JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כתב יד זה מתאר את הליך הניסוי וניתוח תוכנה עבור assay דו כיווני האתר אינטגרציה שיכולה בו זמנית לנתח במעלה הזרם ו-במורד הזרם ווקטור צומת ה- DNA. ניתן להשתמש במוצרי PCR דו-כיווניים עבור כל פלטפורמה של רצף דונסטרים. הנתונים שהתקבלו שימושיים עבור השוואה גבוהה, השוואה כמותית של מטרות DNA משולב.

Abstract

מבחני אינטגרציית האתר (IS) הם מרכיב קריטי בחקר אתרי אינטגרציה רטרו-ויראליים ומשמעותם הביולוגית. במחקרים שנעשו לאחרונה על גנים רטרו-ויראליים, מבחני ה- IS, בשילוב עם רצף הדור הבא, שימשו ככלי למעקב תאים כדי לאפיין אוכלוסיות של תאי גזע משובטים החולקים את אותו ה- IS. לשם השוואה מדויקת של repopulating שיבוטים תא גזע בתוך דגימות שונות, זיהוי רגישות, שחזור נתונים, קיבולת תפוקה גבוהה של assay הן בין התכונות assay החשוב ביותר. עבודה זו מספקת פרוטוקול מפורט ונתונים ניתוח עבודה עבור ניתוח דו כיוונית IS. Assay דו כיווני יכול במקביל רצף הן במעלה או במורד הזרם ווקטור מארח צמתים. בהשוואה גישות חד צדדית קונבנציונאלי IS רצף, הגישה דו כיוונית משפר באופן משמעותי את שיעורי גילוי ה- IS ואת אפיון של אירועים אינטגרציה בשני הקצוות של tהוא מכוון לדנ"א. צינור ניתוח הנתונים המתואר כאן מזהה ומזהה במדויק רצפים IS זהה באמצעות שלבים מרובים של השוואה כי מפת מסלולים IS על הגנום התייחסות ולקבוע שגיאות רצף. באמצעות הליך אופטימיזציה assay, יש לנו פירסם לאחרונה את דפוסי repopulation מפורט של אלפי שיבוט תאים גזעית hematopoietic (HSC) שיבוטים הבאים השתלה ב macacques rsus, מפגין בפעם הראשונה את נקודת הזמן המדויקת של HSC repopulation ואת ההטרוגניות תפקודית של HSCs ב מערכת הפרימטים. הפרוטוקול הבא מתאר את ההליך הניסוי שלב אחר שלב ואת זרימת עבודה ניתוח נתונים המזהה ומזהה במדויק רצפים IS זהה.

Introduction

רטרווירוסים מכניסים את הדנ"א הגנומי שלהם לגנום המארח באתרים שונים. תכונה ייחודית זו, אשר עשויה לתרום להתפתחות סרטן וצורות אחרות של פתוגנזה ויראלית, יש יתרון אירוני של הפיכת וירוסים אלה מקובלות מאוד להנדסה סלולרית עבור טיפול גנטי ומחקר ביולוגי בסיסי. אתר האינטגרציה הנגיפי (IS) - המיקום על הגנום המארח שבו משולב דנ"א זר (וירוס) - יש השלכות חשובות על גורלם של הנגיפים המשולבים ושל התאים המארחים. מבחני ה- IS שימשו בהגדרות מחקר ביולוגיות וקליניות שונות על מנת לבחון את הבחירה באתר האינטגרציה הרטרו-ויראלית והפתוגנזה, התפתחות סרטן, ביולוגיה של תאי גזע וביולוגיה התפתחותית 1 , 2 , 3 , 4 . רגישות נמוכה לזיהוי, שחזור נתונים לקוי, וזיהום צולב תכופים הם ביןהגורמים המרכזיים להגבלת היישומים של מבחני ה- IS למחקרים הנוכחיים והמתוכננים.

הרבה טכנולוגיות ניתוח IS פותחו. הגבלת אנזימים מבוססי מבחני אינטגרציה האתר, כולל קישור LM) פולימרז שרשרת התגובה (PCR) 5 , הפוך PCR 6 , ו-ליניארי הגברה- Mediated (LAM) PCR 7 , הם הנפוצים ביותר. עם זאת, השימוש באנזימי הגבלה ספציפיים לאתר, יוצר הטיה בזמן אחזור ה- IS, ומאפשר רק תת-קבוצה של אינטגרומים (DNA זר המשולב בגנום המארח) בקרבת אתר ההגבלה שיש לשחזר. טכנולוגיות Assay כי הערכה מקיפה יותר וקטור IS כבר הציג בשנים האחרונות. מבחני אלה להעסיק אסטרטגיות שונות, כולל מו טרנספוזון בתיווך PCR 8 , nonrrictive (nr) -LAM PCR 9 , סוג II הגבלת אנזים-מ 'עיבוד מעבדה 10 , גז מכני 11 , ו - PCR אקראיים מבוססי hexamer (Re-free PCR) 12 , לרסס DNAs גנומי ולהגדיל את ה- IS. הטכנולוגיות הנוכחיות יש רמות משתנות של רגישות זיהוי, כיסוי הגנום, ספציפיות היעד, קיבולת תפוקה גבוהה, המורכבות של הליכי assay, ואת הטיות בזיהוי התדרים היחסיים של אתרי היעד. בהתחשב בתכונות שונות של מבחני הקיימים מגוון של מטרות אשר ניתן להשתמש בהם, הגישה assay אופטימלי צריך להיות נבחר בקפידה.

עבודה זו מספקת נהלים ניסויים מפורט זרימת עבודה ניתוח נתונים חישובית עבור assay דו כיווני זה משפר באופן משמעותי את שיעורי גילוי ורמת כימות רצף על ידי ניתוח בו זמנית במעלה הזרם של הזרם של DNA משולב היעד (ראה איור 1 עבור תצוגה סכמטית של הליכי assay ). גישה זו גם לספק(לדוגמה, הנאמנות של שכפול אתר היעד ווריאציות ברצף הגנומי של הזרמות במעלה או במורד הזרם). שיטות דו-כיווניות אחרות שימשו בעיקר לשיבוט ולרצף של שני הקצוות של היעד DNA 11 , 13 , 14 . Assay זה מותאם באופן מיטבי עבור התפוקה גבוהה לשעתקו לשחזור של שיבוטים מסומנים וקטור, תוך שימוש בשיטת LM-PCR מבוססת היטב ומיפוי ניתוח חישובית, וכן לכימות שני צמתים במעלה או במורד. אנליזה דו-כיוונית עם האנזים TaqαI הוכיחה את עצמה עבור כימות גבוהה של התפוקה המשובצת בתאי גזע גזעניים מחקרים פרה-קליניים 2 , 15 . מאמר זה מתאר שיטה שונה באמצעות חותך תכופים יותר (RsaI / CviQI - מוטיב: GTAC), אשר מכפילההוא הסיכויים של גילוי integromes לעומת assay TaqαI מבוסס . ניסויים מפורטים וניתוח נתונים אשר משתמשים אנזימים מוטיב GTAC עבור lentiviral (NL4.3 ו נגזרותיה) ו גמא raterroviral (pMX וקטורים) וקטור IS ניתוח מתוארים. Oligonucleotides בשימוש assay המפורטים בטבלה 1 . סקריפט תכנות פנימי עבור ניתוח רצף IS מסופק במסמך המשלים.

Protocol

1. יצירת Upstream (משמאל) - ו Downstream (מימין) -Junction רצף ספריות

  1. הכנה DNA מקשר:
    1. הכן 10 μL פתרון ה- DNA מקשר על ידי הוספת 2 μL של 100 מיקרומטר LINKER_A אוליגוס (הסופי: 20 מיקרומטר), 2 μL של 100 מיקרומטר LINKER_B אוליגוס (הסופי: 20 מיקרומטר), 2 μL של 5 M NaCl (סופי: 1M), ו 4 μL של מים nuclease ללא צינור PCR. ראה טבלה 1 עבור רצף הקישורים.
    2. דגירה הפתרון דנ"א מקשר ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות במכשיר PCR, לעצור את התוכנית להפעיל, ולהפוך את המכשיר לכבות את ה- PCR. השאירו את הפתרון מקשר במכשיר במשך 30 דקות לאט לאט לצנן את ה- DNA מקשר. פתרון ה- DNA מקשר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס.
  2. LTR ספציפית ביוטין-תחל הרחבה:
    1. השתמש ספקטרופוטומטר UV-Vis כדי לקבוע את ריכוז ה- DNA ואת ערכי 260/280 ננומטר של הדנ"א הגנומי מ in vivoאו בניסויים חוץ גופית . לדלל 1-2 מיקרוגרם של דנ"א גנומי מדגם לנפח סופי של 170 μL של פתרון DNA גנומי באמצעות מים nuclease חינם.
    2. הכן 200 μL תגובה PCR על ידי ערבוב 2.5 μL כל אחד 10 מיקרומטר HIV-1 ספציפי ביוטין ביוטין (L-BPs ו- R-BPs בטבלה 1 : סך של 10 μL לארבעה primers ספציפיים lentivirus), 20 μL של 10X thermostable חיץ DNA פולימראז, 4 μL של 10 dNTPs mM (סופי: 200 מיקרומטר של כל dNTP), 3 μL של 2.5 U / μL פולימרז DNA thermostable, ו 163 μL של DNA גנומי.
      הערה: עבור וקטורים gammaretroviral (וקטורים pMX), להשתמש 5 μL כל אחד משני 10 מיקרומטר pMX ספציפיים ביוטין primers (L-BP ו- R-BP: סך של 10 μL) במקום ארבעה HIV-1 ספציפי ביוטין primers לעיל.
    3. מחלקים את הפתרון לתוך ארבע צינורות PCR (כל 50 μL) ולבצע מחזור הרחבה אחת בתנאים הבאים: 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 56 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 72 מעלות צלזיוס עבור 5דקות ו- 4 ° C לאחסון.
    4. בריכה כל ארבע תגובות PCR לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל ופעל הליך PCRE טיהור של ערכת טיהור PCR. Elute עם μL 50 של חיץ elution (5 פי לקפל מים elution מדולל בתנאי בערכה). מיד להמשיך עם שלב 1.3.1 או לאחסן את DNA eluted ב -20 מעלות צלזיוס.
  3. RSAI ו CviQI עיכול
    1. הכן תגובה 100 עיכול μL על ידי הוספת 50 μL של ה- DNA (משלב 1.2.4), 10 μL של חיץ 10x A, ו 2 μL (20 U) של אנזים RSAI. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות במכשיר PCR.
    2. הוסף 1 μL (10 U) של אנזים CviQI לתגובה ו דגירה על 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות במכשיר PCR. מיד עם שלב 1.4.1
  4. סיום בוטה:
    1. הכן תערובת 4.5-μL המכיל 2.5 μL של פולימרז DNA אני גדול (klenow) שבר ו 2 μL של 10 dNTPs mM. העברה 181 L של התערובת לדגימת DNA משלב 1.3.2. הנפח הכולל יהיה 102 μL. מערבבים היטב על ידי vortexing ו דגירה על 25 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות במכשיר PCR. מיד עם שלב 1.6.1.
  5. הכנת חרוזים streptavidin:
    1. מערבולת בקצרה את הפתרון חרוז streptavidin ולהעביר 50 μL לצינור חדש microcentrifuge 2 מ"ל. הסר את supernatant באמצעות מעמד מגנטי לשטוף את החרוזים עם 200 μL של פתרון מחייב.
    2. Resuspend את החרוזים μL 100 של פתרון מחייב ומניחים את הצינור מן הדוכן המגנטי. מיד עם שלב 1.6.1.
  6. Streptavidin חרוז חרוז:
    1. העברת 100 μL של דגימת מדגם (שלב 1.4.1) ל -100 μL מחדש מושעה פתרון חרוז (שלב 1.5.2) ומערבבים היטב על ידי pipetting, כדי למנוע הקצפה של הפתרון. דגירה הצינור בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות על גלגל מסתובב או רולר.
    2. השתמש במעמד המגנטי כדי ללכוד את החרוזים ולזנוח supernatant. לשטוף את החרוזים פעמיים μL 400 של פתרון כביסה פעמיים μL 400 של חיץ ליגז 1x T4 D4 (בדילול של פתרון 10X באמצעות מים nuclease חינם).
    3. Resuspend את החרוזים μL 200 של חיץ ליגז 1x T4 DNA (מדולל מ 10 X פתרון באמצעות מים nuclease חינם) ומניחים אותו מן הדוכן המגנטי. מיד עם שלב 1.7.1.
  7. לינקר קשירת:
    1. הכן פתרון μL 400 קשירת תגובה בצינור microcentrifuge 2 מ"ל על ידי ערבוב 0.5 μL של מקשר דנ"א (שלב 1.1.2), 10 μL של חיץ ליגה 10x T4 DNA, 20 μL של 5X T4 DNA חיץ ligase (המכיל פוליאתילן 25% גליקול), 5 μL של ליגז DNA T4, 164.5 μL של מים ללא nuclease, ו 200 μL של החרוזים מושעה מחדש (שלב 1.6.3). מניחים את צינור התגובה על גלגל מסתובב ו דגירה ב RT (22 מעלות צלזיוס) במשך 3 שעות (או 16 ° CO / N).
    2. שטפו את החרוזים פעמיים עם פתרון הכביסה פעמיים עם 1X thermromable DNA פולימרז חיץ (בדילול מ 10x פתרון באמצעות מים nuclease חינם) באמצעות מעמד מגנטי.
    3. Resuspend את החרוזים μL 50 של 1x thermromable DNA פולימרז חיץ PCR ומניחים אותו מן הדוכן המגנטי. מיד להמשיך עם שלב 1.8.1 או לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך עד יום אחד.
  8. טרום הגברה של הצומת מימין ומשמאל צומת DNA:
    1. הכן 200 μL תגובה PCR על ידי הוספת 10 μL של 10 מיקרומטר 1L- תחל, 10 μL של 10 מיקרומטר 1R-primer, 20 μL של 10 מיקרומטר קישור Primer (טבלה 1), 10 μL של חיץ 10X פולימרז thermostable DNA, 4 μL של 10 mM dNTPs (סופי: 200 מיקרומטר של כל dNTP), 8 μL (20 U) פולימרז DNA thermostable, ו 88 μL של מים nuclease חינם על חרוזים מושעה מחדש (50 μL) מ שלב 1.7.3.
    2. Aliquot תערובת התגובה לתוך 4 צינורות PCR (כל 501, L) ולבצע PCR עם המצב הבא: 94 ° C דגירה של 2 דקות; 25 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס במשך 20 s, 56 מעלות צלזיוס במשך 25 s, ו 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; ו הארכה הסופי ב 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. בריכה כל 4 תגובות PCR לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל ופעל הליך טיהור PCR של ערכת טיהור PCR. Elute עם 50 μL של חיץ elution.
    4. קביעת ריכוז ה- DNA ו 260/280 ננומטר ערכים באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis; הדנ"א ניתן לאחסן ב -20 ° C עד מוכן לשלב הבא. המשך בצעדים 1.9.1 / 1.10.1 (אופציונלי) או ישירות עם צעדים 1.11.1 / 1.12.1.
  9. הסרת בצד שמאל DNA amplicon פנימי (אופציונלי):
    1. העברת עד 100 ng של מוצר ה- DNA PCR משלב 1.8.4 לצינור microcentrifuge 2 מ"ל ולהתאים את עוצמת הקול ל 10 μL באמצעות מים nuclease ללא.
    2. הכן תגובה אנזים הגבלה במיוחד במיקוד השמאלי בצד שמאל DNA amplicon.
      הערה: מצב התגובה עשוי להשתנות בהתאם לבחירה של האנזים. לדוגמה, בעת הסרת הדנ"א בצד השמאלי של NL4.3 מבוססי וקטורים lentiviral, להוסיף 1 μL של pvuII , 2 μL של חיץ B, ו 7 μL של מים ללא nuclease. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות במכשיר PCR. מיד עם שלב 1.11.1 או לאחסן ב -20 ° C.
  10. הסרת צד ימין DNA פנימי amplicon (אופציונלי):
    1. המשך כמו בשלב 1.9.1.
    2. הכן תגובה אנזים הגבלה במיקוד ספציפי בצד ימין DNA amplicon פנימי.
      הערה: לדוגמה, בעת הסרת בצד ימין DNA פנימי מן NL4.3 מבוססי וקטורים lentiviral, להוסיף 1 μL של sfoI , 2 μL של חיץ B, ו 7 μL של מים ללא nuclease. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות במכשיר PCR. מיד להמשיך עם צעד 1.12.1 או לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
  11. שמאלה- הגברה ספציפית:
    1. הכן תגובה 50 μL PCR על ידי ערבוב 5 μL של DNA מ צעד 1.8.4 (או מן שלב אופציונלי 1.9.2), 5 μL של 10 מיקרומטר 2L- תחל (הסופי: 1 מיקרומטר), 5 μL של 10 מיקרומטר תחל LINK2 (הסופי: 1 מיקרומטר), 5 μL של 10x חיץ DNA פולימרז thermostable, 1 μL של 10 dNTPs mM (סופי: 200 מיקרומטר של כל dNTP), 2 μL (5 U) של פולימרז DNA thermostable, ו 27 μL של nuclease ללא מַיִם.
    2. לבצע את PCR עם המצב הבא: 94 מעלות צלזיוס דגירה במשך 3 דקות; 8-15 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס במשך 20 s, 56 מעלות צלזיוס במשך 25 s, ו 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; ו הארכה הסופי ב 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      הערה: DNA מוגבר עשוי להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס. * אופטימיזציה מספר מחזור מוצע.
    3. בצע את ההליך טיהור PCR של ערכת טיהור PCR. Elute עם 50 μL של חיץ elution. קביעת ריכוז ה- DNA ו 260/280 nm ערכים.
  12. צומת ימני ספציפי הגברה:
    1. כל הנהלים זהים ל"הגברה ספציפית של צומת שמאל "(שלבים 1.11.1-1.11.3), למעט שימוש בפרימרים שונים; להשתמש בצומת הימני ספציפי צומת (2R-primer, ראה טבלה 1 ) בשלב זה.
  13. PCR amplicon אורך מבחן וריאציה:
    1. ניתוח גרסאות אורך PCR amplicon ידי ביצוע אלקטרופורזה 2% agarose ג'ל או אלקטרופורזה נימי ( איור 2 ).
      הערה: זהו צעד חיוני כדי לאשר את השלמת הליכי assay ולעשות הערכה גסה של דפוסי IS מבוסס על דפוסי הלהקה PCR. AMPlicon PCR מטוהרים מ 1.11.3 ו 1.12.3 ניתן להשתמש עבור פלטפורמות שונות רצף דנ"א. המשך בהליך הכנת המדגם המתאים לסיום שרשרת הסיום הקלאסית (סנגר) או לרצף הדור הבא. הדנ"א יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות; ג.

2. חישוב IS רצף ניתוח

  1. הכנת קבצי נתונים:
    1. הכן שלושה קבצי נתוני קלט: קובץ נתונים בפורמט רצף fasta (Test_data.fa בנתונים משלימים), קובץ tsv עבור מוטיבים לחיפוש עבור רצפים וקטוריים וקישורים (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv בנתונים משלימים) וקובץ tsv להגבלת מידע אנזימי (Enzyme.tsv נתונים משלימים).
      הערה: קבצים אלה נדרשים עבור demultiplexing, זמירה וקטור רצפים מקשר, והסרה רצפים וקטור פנימיים ( איור 3 א ). הוראות מפורטות שלב אחר שלב ליישום זרימת העבודה החישובית מסופקות בקובץ README.txt בנתונים המשלימים.
  2. ניתוח חישובי:
    1. הפעל demultiplexing ו זמירה סקריפטים.
      הערה: רצף הגלם יעובד עבור demultiplexing ועל trimminG של וקטור, מקשר, רצפים תחל (ראה STEP-1 בקובץ README.txt משלים).
    2. הפעל את הפקודה מיפוי (ראה STEP-2 בקובץ README.txt) כדי למפות את sequences מעובד על הגנום התייחסות באמצעות כלי יישור דמוי BLAST (BLAT, www.genome.ucsc.edu).
    3. הפעל את התסריט ניתוח כמותי IS (ראה STEP-3 בקובץ README.txt).
      הערה: שני קבצי פלט (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt ו- Final_count.txt) ייווצרו. פרטים נוספים על אסטרטגיות מיפוי ורצף רצף ניתן למצוא בקובץ "README.txt בנתונים המשלימים ובפרסומים קודמים 2 , 15 .

תוצאות

אסאי IS דו כיווני שנוצר בגדלים שונים של amplicons PCR עבור שניהם במעלה הזרם (שמאל) ומורד הזרם (מימין) וקטור מארח צמתים ( איור 2 ). הגודל של amplicon PCR תלוי במיקום של מוטיב GTAC הקרוב במעלה או במורד מהאינטגרמה. Assay גם המיוצר פנימי amplicons DNA DNA: רצפים retroviral...

Discussion

Assay דו כיווני מאפשר ניתוח סימולטני של שניהם במעלה הזרם (שמאל) ומורד הזרם (מימין) וקטור רצפים רצף DNA והוא שימושי במספר טיפולים גנטיים, תאי גזע, ויישומים מחקר סרטן. השימוש באנזימים של GTAC-Motif (RSAI ו- CviQI) וגישת ה- PCR הדו-כיוונית משפרת באופן משמעותי את הסיכוי לגילוי אינטגרום (או ?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המימון ניתן על ידי המוסדות הלאומיים לבריאות מענקים R00-HL116234, U19 A191141, R56 HL126544; הקרן הלאומית למדע גרנט DMS-1516675; הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); ואת תוכנית היוזמה KRIBB.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Thermostable DNA polymeraseAgilent600424PicoMaxx Polymerase
Thermostable DNA polymerase bufferAgilent600424PicoMaxx Polymerase buffer
Deoxynucleotide (dNTP) solution mixNew England BiolabsN0447LdNTP solution mix (10 mM each)
PCR tubesVWR International53509-304PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps
2 mL microcentrifuge tubeMolecular Bioproducts3453microcentrifuge tubes
PCR purification kitQiagen28106
RsaI New England BiolabsR0167Lrestriction enzyme
CviQINew England BiolabsR0639Lrestriction enzyme
Buffer ANew England BiolabsB7204SNEB CutSmart buffer
DNA Polymerase I large (klenow) fragment New England BiolabsM0210LBlunting
streptavidin beads solutionInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
Binding SolutionInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
Washing SolutionInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
magnetic standThermoFisher12321DDynaMag™-2 Magnet
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202LT4 DNA ligase
10X T4 DNA ligase bufferNew England BiolabsB0202ST4 DNA ligase reaction buffer
5X T4 DNA ligase bufferInvitrogen 46300-018T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000
UV-Vis spectrophotometerFisher ScientificS06497Nanodrop 2000
pvuIInew England BiolabsR0151Lrestriction enzyme
sfoInew England BiolabsR0606Lrestriction enzyme
Buffer Bnew England BiolabsB7203SNEB buffer 3.1
Nuclease free waterIntegrated DNA Technologies11-05-01-14
Capillary electrophoresisQiagen9001941QIAxcel capillary electrophoresis
Veriti 96-well Fast Thermal CyclerThermo Fisher Scientific4375305PCR Instrument
Rotating wheel (or Roller)EppendorfM10534004Cell Culture Roller Drums
DNA size markerQiagen929559QX size marker (100 - 2,500 bp)
DNA size markerQiagen929554QX size marker (50 - 1,500 bp)
DNA alignment markersQiagen929524QX DNA Alignment Marker
genomc DNANot AvailableNot AvailableSample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments

References

  1. Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
  2. Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
  3. Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
  4. Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
  5. Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
  6. Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
  7. Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
  8. Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
  9. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  10. Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
  11. Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
  12. Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
  13. Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
  14. Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
  15. Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
  16. Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
  17. Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  18. Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
  19. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
  22. Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
  23. Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

124

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved