액체에서의 펄스 레이저 어블 레이션에 의한 금속 나노 입자의 제조 : 나노 입자의 항균성 연구를위한 도구

요약

구리 및은과 같은 금속의 항균 특성은 수세기 동안 인정되어왔다. 이 프로토콜은 액체의 펄스 레이저 절제 (pulsed laser ablation)를 기술하며,이 나노 입자의 특성을 미세 조정하여 항균 효과를 최적화 할 수있는 금속 나노 입자를 합성하는 방법입니다.

초록

다제 내성 세균의 출현은 전 세계적으로 임상 적으로 우려되고 있으며, 일부 사람들은 '항생제 전 처치'시대로의 복귀를 예상하고 있습니다. 새로운 소분자 항균제를 확인하려는 노력 외에도, 항균 특성으로 인해 의료 기기, 상처 드레싱 및 소비자 패키징 용 코팅제로 금속 나노 입자를 사용하는 데 큰 관심이있었습니다. 나노 입자 합성에 사용할 수있는 다양한 방법은 항균 효과에 영향을 줄 수있는 광범위한 화학적 및 물리적 특성을 나타냅니다. 이 원고는 나노 입자를 만들기위한 액체의 펄스 레이저 절제 (PLAL) 방법을 설명합니다. 이 접근법은 조사 후 방법과 계면 활성제 또는 체적 제외 물의 첨가를 사용하여 나노 입자 크기, 조성 및 안정성을 미세 조정할 수있게합니다. 입자 크기와 조성을 조절함으로써, 금속 nanopa의 물리적 및 화학적 특성의 넓은 범위항균 효과에 기여할 수있는 항생제가 개발 될 수 있으므로 항균제 개발을위한 새로운 길을 열 수 있습니다.

서문

Nanoparticles (NPs)는 일반적으로 길이가 100nm 미만인 하나 이상의 치수를 갖는 입자로 정의됩니다. 전통적인 화학적 NP 합성 방법은 전형적으로 보로 하이드 라이드 및 히드라진과 같은 유해한 환원제를 필요로합니다. 대조적으로, 액체 매질 (액체의 펄스 레이저 절삭 - PLAL)에 잠긴 고체 금속 표적의 레이저 절삭은 녹색 화학 원리 1,2의 모든 12 개를 충족시키는 NP 합성을위한 환경 친화적 인 경로를 제공합니다. PLAL에서, 잠긴 금속 표적은 반복 된 레이저 펄스에 의해 조사된다. 레이저가 타겟을 제거하면, 원자 클러스터 및 증기의 조밀 한 기둥이 NP가 신속하게 합체되는 액체 매질로 방출된다. PLAL에 의해 생성 된 NP는 수성 매질에 미세하게 분산되고, NP의 크기, 다 분산도 및 조성은 수성 제거 액체 및 레이저 파를 변화시킴으로써 용이하게 제어 될 수있다ameters ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} .

나노 입자 특성은 플루 언스, 파장 및 펄스 지속 시간 (참고 자료 ⁷ 에서 검토 됨)을 비롯한 많은 레이저 매개 변수를 조정하여 조정할 수 있습니다. 레이저 플루 언스는 펄스 에너지를 타겟 표면상의 레이저 스폿의 면적으로 나눈 값으로 계산됩니다. NP의 크기와 다분 산성에 미치는 fluence의 정확한 효과는 다소 논란의 여지가있다. 일반적으로 '긴'및 '매우 짧은'펄스 레이저 시스템의 경우 크기가 음수 및 양수로 각각 ^{8 , 9 , 10 , 11} 을 발생하는 낮은 및 높은 플루 언스 영역이 있음이 나타났습니다. NP 크기 분포동적 광산란 및 투과 전자 현미경 (TEM)과 같은 기술을 사용하여 경험적으로 측정 할 수 있습니다.

레이저 파장의 선택은 NP가 형성되는 물리적 메커니즘에 영향을 줄 수 있습니다. 더 짧은 (자외선) 파장에서 고 에너지 광자는 원자 간 결합을 파괴 할 수 있습니다 ¹² . 이 광 절삭 메커니즘은 하향식 NP 합성의 한 예이며, 이는 침지 액체 ^{12 , 13 , 14} 에서 급냉시 더 큰 다 분산 샘플을 생성하는 경향이있는 초소형 물질 조각을 방출하기 때문입니다. 대조적으로, 근적외선 제거 (λ = 1,064 nm)는 플라즈마 제거에 의해 지배되는 상향식 합성 메커니즘을 산출합니다 ¹² . 목표물에 의한 레이저 흡수는 전자와 충돌 해 전자를 자유롭게 만듭니다. C로물질이 이온화되어 플라즈마를 점화시킨다. 주변 액체는 플라즈마를 가두어주고 안정성을 높이며 흡수를 더욱 증가시킵니다 ¹² . 팽창하는 플라즈마가 구속 액체에 의해 급냉됨에 따라, NP는 다양한 기하학적 형상 ^{4 , 12 , 15로} 응축된다.

레이저 펄스 지속 시간의 선택은 NP 형성 과정에 더 영향을 줄 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 긴 펄스 레이저는 펄스 지속 시간이 수 피코 초보다 크며 모든 밀리, 마이크로, 나노 및 일부 피코 초 펄스 레이저를 포함합니다. 이 펄스 폭 영역에서, 레이저 펄스 지속 시간은 전자 - 포논 평형 시간보다 길며, 전형적으로 수 피코 초 ^{4 , 16 , 17 , 18 , 19}. 이것은 열 이온 방출, 기화, 비등 및 용융과 같은 열적 메커니즘에 의해 주변 절제 매질로의 에너지 누출 및 NP의 형성을 초래한다.

NP의 항균 활성은 입자 크기 ^{21 , 22 , 23 , 24} 에 크게 영향을받습니다. 크기 감소 및 단 분산을 향상시키기 위해, NP는 NP의 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 부근의 파장을 갖는 레이저를 사용하여 두 번째로 조사 될 수있다. 입사 된 레이저 복사는 SPR의 여기를 통해 NP에 흡수됩니다. NP의 분열은 열 증발 ^{25 , 26} 또는 쿨롱 폭발 ^{27 , 28} 을 통해 발생할 수 있습니다. photoexcitation은 t를 발생시킵니다.그는 NP의 융점보다 높은 온도로 입자의 외부 층을 흘린다. 폴리 비닐 피 롤리 돈 (PVP)이나 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)와 같은 제제를 용액에 첨가하면 방사선 조사 후 효과를 크게 향상시킬 수 있다는 것이 밝혀졌습니다 ⁵ . 다양한 용질의 첨가의 영향은 여러 보고서 ^{1 , 4 , 6에 기술되어} 있다. PLAL에 의한 NP 특성 조작의 용이성은 새로운 NP 기반 항균제를 개발하는 새로운 방법을 제공합니다.

프로토콜

1. 나노초 레이저 집중 및 Fluence 측정

1. 50 ML 유리 비커 안에 자기 교반 막대와 다공성 절제 단계를 배치하여 절제 장치를 조립.
   참고 : 절삭 단계는 직경 0.65cm의 구멍 10 개와 직경 1cm의 구멍 5 개가있는 3.81cm 직경의 1.6mm 두께의 스테인리스 강 플랫폼과 그림 1 에 나와 있는 패턴으로 뚫린 직경 0.50cm의 구멍으로 구성됩니다. 이 구멍의 목적은 액체가 표적을 가로 질러 움직 이도록하여 입자가 표적 바로 위에 축적되지 않도록하는 것입니다. 불충분 한 혼합은 레이저와 이미 형성된 입자 사이의 유해한 상호 작용을 일으킨다. 또한 3 개의 # 29 (8-32) 탭 구멍이 플랫폼 주변을 감싸고 플랫폼을 들어 올리고 자석 교반 막대를위한 공간을 제공하는 다리 역할을하는 고정 나사를 수용합니다 ( 그림 1A ).
   1. 비커를 자성체에 놓는다.플레이트를 흔들고 제거 플레이트를 xy-translation 스테이지에 놓아 제거 중 타겟을 움직일 수있게합니다 ( 그림 1A ).
2. Nd : YAG 레이저를 기본 파장 1064nm, 펄스 지속 시간 5ns 및 펄스 반복 속도 10Hz로 작동하도록 설정합니다. 레이저 파워와 에너지 미터로 펄스 당 에너지를 측정하십시오. 필요한 에너지는 240-250 mJ입니다.
3. 250 mm 초점 길이 수렴 렌즈 (NA = 0.05)를 사용하여 절제 단계에서 대상 아래에 광선을 집중시킵니다.
   참고 : 들어오는 광선의 반지름은 4.025mm이고 원하는 스폿 크기를 얻으려면 렌즈 높이는 161mm가 필요합니다. 최적의 스폿 크기는 경험적으로 결정됩니다. 용액에 존재하는 NP에 의한 차폐 효과를 줄이기 위해 더 큰 스폿 크기가 사용됩니다. 이것은 스폿 크기를 늘리면 충분한 플루 언스를 유지하기 위해 더 높은 에너지가 필요하다는 사실과 균형을 이룹니다.
4. 금속 타겟을 배치하여 스팟 크기를 결정하십시오 (Sectio 참조).n 2) 스테이지에서 제거하고 여러 레이저 펄스로 제거합니다. 스폿 크기 ( 그림 1A )를 측정하기 위해 CCD 카메라 장착 광학 현미경 (4X 대물 렌즈)에서 마이크로 미터 슬라이드와 함께 절개 대상을 봅니다.
   참고 : 여기 장치의 경우, 절제 시스템은 평균 면적이 5.51mm ² 인 스폿 크기를 산출합니다. 스폿 크기는 각 절제시이 범위로 유지됩니다.
5. 펄스 에너지를 스팟 영역으로 나눔으로써 플루 언스를 계산하십시오. 여기의 장치에서, 플루 언 스는 4.80 J / cm2이다.

2. 액체에서의 펄스 레이저 어블 레이션에 의한은 나노 입자의 합성

1. 사전 절제 질량을 얻기 위해 마이크로 평형을 사용하여 평평한은 표적을 계량하십시오.
2. 양면 탄소 테이프를 사용하여 다공성 스테이지에은 타겟을 부착하십시오. 비커에 절개 액 40 mL를 넣으십시오 ( 그림 1A ). 표적 위의 액체 높이는 11mm입니다.
   참고 : 전형적인 절제 액uids는 단 분산을 강화하기 위해 60 mM SDS 또는 2 mM PVP를 함유 한 수용액입니다.
3. 지속적으로 교반하면서, 컴퓨터 제어 모터 구동 xy 스테이지를 타원형 패턴 (치수 : 장축 = 2.09cm, 부축 = 0.956cm, 면적 = 1.57cm 2)으로 0.42cm / s의 속도로 이동시키고 타겟을 제거합니다 20-40 분 동안.
   참고 : NP의 농도는 더 긴 절삭 시간으로 증가합니다. 차폐 효과를 최소화하기 위해 용액 전체에 걸쳐 NP 농도를 균일하게 유지하려면 충분히 교반해야합니다. ⁷ .

금속 나노 입자의 특성화

1. decanting하여 비커에서 nanoparticle 솔루션을 수집합니다. UV 가시 광선 스펙트럼 (200-1,100 nm)을 측정하여 나노 입자의 존재를 확인하십시오.
   참고 : NP는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 파장에서 최대 흡수를 갖습니다. 실버의 경우, SPR은 400 nm의 중심에 위치합니다. 고농축 NP용액은 흡광도 수치가 분광 광도계의 선형 범위 내에 유지되도록 UV-VIS 스펙트럼을 측정하기 전에 희석해야합니다.
2. 수 분포 분석법 ^{29를 사용} 하여 동적 광 산란 (DLS)을 사용하여 NP의 유체 역학 직경을 측정합니다.
   1. 절제 솔루션에서 NP 솔루션 1:40을 희석하고 1cm 플라스틱 큐벳에 1 ML을 피펫. 180 ° _의 측정 각을 이용하여, 스톡스 - 아인슈타인 (Stokes-Einstein) 방정식에 따라 NP 직경을 결정하기 위해 633nm의 파장에서 광 산란을 측정하십시오.
      
      여기서 d는 유체 역학 반경, k는 볼츠만 상수, T는 절대 온도, η는 점도, 그리고 D는 브라운관 운동의 번역 계수 또는 속도를 나타냅니다.
3. 투과 전자 마이크로를 이용한 NP 사이즈 및 형상 확인scopy (TEM) ³⁰ .
   참고 : DLS를 사용하여 측정 된 수력 학적 직경은 NP를 둘러싼 용매 층으로 인해 TEM을 사용하여 측정 한 크기보다 큽니다.
   1. NP 용액을 이중 증류수로 1:40으로 희석하여 이미징을 방해 할 수있는 과도한 첨가제 ( 예 : SDS 또는 PVP)를 제거합니다. 레이스 / 얇은 탄소 필름 (시판 중이며 재료 목록 참조)으로 사전 코팅 된 구리 TEM 그리드 위에 2 μL의 용액을 떨어 뜨리고 실온에서 데시 케이 터에서 밤새 건조시킵니다.
   2. 참조 ³⁰ 에 설명 된대로 크기와 모양을 평가하기 위해 NP를 이미지화하십시오.
4. NP 농도를 계산하기 위해 증류수가 들어있는 초음파 세척 수조에 1 분간 올려 놓으면서 제거 된 금속 표적으로부터 느슨하게 부착 된 NP를 제거한다 (2.3 단계).
   1. 대상을 압축 공기 스트림으로 1 분 동안 건조시킵니다. 따의 질량을 측정하라.microbalance에 rget. 용해 된 NP의 질량을 제거 전후의 중량 차이로 정량화하십시오. 이는 금속 나노 입자를 용액으로 분출 한 결과로 추정됩니다.

4. 조사 후

1. 2.2에서 사용 된 동일한 절제 용액에서 NP를 100 μg / mL의 최대 농도로 희석하십시오. 이 농도 한계는 균일 한 조사를 보장하는 데 중요합니다.
2. 15-17 mL의 희석 된 NP를 교반 막대가 들어있는 석영 큐벳으로 옮긴다 ( 그림 1B ). 들어오는 레이저와 평행하게 정렬 된 자기 교반 플레이트에 큐벳을 놓습니다.
3. Nd : YAG 레이저 시스템을 사용하여 25 ps 532 nm 레이저 펄스를 생성하고 75 mm 초점 거리 렌즈를 사용하여 레이저를 솔루션 중심에 집중시킵니다. 원하는 크기에 따라 30 분에서 여러 시간 동안 용액을 조사하십시오.
   참고 : 전달되는 총 에너지는 용액의 농도와 t방사선 조사 면적은 0.5 mJ 내지 3.5 mJ 범위 일 수있다. 이 장치의 경우, 투명한 저농도 샘플 (<50 μg / mL)을 조사한 후 30 분 동안 직경이 10 nm 인은 NP가 생성됩니다.

5. 나노 입자의 항균성 측정

참고 : 그람 양성균 ( Bacillus subtilis )과 그람 음성균 ( Escherichia coli )에 대한은 NP의 독성이 시험되었다. 이 방법은 모든 종에 쉽게 적응할 수 있습니다. 그러나 나노 입자의 유효 투여 량은 상당히 다를 수 있으며 경험적으로 결정되어야한다. 여기에서, 대장균 은 방법의 설명을위한 모델 시스템으로 사용된다.

1. Bacto tryptone, 5g / L 효모 추출물, 10g / L 염화나트륨이 포함 된 Luria Broth (LB)에서 37 ℃에서 밤새 대장균 배양 물 (MG1655 주)을 재배한다. 하룻밤 배양 물을 광학 밀도 (λ = 600nm)을 0.01의 새로운 LB에서 측정 하였다.
2. NP가 첨가물 ( 예 : SDS 또는 PVP)을 포함하는 제거 매체에서 합성 된 경우 NP를 첨가 할 때 농도가 일정하게 유지되도록 LB에 각각의 화학 물질을 첨가하십시오.
   참고 : 예를 들어, 전형적인 실험에서은 표적을 NP의 100 μg / mL 용액을 산출하기 위해 60 mM SDS 용액으로 제거합니다. 배양 배지에서 NPs의 최종 농도가 10 μg / mL라면, 6 mM SDS를 함유 한 LB ( 즉 , 절제 액에서 SDS 농도의 1/10)를 준비한다. 이러한 농도를 사용할 때 박테리아의 성장에 부정적인 영향은 없습니다. 이것은 그림 3 의 -AgNP 컨트롤에 표시됩니다.
3. 0-50 μg / mL 범위의 농도로 희석 배양 물에 NP를 첨가하고 37 ℃에서 2 시간 더 진탕하면서 배양한다. 독성에 대한 긍정적 인 통제로서, 항생제 ( 예 : 30 μg / mL kanamycin).
4. 2 시간 부화 후, 일련의 신선한 LB로 문화 샘플 1시 10 분 희석하고 LB 한천 플레이트에 각 희석의 10 μL 상품을 놓습니다. 일반적으로 10 ⁴ ~ 10 ⁸ 배 희석법으로 개별 콜로니를 관찰 할 수 있습니다.
5. 일단 물방울이 흡수되면 37 ° C에서 밤새 배양하고 다음날 아침에 콜로니 형성 대장 (cfu)을 세십시오.

결과

실버 타겟을 사용하여 위에서 설명한 레이저 매개 변수와 절제 액에서 60 mM SDS를 사용하면은 NP가 SPR에서 특징적인 UV-VIS 흡광도로 생성됩니다 ( 그림 2A ). TEM과 DLS 측정은 조사 후 약 25 nm의 평균 NP 직경을 나타냅니다 ( 그림 2B ). 30 분 동안은 표적을 제거하면 일반적으로 200 μg / mL의 NP 농도가 산출됩니다. 은 NPs의 항균 독성을 평...

토론

NP의 재현성있는 항균 효과는 비슷한 크기와 농도의 NP를 지속적으로 생산해야한다. 따라서 플루 언스 (fluence), 파장 및 펄스 지속 시간 등의 레이저 매개 변수를 표준화하는 것이 중요합니다. 동적 광 산란은 NP 크기를 추정하기위한 쉽고 신속한 방법이지만, 크기 분포의 정확한 정량화는 TEM에 의한 직접 측정이 필요합니다. 각 레이저 빔은 모드 프로파일 및 발산 측면에서 뚜렷한 특성을 가지므로 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanosecond Nd:YAG laser	Ekspla	NL303
Motorized xy scanning stage	Standa	8MTF
UV-VIS spectrophotometer	Agilent	Cary 60
Dynamic light scattering unit	Malvern	Zetasizer ZS 90
Microbalance	Maktek	TM 400
Transmission electron microscope	Zeiss	EM 902
Silver foil target	Alfa Aesar	12127
250 mm focal length lens	Edmund Optics	69-624
Copper TEM grids	Pacific Grid-Tech	Cu-400LD	Lacey/thin film coated grid
E. coli MG1655	ATCC	47076
Bacto-tryptone	BD Biosciences	211705
Yeast extract	BD Biosciences	212750
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP3581
Bacto-agar	BD Biosciences	214010
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166-100
Polyvinylpyrrolidone	Fisher Scientific	BP431-100
Stainless steel disc (for ablation stage)	Metal Remnants, Inc.	N/A	1.5 inch diameter, 16 gauge
Beaker	Fisher Scientific	02-540G
Magnetic stir bar	Fisher Scientific	14-513-57
Magnetic stir plate	Fisher Scientific	11-100-49SH
Laser energy and power meter	Coherent	1098579
Carbon tape	Shinto Chemitron Co. Ltd.	STR Tape
Sonicating water bath	Branson	1510
Air compressor	GMC	Syclone 3010	For drying ablation target
75 mm focal length lens	Edmund Optics	34-096	Focusing lens for post-irradiation
Quartz cuvette	Precision Cells Inc	21UV40	50 mm light path (for post-irradiation)
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5
Light microscope	Nikon	50i	This microscope is used to focus the laser on the ablation stage. This particular model is no longer available, but any light microscope with a 4X objective will work.
CCD camera	AmScope	MT5000-CCD
Micrometer slide	Ted Pella	2280-70