Produção de nanopartículas metálicas por ablação a laser pulsada em líquidos: uma ferramenta para estudar as propriedades antibacterianas das nanopartículas

Resumo

As propriedades antimicrobianas de metais como cobre e prata foram reconhecidas há séculos. Este protocolo descreve a ablação por laser pulsada em líquidos, um método de síntese de nanopartículas metálicas que proporciona a capacidade de afinar as propriedades dessas nanopartículas para otimizar seus efeitos antimicrobianos.

Resumo

O surgimento de bactérias resistentes a múltiplos fármacos é uma preocupação clínica global levando alguns a especular sobre o nosso retorno a uma era de medicamentos "pré-antibióticos". Além dos esforços para identificar novos fármacos antimicrobianos de pequena molécula, tem havido grande interesse no uso de nanopartículas metálicas como revestimentos para dispositivos médicos, curativos para feridas e embalagens de consumo, devido às suas propriedades antimicrobianas. A grande variedade de métodos disponíveis para a síntese de nanopartículas resulta em um amplo espectro de propriedades químicas e físicas que podem afetar a eficácia antibacteriana. Este manuscrito descreve o método de ablação a laser pulsada em líquidos (PLAL) para criar nanopartículas. Esta abordagem permite o ajuste fino do tamanho, composição e estabilidade das nanopartículas usando métodos de pós-irradiação, bem como a adição de surfactantes ou exclusores de volume. Ao controlar o tamanho e a composição das partículas, uma grande variedade de propriedades físicas e químicas da nanopa de metalPodem ser exploradas as partículas que podem contribuir para a sua eficácia antimicrobiana, abrindo assim novas vias para o desenvolvimento antibacteriano.

Introdução

As nanopartículas (NPs) são geralmente definidas como partículas que têm pelo menos uma dimensão com menos de 100 nm de comprimento. Os métodos tradicionais de síntese NP química geralmente requerem agentes redutores perigosos, como boroidridos e hidrazinas. Em contraste, a ablação a laser de alvos de metal sólido imersos em um meio líquido (ablação a laser pulsada em líquidos - PLAL) fornece uma rota ecológica para a síntese NP que satisfaz todos os 12 dos Princípios da Química Verde ^{1 , 2} . Em PLAL, um alvo de metal submerso é irradiado por pulsos de laser repetidos. À medida que o laser abla o alvo, uma pluma densa de aglomerados atômicos e vapor é liberada no meio líquido em que os NPs se juntam rapidamente. Os NP produzidos por PLAL são finamente dispersos em um meio aquoso e o tamanho, polidispersão e composição dos NPs podem ser facilmente controlados pela variação do líquido aquoso de ablação, bem como do laser parAmostras ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} .

As características das nanopartículas podem ser ajustadas ajustando uma série de parâmetros do laser, incluindo: fluência, comprimento de onda e duração do pulso (revisado na referência ⁷ ). A fluência do laser é calculada como a energia do pulso dividida pela área do ponto do laser na superfície do alvo. Os efeitos precisos da fluência sobre o tamanho e a polidispersão das NPs são algo controversos. Em geral, verificou-se que, para os sistemas de laser pulsado "longos" e "ultra-curtos", existem regimes de fluência baixos e altos que produzem tendências negativas e positivas de tamanho, respectivamente ^{8 , 9 , 10 , 11} . NP tamanho distributivoOs ons podem ser medidos empiricamente usando técnicas como dispersão de luz dinâmica e microscopia eletrônica de transmissão (TEM), conforme descrito abaixo.

A escolha do comprimento de onda do laser pode afetar os mecanismos físicos pelos quais os NPs são formados. Em comprimentos de onda mais curtos (ultravioleta), os fótons de alta energia são capazes de quebrar as ligações interatômicas ¹² . Este mecanismo de foto-ablação é um exemplo de uma síntese de NP de cima para baixo, porque resulta na liberação de fragmentos de material ultra-pequenos que tendem a produzir maiores amostras de polidispersão ao saciar no líquido de submersão ^{12 , 13 , 14} . Em contraste, a ablação do infravermelho próximo (λ = 1,064 nm) produz um mecanismo de síntese ascendente dominado pela ablação plasmática ¹² . A absorção do laser pelo alvo libera elétrons que colidem com e, em seguida, livres, elétrons encadernados. Como cOllisions aumenta, o material é ionizado, inflamando assim um plasma. O líquido circundante limita o plasma, aumenta a sua estabilidade e aumenta ainda mais a absorção ¹² . À medida que o plasma em expansão é extinto pelo líquido de confinamento, os NPs são condensados ​​com várias geometrias ^{4 , 12 , 15} .

A escolha da duração do pulso do laser pode afetar ainda mais o processo de formação de NP. Os lasers de pulsação longa comumente usados, com durações de pulso superiores a alguns picosegundos, incluem todos os milímetros, micro, nano e alguns aeroses pulsados ​​com picosegundo. Neste regime de largura do pulso, a duração do pulso do laser é maior do que o tempo de equilíbrio elétron-fonão, que é normalmente na ordem de alguns picosegundos ^{4 , 16 , 17 , 18 , 19}. Isso resulta em vazamento de energia no meio de ablação circundante e na formação de NPs por mecanismos térmicos, como emissão termiônica, vaporização, ferver e derreter ^{1 , 20} .

A atividade antibacteriana dos NPs é fortemente influenciada pelo tamanho de partícula ^{21 , 22 , 23 , 24} . A fim de aumentar a redução de tamanho e a monodispersão, os NPs podem ser irradiados uma segunda vez usando um laser de um comprimento de onda perto da ressonância plasmática de superfície (SPR) do NP. A radiação laser incidente é absorvida pelo NP através da excitação do SPR. A fragmentação do NP pode ocorrer através da evaporação térmica ^{25 , 26} ou da explosão de Coulomb ^{27 , 28} . A fotoexcitação aumenta tA temperatura do NP acima do ponto de fusão, resultando no derramamento da camada externa da partícula. Verificou-se que a adição de agentes tais como polivinilpirrolidona (PVP) ou dodecilsulfato de sódio (SDS) à solução pode melhorar grandemente os efeitos pós-irradiação ⁵ . O impacto da adição de vários solutos foi descrito em vários relatórios ^{1 , 4 , 6} . A facilidade de manipulação de características de NP por PLAL oferece um novo método para desenvolver novos antimicrobianos baseados em NP.

Protocolo

1. Focando o laser de nanosegundo e fluência de medição

1. Montar o aparelho de ablação colocando uma barra de agitação magnética e um estágio de ablação porosa dentro de um copo de vidro de 50 mL.
   NOTA: O estágio de ablação consiste em uma plataforma de aço inoxidável de 3,81 cm de diâmetro e 1,6 mm de espessura com dez orifícios de 0,65 cm de diâmetro e seis orifícios de 0,50 cm de diâmetro perfurados no padrão ilustrado na Figura 1 . O objetivo desses buracos é permitir que o líquido se mova através do alvo para que as partículas não se acumulem imediatamente acima do alvo. A mistura insuficiente leva a interações deletérias entre o laser e as partículas já formadas. Além disso, três furos roscados # 29 (8-32) estão localizados perto do perímetro da plataforma para aceitar os parafusos que servem como pernas para elevar a plataforma e fornecer espaço para uma barra de agitação magnética ( Figura 1A ).
   1. Coloque o copo em um magnéticoAgite a placa e coloque a placa de agitação sobre uma fase de conversão xy para permitir o movimento do alvo durante a ablação ( Figura 1A ).
2. Defina o laser Nd: YAG para operar no comprimento de onda fundamental de 1.064 nm, com uma duração de impulso de 5 ns e uma taxa de repetição de pulso de 10 Hz. Meça a energia por pulso com um medidor de energia e energia de laser. A energia necessária é 240-250 mJ.
3. Focalize o feixe abaixo do alvo no estágio de ablação usando uma lente convergente de comprimento focal de 250 mm (NA = 0,05).
   NOTA: O feixe de entrada possui um raio de 4.025 mm e é necessária uma altura da lente de 161 mm para atingir o tamanho do ponto desejado. O tamanho ideal do ponto é determinado empiricamente. Um tamanho de ponto maior é utilizado para reduzir o efeito da proteção por NPs presentes na solução. Isso é equilibrado com o fato de que aumentar o tamanho do ponto requer maior energia para manter fluência adequada.
4. Determine o tamanho do ponto, colocando um alvo de metal (veja a seçãoN 2) no palco e ablação com vários pulsos de laser. Veja o alvo ablado juntamente com um slide micrométrico em um microscópio de luz equipado com câmera CCD (objetivo 4X) para medir o tamanho do ponto ( Figura 1A ).
   NOTA: Para o aparelho aqui, o sistema de ablação produz um tamanho de ponto com uma área média de 5,51 mm ² . O tamanho do ponto permanece nesta faixa para cada ablação.
5. Calcule a fluência dividindo a energia do pulso pela área do ponto. Para o aparelho aqui, a fluência é de 4,80 J / cm ² .

2. Síntese de Nanopartículas de Prata por Ablação com Laser Pulsado em Líquido

1. Pesar um alvo de prata plano usando uma microbalança para obter a massa de pré-ablação.
2. Aderir ao alvo prateado para o estágio poroso usando fita adesiva de carbono de dupla face. Adicione 40 mL de líquido de ablação ao copo ( Figura 1A ). A altura do líquido acima do alvo é de 11 mm.
   NOTA: ablação típica liqUids são soluções aquosas contendo SDS 60 mM ou PVP 2 mM para aumentar a monodispersão.
3. Sob constante agitação, mova o estágio xy motorizado controlado por computador em um padrão elíptico (dimensões: eixo principal = 2,09 cm, eixo menor = 0,956 cm, área = 1,57 cm ² ) a uma velocidade de 0,42 cm / s e ablate o alvo Por 20-40 min.
   NOTA: A concentração de NPs aumenta com tempos de ablação mais longos. Certifique-se de que a agitação seja suficientemente vigorosa para manter a concentração NP uniforme ao longo da solução para minimizar os efeitos de proteção ⁷ .

3. Caracterizando Nanopartículas de Metal

1. Recolher a solução de nanopartículas do copo por decantação. Confirme a presença de nanopartículas medindo seus espectros de luz visíveis UV (200-1,100 nm).
   NOTA: Os NPs têm uma absorção de pico no comprimento de onda de ressonância de plasmon de superfície (SPR). Para prata, o SPR é centrado a 400 nm. NP altamente concentradoAs soluções requerem diluição antes da medição do espectro UV-VIS para garantir que as leituras de absorvância permaneçam dentro da faixa linear do espectrofotômetro.
2. Medir o diâmetro hidrodinâmico dos NP por dispersão de luz dinâmica (DLS) utilizando um método de análise de distribuição de números ²⁹ .
   1. Diluir a solução NP 1:40 na solução de ablação e pipetar 1 mL em uma cubeta de plástico de 1 cm. Utilizando um ângulo de medição de 180 ° _, mede a dispersão da luz a um comprimento de onda de 633 nm para determinar o diâmetro NP de acordo com a equação de Stokes-Einstein:
      
      Onde d é o raio hidrodinâmico, k é constante de Boltzmann, T é temperatura absoluta, η é viscosidade e coeficiente de difusão D ou velocidade do movimento browniano.
3. Confirmar o tamanho e a forma de NP usando o microfone eletrônico de transmissãoEscopy (TEM) ³⁰ .
   NOTA: O diâmetro hidrodinâmico medido usando DLS é maior do que o tamanho medido usando TEM devido à camada de solvente que envolve os NPs.
   1. Diluir a solução NP 1:40 em água duplamente destilada para remover qualquer excesso de aditivos ( por exemplo, SDS ou PVP) que possam interferir com a imagem. Largue 2 μL da solução em uma grade TEM de cobre pré-revestida com película de carbono lacei / fina (comercialmente disponível, veja a Lista de materiais) e seca durante a noite à temperatura ambiente sob vácuo em um dessecador.
   2. Imagem dos NP para avaliar o tamanho e a forma, conforme descrito na referência ³⁰ .
4. Para calcular a concentração de NP, desalojar quaisquer NPs ligeiramente ligados do alvo de metal ablado (etapa 2.3) colocando o alvo em um banho de água sonicante contendo água destilada durante 1 min.
   1. Secar o alvo sob uma corrente de ar comprimido durante 1 min. Meça a massa da taRget em uma microbalança. Quantifique a massa de NPs em solução como a diferença de peso antes e depois da ablação, o que é assumido como resultado da ejeção de nanopartículas metálicas na solução.

4. Pós-irradiação

1. Diluir os NPs para uma concentração máxima de 100 μg / mL na mesma solução de ablação usada em 2.2. Este limite de concentração é fundamental para garantir uma irradiação uniforme.
2. Transferir 15-17 mL das NP diluídas para uma cuvete de quartzo contendo uma barra de agitação ( Figura 1B ). Coloque a cuvete em uma placa de agitação magnética alinhada paralelamente com o laser de entrada.
3. Use um sistema laser Nd: YAG para produzir pulsos a laser de 25 ps 532 nm e uma lente de comprimento focal de 75 mm para focalizar o laser no centro da solução. Irradiate a solução por 30 minutos a várias horas, dependendo do tamanho desejado.
   NOTA: A energia total entregue depende da concentração da solução e tDe irradiação e pode variar de 0,5 mJ a 3,5 mJ. Para o aparelho aqui, 30 min de pós-irradiação de uma amostra transparente e de baixa concentração (<50 μg / mL) produz NPs de prata com um diâmetro de 10 nm.

5. Medindo as Propriedades Antibacterianas das Nanopartículas

NOTA: A toxicidade de NPs de prata contra ambos os Gram- positivos ( Bacillus subtilis ) e Gram- negativos ( Escherichia coli ) foi testada ³¹ . O método é facilmente adaptado a qualquer espécie; No entanto, a dose eficaz de nanopartículas pode variar consideravelmente e deve ser determinada empiricamente. Aqui, E. coli é usado como o sistema modelo para a descrição do método.

1. Cultivar culturas de E. coli (estirpe MG1655) durante a noite a 37 ° C em Luria Broth (LB) contendo 10 g / L de triptona de Bacto, 5 g / L de extracto de levedura e 10 g / L de cloreto de sódio. Diluir as culturas durante a noite para uma densidade óptica (λ = 600Nm) de 0,01 em LB fresco.
2. Se os NPs foram sintetizados em meios de ablação contendo aditivos ( por exemplo, SDS ou PVP), adicione o respectivo produto químico ao LB de tal forma que a concentração permaneça constante ao adicionar os NPs.
   NOTA: Por exemplo, em uma experiência típica, um alvo de prata é ablado em uma solução de SDS 60 mM para produzir uma solução de NP de 100 ug / mL. Se a concentração final de NPs nos meios de cultura for de 10 μg / mL, prepare LB contendo SDS 6 mM ( ou seja, 1/10 da concentração de SDS no líquido de ablação). Não há efeito negativo sobre o crescimento da bactéria ao usar essas concentrações. Isso é mostrado no controle -AgNP na Figura 3 .
3. Adicione os NPs às culturas diluídas em concentrações variando entre 0-50 μg / mL e cultivar as culturas com agitação a 37 ° C durante 2 h adicionais. Como um controle positivo para a toxicidade, tratar E. coli com um antibiótico ( por exemplo, 30 μg / mL de kanamYcin).
4. Após as 2 h de incubação, diluir em série as amostras de cultura 1:10 em LB fresco e detectar 10 μL de gotas de cada diluição em placas de agar LB. Tipicamente, 10 ⁴ -10 diluições de ⁸ vezes são suficientes para ver colônias individuais.
5. Uma vez que as gotículas foram absorvidas, incubar as placas durante a noite a 37 ° C e contar as unidades formadoras de colônias (cfu) na manhã seguinte.

Resultados

Usando alvos de prata, os parâmetros de laser descritos acima e SDS de 60 mM no líquido de ablação, NPs de prata são gerados com a absorvância UV-VIS característica no SPR ( Figura 2A ). As medições de TEM e DLS revelam um diâmetro NP médio de aproximadamente 25 nm antes da pós-irradiação ( Figura 2B ). Ablação do alvo de prata por 30 min geralmente produz uma concentração de NP de 200 μg / mL. Ao avaliar a to...

Discussão

Os efeitos antimicrobianos reproduzíveis das NPs requerem produção consistente de NP com tamanhos e concentrações semelhantes. Portanto, é fundamental padronizar os parâmetros do laser, incluindo fluência, comprimento de onda e duração do pulso. Embora a dispersão de luz dinâmica seja um método fácil e rápido para estimar o tamanho de NP, a quantificação precisa da distribuição de tamanho requer medição direta por TEM. Como cada raio laser tem características distintas em termos de perfil de modo e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanosecond Nd:YAG laser	Ekspla	NL303
Motorized xy scanning stage	Standa	8MTF
UV-VIS spectrophotometer	Agilent	Cary 60
Dynamic light scattering unit	Malvern	Zetasizer ZS 90
Microbalance	Maktek	TM 400
Transmission electron microscope	Zeiss	EM 902
Silver foil target	Alfa Aesar	12127
250 mm focal length lens	Edmund Optics	69-624
Copper TEM grids	Pacific Grid-Tech	Cu-400LD	Lacey/thin film coated grid
E. coli MG1655	ATCC	47076
Bacto-tryptone	BD Biosciences	211705
Yeast extract	BD Biosciences	212750
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP3581
Bacto-agar	BD Biosciences	214010
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166-100
Polyvinylpyrrolidone	Fisher Scientific	BP431-100
Stainless steel disc (for ablation stage)	Metal Remnants, Inc.	N/A	1.5 inch diameter, 16 gauge
Beaker	Fisher Scientific	02-540G
Magnetic stir bar	Fisher Scientific	14-513-57
Magnetic stir plate	Fisher Scientific	11-100-49SH
Laser energy and power meter	Coherent	1098579
Carbon tape	Shinto Chemitron Co. Ltd.	STR Tape
Sonicating water bath	Branson	1510
Air compressor	GMC	Syclone 3010	For drying ablation target
75 mm focal length lens	Edmund Optics	34-096	Focusing lens for post-irradiation
Quartz cuvette	Precision Cells Inc	21UV40	50 mm light path (for post-irradiation)
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5
Light microscope	Nikon	50i	This microscope is used to focus the laser on the ablation stage. This particular model is no longer available, but any light microscope with a 4X objective will work.
CCD camera	AmScope	MT5000-CCD
Micrometer slide	Ted Pella	2280-70