양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

요약

이 원고는 상향 및 하향 벡터 - 숙주 접합 DNA를 동시에 분석 할 수있는 양방향 통합 사이트 분석을위한 실험 절차 및 소프트웨어 분석을 설명합니다. 양방향 PCR 제품은 모든 다운 스트림 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 결과 데이터는 통합 DNA 표적의 높은 처리량, 정량적 비교에 유용합니다.

초록

통합 사이트 (IS) 분석은 레트로 바이러스 통합 사이트 및 그 생물학적 중요성에 대한 연구에서 중요한 요소입니다. 최근의 레트로 바이러스 유전자 치료 연구에서, IS 분석은 차세대 시퀀싱과 함께 동일한 IS를 공유하는 줄기 세포 집단을 특성화하기위한 세포 추적 도구로 사용되었습니다. 서로 다른 샘플 내에서 그리고 다른 샘플 간에서 재 축적 된 줄기 세포 클론을 정확하게 비교하기 위해 분석의 검출 감도, 데이터 재현성 및 처리량이 가장 중요한 분석 품질 중 하나입니다. 이 작업은 양방향 IS 분석을위한 상세한 프로토콜 및 데이터 분석 워크 플로우를 제공합니다. 양방향 분석은 상류 및 하류 벡터 - 숙주 접합을 동시에 서열화할 수있다. 기존의 단방향 IS 시퀀싱 접근 방식과 비교할 때 양방향 접근 방식은 IS 탐지 속도와 t 양 끝에서 통합 이벤트의 특성을 크게 향상시킵니다.DNA를 목표로합니다. 여기에 설명 된 데이터 분석 파이프 라인은 IS 시퀀스를 참조 게놈에 매핑하고 시퀀싱 오류를 결정하는 여러 단계의 비교를 통해 동일한 IS 시퀀스를 정확하게 식별하고 열거합니다. 최적화 된 분석법을 사용하여 히말라포마 원숭이에 이식 한 후 수천 개의 조혈 줄기 세포 (HSC) 클론의 상세한 모집단 패턴을 최근에 발표하여 HSC 재조합의 정확한 시점과 HSC의 기능적 이질성을 처음으로 입증했습니다. 영장류 시스템. 다음 프로토콜은 동일한 IS 시퀀스를 정확하게 식별하고 정량화하는 단계별 실험 절차 및 데이터 분석 워크 플로를 설명합니다.

서문

레트로 바이러스는 게놈 DNA를 다양한 위치의 숙주 게놈에 삽입합니다. 암과 다른 형태의 바이러스 발병 기전의 발달에 기여할 수있는이 고유 한 특성은 유전자 치료 및 기초 생물학 연구를 위해이 바이러스를 세포 공학에 매우 적합하게 만드는 아이러니 한 이점이 있습니다. 외래 DNA (바이러스)가 통합 된 숙주 게놈의 위치 인 바이러스 통합 사이트 (IS)는 통합 바이러스와 숙주 세포의 운명에 중요한 영향을 미칩니다. IS 분석은 다양한 생물학적 및 임상 연구 환경에서 레트로 바이러스 통합 사이트 선택 및 병인, 암 발달, 줄기 세포 생물학 및 발달 생물학 ^{1 , 2 , 3 , 4} 를 연구하는 데 사용되었습니다. 낮은 검출 감도, 낮은 데이터 재현성 및 빈번한 교차 오염현재 및 계획된 연구에 IS 분석법의 적용을 제한하는 핵심 요인.

많은 IS 분석 기술이 개발되었습니다. 링커 매개 (LM) 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) ⁵ , 역 PCR ⁶ 및 선형 증폭 (Linear-Amplification-Mediated) PCR ^7을 포함한 제한 효소 기반 통합 사이트 분석이 가장 널리 사용됩니다. 그러나 현장 특이적인 제한 효소의 사용은 IS 검색 중에 편향을 일으키고, 제한 효소 근처에서 통합 될 하위 집합 (숙주 게놈에 통합 된 외래 DNA) 만 회수 할 수 있습니다 ⁴ . 최근에 벡터 IS를보다 종합적으로 평가하는 분석 기술이 도입되었습니다. 이러한 분석법은 Mu transposon-mediated PCR ⁸ , 비 제한적 (nr) -LAM PCR ⁹ , type-II 제한 효소 -mediated digestion ¹⁰ , mechanical shearing ¹¹ , random hexamer-based PCR (Re-free PCR) ¹² 를 사용하여 게놈 DNA를 단편화하고 IS를 증폭합니다. 현재의 기술은 다양한 수준의 검출 감도, 게놈 범위, 표적 특이성, 높은 처리량, 분석 절차의 복잡성 및 표적 부위의 상대적 빈도를 검출하는 편향을 가지고 있습니다. 기존의 분석법의 다양한 특성과 이들이 사용될 수있는 다양한 목적을 고려할 때 최적의 분석법을 신중하게 선택해야합니다.

이 작업은 통합 표적 DNA의 IS 업스트림 및 다운 스트림을 동시에 분석함으로써 검출 속도 및 서열 정량 정확도를 크게 향상시키는 양방향 분석을위한 자세한 실험 절차 및 컴퓨터 데이터 분석 워크 플로우를 제공합니다 (그림 1의 분석 절차 개요도 참조). ). 이 방법은 또한레트로 바이러스 통합 과정을 특성화하는 수단 (예 : 표적 부위 복제의 정확도 및 상류 및 하류 삽입의 게놈 서열 변화). 다른 양방향 방법은 표적 DNA ^{11 , 13 , 14} 의 양 끝을 복제하고 시퀀싱하기 위해 주로 사용되었습니다. 이 분석법은 잘 확립 된 LM-PCR 방법 및 전산 해석 매핑을 사용하고 상류 및 하류 접합을 정량화하기 위해 벡터 표시 클론의 고효율 및 재현성 정량을 위해 광범위하게 최적화되어 있습니다. TaqαI 효소의 양방향 분석은 줄기 세포 유전자 치료 전임상 연구에서 높은 처리량 클론 정량화에 유용함이 입증되었다. 이 논문은 t를 두 배로하는 더 빈번한 커터 (RsaI / CviQI - motif : GTAC)를 사용하는 수정 된 방법을 기술한다그는 TaqαI에 기반한 분석에 비해 integromes를 검출 할 가능성이 있다. 렌티 바이러스 (NL4.3 및 그 유도체) 및 감마 - 레트로 바이러스 (pMX 벡터) 벡터 IS 분석을위한 GTAC 모티프 효소를 사용하는 상세한 실험 및 데이터 분석 절차가 기술되어있다. 분석에 사용 된 올리고 뉴클레오타이드는 표 1 에 열거되어있다. 보충 문서에는 IS 서열 분석을위한 사내 프로그래밍 스크립트가 제공됩니다.

프로토콜

1. 업스트림 (왼쪽) 및 다운 스트림 (오른쪽) - 접합 시퀀스 라이브러리 생성

1. DNA 링커 준비 :
   1. 100 μM LINKER_A oligos (최종 20 μM) 2 μL, 100 μM LINKER_B oligos (최종 20 μM) 2 μL, 5 M NaCl (최종 : 1M) 2 μL를 첨가하여 10 μL 링커 DNA 용액을 준비하고 PCR 튜브에 nuclease-free water 4 μL. 링커 시퀀스는 표 1 을 참조하십시오.
   2. PCR 장비에서 95 ° C에서 5 분 링커 DNA 솔루션을 품어, 실행 프로그램을 중지하고 PCR 장비 전원을 끕니다. 링커 DNA를 30 분 동안 천천히 식힌다. 링커 DNA 용액은 4 ° C에서 보관할 수 있습니다.
2. LTR 특이 적 비오틴 - 프라이머 신장 :
   1. UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 생체 내 에서의 게놈 DNA의 260/280 nm 값 및 DNA 농도를 결정합니다또는 시험 관내 실험. 1 ~ 2 μg의 샘플 게놈 DNA를 nuclease-free water를 사용하여 170 μL의 게놈 DNA 용액으로 희석합니다.
   2. 10 μM HIV-1 특이적인 biotin primers ( 표 1의 L - BP와 R - BP 각각 2.5 μL : 4 개의 lentivirus 특정 primers에 대한 총 10 μL), 10X 열 안정성 20 μL를 혼합하여 200 μL PCR 반응을 준비 DNA 중합 효소 완충액, 10 mM dNTP 4 μL (최종 : 각 dNTP 200 μM), 3 μL의 2.5 U / μL 열 안정성 DNA 중합 효소 및 163 μL의 게놈 DNA.
      참고 : gammaretroviral 벡터 (pMX 벡터)의 경우 위의 4 가지 HIV-1 특이 적 비오틴 프라이머 대신 2 개의 10 μM pMX 특이 적 비오틴 프라이머 (L-BP 및 R-BP : 총 10 μL)를 각각 5 μL 사용하십시오.
   3. 용액을 4 개의 PCR 튜브 (각 50 μL)로 나누고 다음 조건 하에서 단일 확장 사이클을 수행하십시오 : 94 ° C 5 분, 56 ° C 3 분, 72 ° C 5 °분, 보관시 4 ℃.
   4. 2 ML microcentrifuge 튜브에 모든 4 PCR 반응을 풀과 PCR 정화 키트의 PCR 정화 절차를 따르십시오. 용출 완충액 (키트에 제공된 5 배수 희석 용리 완충액) 50 μL로 용출시킨다. 즉시 1.3.1 단계로 진행하거나 용출 된 DNA를 -20 ° C에 보관하십시오.
3. RsaI 및 CviQI 분해
   1. 50 μL의 DNA (1.2.4 단계), 10 μL의 완충액 A 10 μL 및 RsaI 효소 2 μL (20 U)를 첨가하여 100 μL 소화 반응을 준비하십시오. 37 ℃에서 1 시간 동안 PCR 장비에서 배양하십시오.
   2. 반응에 CviQI 효소 1 μL (10 U)를 첨가하고 PCR 장비에서 30 분 동안 25 ° C에서 배양하십시오. 즉시 1.4.1 단계로 진행하십시오.
4. 무딘 결말 :
   1. 2.5 μL의 DNA 중합 효소 I 대형 (클레 노우) 단편과 10 mM dNTP 2 μL가 들어있는 4.5 μL 혼합물을 준비하십시오. 전송 181; L 혼합물을 단계 1.3.2의 DNA 샘플에 첨가 하였다. 총 부피는 102 μL입니다. vortexing으로 잘 혼합하고 25 ℃에서 1 시간 동안 PCR 장비에서 배양한다. 즉시 1.6.1 단계로 진행하십시오.
5. 스트렙 트 아비딘 비드의 제조 :
   1. 간단히 스트렙 타비 딘 비드 용액을 보텍스하고 새로운 2 mL 미세 원심 분리 튜브에 50 μL를 옮긴다. 자성 스탠드를 사용하여 뜨는을 제거하고 바인딩 솔루션 200 μL로 구슬을 씻으십시오.
   2. 100 μL의 구속 용액에 구슬을 Resuspend하고 자기 스탠드에서 멀리 튜브를 놓으십시오. 즉시 1.6.1 단계로 진행하십시오.
6. 스트렙 타비 딘 비드 결합 :
   1. 100 μL의 샘플 DNA (단계 1.4.1)를 100 μL 재 현탁 비드 용액 (단계 1.5.2)으로 옮기고 용액의 거품이 발생하지 않도록 pipetting으로 조심스럽게 혼합하십시오. 튜브를 회전 바퀴 또는 롤러에서 3 시간 동안 상온에서 인큐하십시오.
   2. 자성 스탠드를 사용하여 구슬을 캡처하고 뜨는을 폐기하십시오. 400 μl의 세척 용액에서 두 번 구슬을 씻고 400 μl에서 1 x T4 DNA 리가 아제 완충액 (nuclease-free 물을 사용하여 10 배 용액에서 희석)을 두 번 세척합니다.
   3. 200 μl의 1x T4 DNA 리가 제 완충액 (nuclease-free 물을 사용하여 10 배 용액에서 희석)에 비즈를 재현 탁하고 자성 스탠드에서 멀리 떨어 뜨려 놓으십시오. 즉시 1.7.1 단계로 진행하십시오.
7. 링커 라이 게이션 :
   1. DNA 링커 (단계 1.1.2) 0.5 μL, 10X T4 DNA ligase 버퍼 10 μL, 5X T4 DNA 리가 아제 버퍼 20 μL (25 % 폴리에틸렌을 포함)의 혼합하여 2 ML microcentrifuge 튜브에 400 μL의 연결 반응 솔루션을 준비 글리콜), 5 μL의 T4 DNA 리가 제, 164.5 μL의 핵산 분해 효소가없는 물, 200 μL의 재현 완충액 (단계 1.6.3). 반응 튜브를 회전 바퀴에 놓고 RT (22 ° C)에서 3 시간 (또는 16 ° CO / N) 동안 배양합니다.
   2. 비드를 세척 용액으로 두 번 씻고 자성 스탠드를 사용하여 1X 열 안정성 DNA 중합 효소 완충액 (nuclease-free 물을 사용하여 10 배 용액에서 희석)으로 두 번 씻으십시오.
   3. 1x 열 안정성 DNA 중합 효소 PCR 버퍼 50 μL에 구슬을 Resuspend하고 자기 스탠드에서 멀리 놓으십시오. 즉시 1.8.1 단계로 진행하거나 최대 4 일 동안 하루 동안 저장하십시오.
8. 왼쪽과 오른쪽 접합 DNA 모두의 사전 증폭 :
   1. 10 μM 1L - 프라이머 10 μL, 10 μM 1R - 프라이머 10 μL, 10 μM 프라이머 Link1 (표 1) 20 μL, 10X 열 안정성 DNA 중합 효소 버퍼 10 μL, 4 μL의 10 μL를 추가하여 200 μL PCR 반응을 준비합니다 단계 1.7.3에서 재현 된 구슬 (50 μL)에 10 mM dNTPs (최종 : 각 dNTP 200 μM), 8 μL (20 U) 열 안정성 DNA 중합 효소 및 88 μl의 nuclease없는 물을 넣었다.
   2. 반응 혼합물을 4 개의 PCR 튜브 (각 50 개1, L)로하고 다음 조건으로 PCR을 수행한다 : 94 ℃에서 2 분간 배양; 94 ℃에서 20 초, 56 ℃에서 25 초, 72 ℃에서 2 분의 25 사이클; 마지막 연장은 72 ℃에서 5 분간이다.
   3. 2 ML microcentrifuge 튜브에 모든 4 PCR 반응을 풀링하고 PCR 정화 키트의 PCR 정화 절차를 따르십시오. 용리 완충액 50 μL로 용출시킨다.
   4. UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도와 260 / 280nm 값을 결정합니다. DNA는 다음 단계를 준비 ​​할 때까지 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다. 1.9.1 / 1.10.1 단계 (선택 사항)로 진행하거나 1.11.1 / 1.12.1 단계로 직접 진행하십시오.
9. 왼쪽 내부 DNA amplicon 제거 (옵션) :
   1. 1.8.4 단계에서 100 ng의 PCR DNA 제품을 2 mL microcentrifuge tube에 옮기고 nuclease가없는 물을 사용하여 10 μL로 부피를 조정하십시오.
   2. 좌측의 내부 D를 특이 적으로 표적으로하는 제한 효소 반응을 준비한다NA 증폭 물.
      참고 : 반응 조건은 효소의 선택에 따라 다를 수 있습니다. 예를 들어, NL4.3 기반 lentiviral 벡터에서 왼쪽 내부 DNA를 제거하면 1 μL의 pvuII , 2 μL 버퍼 B, 7 μL의 nuclease없는 물을 추가합니다. 37 ℃에서 1 시간 동안 PCR 장비에서 배양하십시오. 즉시 1.11.1 단계로 진행하거나 -20 ° C에서 보관하십시오.
10. 오른쪽 내부 DNA amplicon 제거 (선택 사항) :
    1. 1.9.1 단계와 동일하게 진행하십시오.
    2. 오른쪽 내부 DNA amplicon을 대상으로 제한 효소 반응을 준비하십시오.
       참고 : 예를 들어, NL4.3 기반 렌티 바이러스 벡터에서 오른쪽 내부 DNA를 제거 할 때 1 μL의 sfoI , 2 μL의 완충액 B 및 7 μL의 핵산 분해 효소가없는 물을 첨가하십시오. 37 ℃에서 1 시간 동안 PCR 장비에서 배양하십시오. 즉시 1.12.1 단계로 진행하거나 -20 ° C에서 보관하십시오.
11. 왼쪽접합 관련 증폭 :
    1. 단계 1.8.4 (또는 선택 단계 1.9.2)에서 DNA 5 μL, 10 μM 2L - 프라이머 (최종 1 μM) 5 μL, 10 μM 프라이머 Link2의 5 μL를 혼합하여 50 μL PCR 반응을 준비 (최종 : 1 μM), 5 μL의 10X 열 안정성 DNA 중합 효소 완충액, 1 μL의 10 mM dNTP (최종 : 각 dNTP 200 μM), 2 μL (5 U)의 열 안정성 DNA 중합 효소 및 27 μL의 nuclease- 물.
    2. 다음 조건으로 PCR을 실시하십시오 : 3 분 동안 94 ° C 배양; 94 ℃에서 20 초, 56 ℃에서 25 초, 72 ℃에서 2 분간의 8-15 사이클; 마지막 연장은 72 ℃에서 5 분간이다.
       참고 : 증폭 된 DNA는 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다. * 사이클 번호 최적화가 제안됩니다.
    3. PCR 정화 키트의 PCR 정화 절차를 따르십시오. 용리 완충액 50 μL로 용출시킨다. DNA 농도와 260/280 nm 값을 결정하십시오.
12. 오른쪽 접합 특정 증폭 :
    1. 모든 절차는 다른 프라이머의 사용을 제외하고는 "왼쪽 접합 특이 적 증폭"(단계 1.11.1-1.11.3)과 동일합니다. 이 단계에서 오른쪽 접합 특이적인 프라이머 (2R 프라이머, 표 1 참조)를 사용하십시오.
13. PCR amplicon 길이 변이 검정 :
    1. 2 % 아가 로스 겔 전기 영동 또는 모세관 전기 영동 ( 그림 2 )을 수행하여 PCR amplicon 길이 변화를 분석하십시오.
       참고 : 이것은 분석 절차의 완료를 확인하고 PCR 밴드 패턴을 기반으로 한 IS 패턴을 대략적으로 평가하는 데 필수적인 단계입니다. 1.11.3 및 1.12.3 단계의 정제 PCR 증폭 물은 다양한 DNA 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 고전 체인 - 터미네이션 (Sanger) 시퀀싱 또는 차세대 시퀀싱을위한 적절한 샘플 준비 절차를 진행하십시오. DNA는 -20 °에서 보관할 수 있습니다.;기음.

2. 전산 IS 시퀀스 분석

1. 데이터 파일 준비 :
   1. fasta 형식 시퀀스 데이터 파일 (보충 데이터의 Test_data.fa), 벡터 및 링커 시퀀스 검색 용 모티프 (보충 데이터의 Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv) 및 제한 효소 정보 용 tsv 파일의 세 가지 입력 데이터 파일 준비 (보충 데이터의 Enzyme.tsv).
      참고 :이 파일은 디 멀티플렉싱, 벡터 및 링커 시퀀스 트리밍 및 내부 벡터 시퀀스 제거에 필요합니다 ( 그림 3A ). 계산 워크 플로를 구현하기위한 자세한 단계별 지침은 추가 데이터의 README.txt 파일에 나와 있습니다.
2. 전산 분석 :
   1. demultiplexing 및 트리밍 스크립트를 실행하십시오.
      참고 : 원시 시퀀스는 역 다중화 및 트리밍을 위해 처리됩니다g의 벡터, 링커 및 프라이머 시퀀스 (추가 README.txt 파일의 STEP-1 참조).
   2. BLAST와 같은 정렬 도구 (BLAT; www.genome.ucsc.edu)를 사용하여 처리 명령을 참조 게놈에 매핑하려면 매핑 명령을 실행하십시오 (README.txt 파일의 STEP-2 참조).
   3. 정량적 IS 분석 스크립트를 실행하십시오 (README.txt 파일의 STEP-3 참조).
      참고 : 두 개의 출력 파일 (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt 및 Final_count.txt)이 생성됩니다. 매핑 및 시퀀스 열거 전략에 대한 자세한 내용은 보충 자료의 README.txt 파일과 이전 발행물 ^{2 , 15} 에 나와 있습니다.

결과

양방향 IS 분석은 상류 (왼쪽)와 하류 (오른쪽) 벡터 호스트 접합 ( 그림 2 ) 모두에 대해 서로 다른 크기의 PCR 증폭 물을 생성했습니다. PCR 증폭 물의 크기는 인테그람에서 상류와 하류에 가장 가까운 GTAC 모티프의 위치에 의존한다. 이 분석법은 또한 내부 DNA PCR 증폭 물을 생산 하였다 : 폴리펩티드 관 근처의 레트로 바이러스 서열 및 프라이머 결합 부...

토론

양방향 분석은 상류 (좌측) 및 하류 (우측) 벡터 - 숙주 DNA 결합 서열 모두의 동시 분석을 가능하게하며 다수의 유전자 치료, 줄기 세포 및 암 연구 응용에 유용하다. GTAC- 모티프 효소 (RsaI 및 CviQI) 및 양방향 PCR 접근법을 사용하면 이전의 TCGA- 모티프 ( TaqαI ) 효소 ( ^{2 , 15} 및 기타)와 비교할 때 인테그랄 (또는 클론 개체군)을 검출 할 가능성이...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermostable DNA polymerase	Agilent	600424	PicoMaxx Polymerase
Thermostable DNA polymerase buffer	Agilent	600424	PicoMaxx Polymerase buffer
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix	New England Biolabs	N0447L	dNTP solution mix (10 mM each)
PCR tubes	VWR International	53509-304	PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps
2 mL microcentrifuge tube	Molecular Bioproducts	3453	microcentrifuge tubes
PCR purification kit	Qiagen	28106
RsaI	New England Biolabs	R0167L	restriction enzyme
CviQI	New England Biolabs	R0639L	restriction enzyme
Buffer A	New England Biolabs	B7204S	NEB CutSmart buffer
DNA Polymerase I large (klenow) fragment	New England Biolabs	M0210L	Blunting
streptavidin beads solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
Binding Solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
Washing Solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
magnetic stand	ThermoFisher	12321D	DynaMag™-2 Magnet
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202L	T4 DNA ligase
10X T4 DNA ligase buffer	New England Biolabs	B0202S	T4 DNA ligase reaction buffer
5X T4 DNA ligase buffer	Invitrogen	46300-018	T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000
UV-Vis spectrophotometer	Fisher Scientific	S06497	Nanodrop 2000
pvuII	new England Biolabs	R0151L	restriction enzyme
sfoI	new England Biolabs	R0606L	restriction enzyme
Buffer B	new England Biolabs	B7203S	NEB buffer 3.1
Nuclease free water	Integrated DNA Technologies	11-05-01-14
Capillary electrophoresis	Qiagen	9001941	QIAxcel capillary electrophoresis
Veriti 96-well Fast Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4375305	PCR Instrument
Rotating wheel (or Roller)	Eppendorf	M10534004	Cell Culture Roller Drums
DNA size marker	Qiagen	929559	QX size marker (100 - 2,500 bp)
DNA size marker	Qiagen	929554	QX size marker (50 - 1,500 bp)
DNA alignment markers	Qiagen	929524	QX DNA Alignment Marker
genomc DNA	Not Available	Not Available	Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments