond ו מדידת Fluence

1. להרכיב את מכשיר אבלציה על ידי הנחת מוט מערבי מגנטי שלב אבלציה נקבובי בתוך כוס זכוכית 50 מ"ל.
   הערה: שלב אבלציה מורכב קוטר 3.81 ס"מ, 1.6 מ"מ עובי נירוסטה פלטפורמה עם 10 חורים בקוטר 0.65 ס"מ ושש חורים בקוטר 0.50 ס"מ בקדוח בתבנית מאויר באיור 1 . מטרת חורים אלה היא לאפשר לנוזל לנוע על פני היעד, כך שחלקיקי לא צוברים מיד מעל היעד. ערבוב לא מספיק מוביל אינטראקציות מזיקות בין הלייזר לבין חלקיקים שכבר נוצרו. בנוסף, שלושה # 29 (8-32) חורים tapped ממוקמים ליד המערכת של הפלטפורמה כדי לקבל ברגים להגדיר המשמשים הרגליים כדי להרים את הפלטפורמה ולספק מקום לבר מגנטי מערבי ( איור 1 א ).
   1. מניחים את הכוס על מגנטימערבבים את הצלחת ולהגדיר את הצלחת מערבבים על הבמה תרגום XI כדי לאפשר תנועה של המטרה במהלך אבלציה ( איור 1 א ).
2. הגדר את Nd: YAG לייזר לפעול באורך גל בסיסי של 1,064 ננומטר, עם משך הדופק של 5 ns, ואת שיעור חזרת הדופק של 10 הרץ. למדוד את האנרגיה לדופק עם כוח לייזר ומד אנרגיה. האנרגיה הדרושה היא 240-250 mJ.
3. פוקוס את קרן מתחת ליעד על שלב אבלציה באמצעות 250 מ"מ אורך מוקד העדשה מתכנס (NA = 0.05).
   הערה: לקרן הנכנסת יש רדיוס של 4.025 מ"מ וגובה עדשה של 161 מ"מ נדרש כדי להשיג את גודל הנקודה הרצוי. גודל הנקודה האופטימלי נקבע באופן אמפירי. גודל נקודה גדול יותר מנוצל כדי להפחית את ההשפעה של סיכוך על ידי NPs נוכח בפתרון. זה מאוזן עם העובדה כי הגדלת גודל ספוט דורש אנרגיה גבוהה יותר כדי לשמור על נאותות.
4. קביעת גודל נקודה על ידי הצבת יעד מתכת (ראה סעיףN 2) על הבמה ואת ablating עם כמה פעימות לייזר. הצג את המטרה ablated יחד עם שקופית מיקרומטר על מיקרוסקופ אור מצויד במצלמת CCD (מטרת 4X) כדי למדוד את גודל נקודה ( איור 1 א ).
   הערה: עבור המנגנון כאן, מערכת אבלציה תשואות גודל נקודה עם שטח ממוצע של 5.51 מ"מ ² . גודל המקום נשאר בטווח זה עבור כל אבלציה.
5. חישוב fluence על ידי חלוקת האנרגיה הדופק על ידי אזור נקודה. עבור המנגנון כאן, השטף הוא 4.80 J / cm ² .

2. סינתזה של חלקיקי כסף על ידי פעימה לייזר ablation ב נוזלי

1. לשקול יעד כסף שטוח באמצעות microbalance כדי להשיג את המוני מראש אבלציה.
2. לדבוק היעד כסף לשלב נקבובי באמצעות דו צדדית קלטת פחמן. הוסף 40 מ"ל של נוזל אבלציה כדי כוס ( איור 1 א ). הגובה הנוזלי מעל היעד הוא 11 מ"מ.
   הערה: ליקוי אבלציה אופייניUids הם פתרונות מימיים המכילים גם 60 מ"מ SDS או 2 מ"מ PVP כדי לחזק monodispersity.
3. תחת זעזוע מתמיד, להזיז את השלב xy ממונע מבוקרת מחשב בדפוס אליפטי (מימדים: ציר ראשי = 2.09 ס"מ, ציר קטן = 0.956 ס"מ, שטח = 1.57 ס"מ ² ) במהירות של 0.42 ס"מ / s ו ablate היעד עבור 20-40 דקות.
   הערה: ריכוז NPs גדל עם פעמים אבלציה ארוכה יותר. ודא כי ערבוב מספיק נמרץ כדי לשמור על מדים ריכוז NP לאורך הפתרון כדי למזער את ההשפעות סיכוך ⁷ .

3. אפיון חלקיקי מתכת

1. לאסוף את הפתרון nanoparticle מן כוס על ידי decanting. לאשר את נוכחותם של חלקיקים על ידי מדידה ספקטרום האור הנראה שלהם UV (200-1,100 ננומטר).
   הערה: NPs יש ספיגה שיא על פני גל plasmon תהודה (SPR) אורך. עבור כסף, SPR הוא מרוכז ב 400 ננומטר. מרוכז מאוד NPפתרונות דורשים דילול לפני מדידת UV-VIS ספקטרום על מנת להבטיח את ספיגת הקריאות להישאר בטווח ליניארי של ספקטרופוטומטר.
2. למדוד את הקוטר הידרודינמי של NPs על ידי פיזור אור דינמי (DLS) תוך שימוש בשיטת ניתוח הפצה מספר ²⁹ .
   1. לדלל את הפתרון NP 1:40 ב פתרון אבלציה פיפטה 1 מ"ל לתוך קובט 1 ס"מ פלסטיק. ניצול זווית המדידה של 180 מעלות _, למדוד את פיזור האור באורך גל של 633 ננומטר כדי לקבוע את קוטר NP על פי משוואת סטוקס איינשטיין:
      
      כאשר d הוא רדיוס הידרודינמי, k הוא קבוע של בולצמן, T הוא טמפרטורה מוחלטת, η הוא צמיגות, ו D מקדם דיפוזיה translational או מהירות תנועה בראוני.
3. אישור NP גודל וצורה באמצעות אלקטרונים שידור מיקרו(TEM) ³⁰ .
   הערה: הקוטר הידרודינמי הנמדד באמצעות DLS גדול מהגודל הנמדד באמצעות TEM עקב שכבת הממס סביב NP.
   1. לדלל את הפתרון NP 1:40 במים מזוקקים פעמיים כדי להסיר את כל תוספים עודפים ( למשל SDS או PVP) שעלולים להפריע הדמיה. Drop 2 μL של הפתרון על גבי רשת TEM נחושת מראש מצופה בסרט פחמן דק / רזה (זמין מסחרית, לראות את רשימת החומרים) ויבש לילה בטמפרטורת החדר תחת ואקום ב desiccator.
   2. התמונה NPs כדי להעריך את גודל וצורה כמתואר בהתייחסות ³⁰ .
4. כדי לחשב את ריכוז NP, לזרוק כל NPs המצורפת באופן רופף מן המטרה מתכת ablated (שלב 2.3) על ידי הנחת המטרה באמבט מים sonicating המכיל מים מזוקקים במשך 1 דקות.
   1. יבש את היעד תחת זרם של אוויר דחוס במשך 1 דקות. למדוד את המסה של taRget על microbalance. לכמת את המסה של NPs בפתרון כמו ההבדל במשקל לפני ואחרי אבלציה, אשר מניחה להיות תוצאה של פליטה של ​​חלקיקי מתכת לתוך הפתרון.

4. לאחר הקרנה

1. מדולל את NPs לריכוז מקסימלי של 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב פתרון אבלציה אותו בשימוש 2.2. גבול ריכוז זה הוא קריטי כדי להבטיח קרינה אחידה.
2. העברת 15-17 מ"ל של NPs מדולל כדי קובט קוורץ המכיל מוט ומערבבים ( איור 1 ב ). מניחים את קובט על מגש מערבי מגנטי מיושר במקביל עם הלייזר הנכנס.
3. השתמש Nd: YAG לייזר המערכת לייצר 25 PS 532 ננומטר פולסים לייזר ו 75 מ"מ אורך מוקד העדשה להתמקד לייזר במרכז הפתרון. מסננים את הפתרון למשך 30 דקות למספר שעות, בהתאם לגודל הרצוי.
   הערה: האנרגיה הכוללת נמסר תלוי בריכוז של הפתרון tIme של הקרנה והוא יכול לנוע בין 0.5 mJ ל 3.5 mJ. עבור המנגנון כאן, 30 דקות שלאחר הקרנה של מדגם ריכוז שקוף, נמוך (<50 מיקרוגרם / מ"ל) מניב כסף NPs עם קוטר של 10 ננומטר.

5. מדידת תכונות אנטיבקטריאליות של חלקיקים

הערה: הרעילות של NPs כסף נגד שני חיובי גראם ( Bacillus subtilis ) ו- Gram שלילית ( Escherichia coli ) נבדק ³¹ . השיטה מותאמת בקלות לכל מינים; אולם המינון היעיל של חלקיקים עשוי להשתנות במידה ניכרת ויש לקבוע באופן אמפירי. כאן, E. coli משמש כמערכת מודל לתיאור של השיטה.

1. לגדול E. תרבויות coli (זן MG1655) לילה ב 37 ° C ב Luria Broth (LB) המכיל 10 גרם / L Bacto טריפטון, 5 גרם / l תמצית שמרים, 10 גרם / L כלורי נתרן. מדלל את תרבויות הלילה לצפיפות אופטית (λ = 600)ננומטר) של 0.01 ב LB טריים.
2. אם NPs היו מסונתז בתקשורת אבלציה המכילים תוספים ( למשל SDS או PVP), להוסיף את הכימיקל בהתאמה LB כך ריכוז נשאר קבוע עם הוספת NPs.
   הערה: לדוגמה, בניסוי טיפוסי יעד כסף הוא ablated לתוך פתרון 60 מ"מ SDS להניב פתרון 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של NPs. אם הריכוז הסופי של NPs בתקשורת התרבות הוא 10 מיקרוגרם / מ"ל, להכין LB ​​המכיל 6 מ"מ SDS ( כלומר 1/10 ריכוז SDS ב אבלציה נוזל). אין השפעה שלילית על הצמיחה של חיידקים בעת שימוש בריכוזים אלה. זה מוצג בשליטה -AgNP באיור 3 .
3. הוסף את NPs תרבויות מדולל בריכוזים הנעים בין 0-50 מיקרוגרם / מ"ל ​​לגדול תרבויות עם רועד ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות נוספות. בתור שליטה חיובית על רעילות, לטפל E. קולי עם אנטיביוטיקה ( למשל 30 ק"ג מיקרוגרם / מ"לYcin).
4. לאחר הדגירה 2 שעות, לדלל באופן סדרתי את דגימות תרבות 1:10 לתוך LB טרי במקום 10 טיפות μL של דילול כל על גבי צלחות אגר LB. בדרך כלל, 10 ⁴ -10 ⁸ דילולים מתקפלים מספיק כדי לראות מושבות בודדות.
5. לאחר טיפות נקלטו, דגירה צלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו ספירת המושבה להרכיב יחידות (cfu) למחרת בבוקר.

תוצאות

באמצעות מטרות כסף, פרמטרים לייזר המתואר לעיל, ו 60 מ"מ SDS ב נוזל אבלציה, NPs כסף נוצרים עם ספיגה אופיינית UV- VIS ב SPR ( איור 2 א ). מדידות TEM ו- DLS חושפות קוטר NP ממוצע של כ 25 ננומטר לפני שלאחר הקרנה ( איור 2 ב ). אבלציה של היעד כסף ב...

Discussion

השפעות אנטי מיקרוביאליות חוזרות של NP דורשות ייצור עקבי של NPs בגדלים וריכוזים דומים. לכן, זה קריטי כדי לתקנן פרמטרים לייזר כולל גל, גל, אורך הדופק. בעוד פיזור אור דינמי היא שיטה קלה ומהירה להערכת גודל NP, כימות מדויק של התפלגות גודל דורש מדידה ישירה על ידי TEM. כמו כל קרן לי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanosecond Nd:YAG laser	Ekspla	NL303
Motorized xy scanning stage	Standa	8MTF
UV-VIS spectrophotometer	Agilent	Cary 60
Dynamic light scattering unit	Malvern	Zetasizer ZS 90
Microbalance	Maktek	TM 400
Transmission electron microscope	Zeiss	EM 902
Silver foil target	Alfa Aesar	12127
250 mm focal length lens	Edmund Optics	69-624
Copper TEM grids	Pacific Grid-Tech	Cu-400LD	Lacey/thin film coated grid
E. coli MG1655	ATCC	47076
Bacto-tryptone	BD Biosciences	211705
Yeast extract	BD Biosciences	212750
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP3581
Bacto-agar	BD Biosciences	214010
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166-100
Polyvinylpyrrolidone	Fisher Scientific	BP431-100
Stainless steel disc (for ablation stage)	Metal Remnants, Inc.	N/A	1.5 inch diameter, 16 gauge
Beaker	Fisher Scientific	02-540G
Magnetic stir bar	Fisher Scientific	14-513-57
Magnetic stir plate	Fisher Scientific	11-100-49SH
Laser energy and power meter	Coherent	1098579
Carbon tape	Shinto Chemitron Co. Ltd.	STR Tape
Sonicating water bath	Branson	1510
Air compressor	GMC	Syclone 3010	For drying ablation target
75 mm focal length lens	Edmund Optics	34-096	Focusing lens for post-irradiation
Quartz cuvette	Precision Cells Inc	21UV40	50 mm light path (for post-irradiation)
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5
Light microscope	Nikon	50i	This microscope is used to focus the laser on the ablation stage. This particular model is no longer available, but any light microscope with a 4X objective will work.
CCD camera	AmScope	MT5000-CCD
Micrometer slide	Ted Pella	2280-70