Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt die experimentelle Prozedur und Softwareanalyse für einen bidirektionalen Integrationsort-Assay, der gleichzeitig stromaufwärts und nachgeschaltete Vektor-Host-Junction-DNA analysieren kann. Bidirektionale PCR-Produkte können für jede nachgeschaltete Sequenzplattform eingesetzt werden. Die resultierenden Daten sind nützlich für einen hochdurchsatzreichen, quantitativen Vergleich von integrierten DNA-Targets.

Zusammenfassung

Integration Site (IS) Assays sind ein kritischer Bestandteil der Studie der retroviralen Integrationsstellen und ihrer biologischen Bedeutung. In den letzten retroviralen Gentherapie-Studien wurden IS-Assays in Kombination mit der Sequenzierung der nächsten Generation als Zell-Tracking-Tool verwendet, um klonale Stammzellpopulationen zu charakterisieren, die das gleiche IS teilen. Für den genauen Vergleich von repopulierenden Stammzellklonen innerhalb und über verschiedene Proben gehören die Nachweisempfindlichkeit, die Datenreproduzierbarkeit und die Hochdurchsatzkapazität des Assays zu den wichtigsten Assayqualitäten. Diese Arbeit bietet einen detaillierten Protokoll- und Datenanalyse-Workflow für die bidirektionale IS-Analyse. Der bidirektionale Assay kann gleichzeitig sowohl stromaufwärts als auch nachgeschaltete Vektor-Host-Übergänge abbilden. Im Vergleich zu konventionellen unidirektionalen IS-Sequenzierungsansätzen verbessert der bidirektionale Ansatz die IS-Erkennungsraten und die Charakterisierung von Integrationsereignissen an beiden Enden von tEr zielt auf DNA. Die hier beschriebene Datenanalyse-Pipeline identifiziert und zählt identische IS-Sequenzen durch mehrere Vergleichsschritte, die IS-Sequenzen auf das Referenzgenom abbilden und Sequenzfehler bestimmen. Mit einem optimierten Assayverfahren haben wir vor kurzem die detaillierten Wiederholungsmuster von Tausenden von Hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Klonen nach Transplantation in Rhesusmakaken verabreicht und zeigen zum ersten Mal den genauen Zeitpunkt der HSC - Wiederbelegung und die funktionelle Heterogenität der HSCs in der Primasystem. Das folgende Protokoll beschreibt den Schritt-für-Schritt-experimentellen Prozedur- und Datenanalyse-Workflow, der identische IS-Sequenzen genau identifiziert und quantifiziert.

Einleitung

Retroviren setzen ihre genomische DNA in das Wirtsgenom an verschiedenen Stellen ein. Diese einzigartige Eigenschaft, die zur Entwicklung von Krebs und anderen Formen der viralen Pathogenese beitragen kann, hat den ironischen Vorteil, diese Viren für die Zelltherapie für die Gentherapie und die Grundlagenforschung zugänglich zu machen. Die virale Integrationsstelle (IS) - der Standort auf dem Wirtsgenom, in dem eine fremde DNA (Virus) integriert ist - hat wichtige Implikationen für das Schicksal sowohl der integrierten Viren als auch der Wirtszellen. IS-Assays wurden in verschiedenen biologischen und klinischen Forschungsstufen verwendet, um die retrovirale Integrationssortierung und -pathogenese, die Krebsentwicklung, die Stammzellbiologie und die Entwicklungsbiologie ^{1 , 2 , 3 , 4 zu} untersuchen. Niedrige Erkennungsempfindlichkeit, schlechte Datenreproduzierbarkeit und häufige Kreuzkontamination gehören dazuDie Schlüsselfaktoren, die die Anwendung von IS-Assays auf aktuelle und geplante Studien beschränken.

Es wurden viele IS-Analysetechnologien entwickelt. Restriktionsenzym-basierte Integrationsstellen-Assays, einschließlich Linker-vermittelte (LM) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ⁵ , inverse PCR ⁶ und Linear-Amplification-Mediated (LAM) PCR ⁷ , sind die am häufigsten verwendeten. Die Verwendung von ortsspezifischen Restriktionsenzymen erzeugt jedoch während des Abrufs des IS eine Vorspannung, die nur eine Teilmenge von Integromen (eine in das Wirtsgenom integrierte Fremd-DNA) in der Nähe der zu erholenden Restriktionsstelle erlaubt. In den letzten Jahren wurden auch Assay-Technologien eingeführt, die den Vektor IS umfassender beurteilen. Diese Assays verwenden verschiedene Strategien, einschließlich Mu transposonvermittelter PCR ⁸ , nichtrestriktives (nr) -LAM PCR ⁹ , Typ-II Restriktionsenzym-mDer abgetrennte Verdauung ¹⁰ , die mechanische Scherung ¹¹ und die zufällige Hexamer-basierte PCR (Re-free PCR) ¹² , um genomische DNAs zu zersplittern und IS zu verstärken. Die derzeitigen Technologien weisen unterschiedliche Erfassungsempfindlichkeiten, die Genomabdeckung, die Zielspezifität, die hohe Durchsatzkapazität, die Komplexität der Assayverfahren und die Vorspannung bei der Erfassung der relativen Frequenzen von Zielstellen auf. Angesichts der unterschiedlichen Qualitäten der vorhandenen Assays und der Vielfalt der Zwecke, für die sie verwendet werden können, sollte der optimale Assay-Ansatz sorgfältig ausgewählt werden.

Diese Arbeit liefert detaillierte experimentelle Verfahren und einen rechnerischen Datenanalyse-Workflow für einen bidirektionalen Assay, der die Erkennungsraten und die Sequenzquantifizierungsgenauigkeit durch gleichzeitiges Analysieren des IS stromaufwärts und stromabwärts der integrierten Ziel-DNA signifikant verbessert (siehe Abbildung 1 für eine schematische Ansicht der Assay-Verfahren ). Dieser Ansatz bietet auchS die Mittel, um den retroviralen Integrationsprozess zu charakterisieren (z. B. die Treue der Zielortduplikation und Variationen in den genomischen Sequenzen von Upstream- und Downstream-Insertionen). Andere bidirektionale Verfahren wurden hauptsächlich für die Klonierung und Sequenzierung beider Enden der Ziel-DNA ^{11 , 13 , 14} verwendet. Dieser Assay ist weitgehend optimiert für die Hochdurchsatz- und reproduzierbare Quantifizierung von Vektor-markierten Klonen unter Verwendung des etablierten LM-PCR-Verfahrens und der Rechenanalyse-Mapping und zur Quantifizierung sowohl der Upstream- als auch der Downstream-Junctions. Die bidirektionale Analyse mit dem TaqαI-Enzym hat sich für die Hochgeschwindigkeits-Clonal-Quantifizierung in der präklinischen Studie der Stammzell-Gentherapie als nützlich erwiesen ^{2 , 15} . Dieses Papier beschreibt eine modifizierte Methode mit einem häufiger Cutter (RsaI / CviQI - Motiv: GTAC), die t verdoppeltEr schätzt die Integrome im Vergleich zu einem TaqαI-basierten Assay . Detaillierte experimentelle und Datenanalyseverfahren, die GTAC-Motivenzyme für lentivirale (NL4.3 und ihre Derivate) und gamma-retrovirale (pMX-Vektoren) Vektor-IS-Analyse verwenden, werden beschrieben. Die in dem Assay verwendeten Oligonukleotide sind in Tabelle 1 aufgelistet. In dem ergänzenden Dokument ist ein eigenständiges Programmierskript für die IS-Sequenzanalyse enthalten.

Protokoll

1. Upstream (links) - und nachgeschaltete (rechts) -Funktionssequenzbibliotheken erzeugen

1. DNA-Linker-Präparation:
   1. Eine 10 & mgr; l Linker-DNA-Lösung wird durch Zugabe von 2 & mgr; l 100 & mgr; M LINKER_A-Oligos (endgültig: 20 & mgr; M), 2 & mgr; l 100 & mgr; M LINKER_B-Oligos (endgültig: 20 & mgr; M), 2 & mgr; l 5 M NaCl (endgültig: 1 M) 4 μl nukleasefreies Wasser in einem PCR-Röhrchen. Siehe Tabelle 1 für die Linker-Sequenzen.
   2. Inkubieren Sie die Linker-DNA-Lösung bei 95 ° C für 5 min in einem PCR-Instrument, stoppen Sie das laufprogramm und schalten Sie das PCR-Instrument aus. Lassen Sie die Linker-Lösung in das Instrument für 30 min, um langsam abkühlen die Linker-DNA. Die Linker-DNA-Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden.
2. LTR-spezifische Biotin-Primer-Erweiterung:
   1. Verwenden Sie ein UV-Vis-Spektrophotometer, um die DNA-Konzentration und 260/280 nm-Werte der genomischen DNA aus in vivo zu bestimmenOder in vitro Experimente Verdünnen Sie 1-2 μg Probe genomische DNA auf ein Endvolumen von 170 μl genomischer DNA-Lösung unter Verwendung von nukleasefreiem Wasser.
   2. Eine 200 & mgr; l PCR-Reaktion durch Mischen von 2,5 & mgr; l von jeweils 10 & mgr; M HIV-1-spezifischen Biotin-Primern (L-BPs und R-BPs in Tabelle 1 : insgesamt 10 & mgr; l für vier Lentivirus-spezifische Primer), 20 & mgr; l 10X-Thermostabilität, DNA-Polymerasepuffer, 4 & mgr; l 10 mM dNTPs (endgültig: 200 & mgr; M von jedem dNTP), 3 & mgr; l 2,5 U / & mgr; l thermostabile DNA-Polymerase und 163 & mgr; l genomische DNA.
      HINWEIS: Für gammaretrovirale Vektoren (pMX-Vektoren) verwenden Sie jeweils 5 μl von jeweils 10 μM pMX-spezifischen Biotin-Primern (L-BP und R-BP: insgesamt 10 μl) anstelle der vier HIV-1-spezifischen Biotin-Primer oben.
   3. Teilen Sie die Lösung in vier PCR-Röhrchen (jeweils 50 μl) und führen Sie einen einzigen Extensionszyklus unter folgenden Bedingungen durch: 94 ° C für 5 min, 56 ° C für 3 min, 72 ° C für 5Min und 4 ° C für die Lagerung.
   4. Pool alle vier PCR-Reaktionen in ein 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen und folgen dem PCR-Reinigungsverfahren des PCR-Reinigungskits. Mit 50 μl Elutionspuffer (5-fach wasserverdünnter Elutionspuffer im Kit) eluieren. Gehen Sie sofort mit Schritt 1.3.1 vor oder lagern Sie die eluierte DNA bei -20 ° C.
3. RsaI und CviQI Verdauung
   1. Eine 100 & mgr; l Verdauungsreaktion durch Zugabe von 50 & mgr; l DNA (aus Schritt 1.2.4), 10 & mgr; l 10 × Puffer A und 2 & mgr; l (20 U) RsaI-Enzym vorbereiten. Inkubieren bei 37 ° C für 1 h in einem PCR-Instrument.
   2. 1 & mgr; l (10 U) CviQI-Enzym der Reaktion zugeben und bei 25 ° C für 30 min in einem PCR-Instrument inkubieren. Sofort mit Schritt 1.4.1 fortfahren
4. Stumpfes Ende:
   1. Vorbereitung einer 4,5-ul-Mischung, die 2,5 & mgr; l DNA-Polymerase I großes (Klenow) -Fragment und 2 & mgr; l 10 mM dNTPs enthält. Übertragung 181; L der Mischung zu der DNA-Probe aus Schritt 1.3.2. Das Gesamtvolumen beträgt 102 μl. Mischen Sie gut durch Vortexen und inkubieren bei 25 ° C für 1 h in einem PCR-Instrument. Sofort mit Schritt 1.6.1 fortfahren.
5. Herstellung von Streptavidinperlen:
   1. Die Streptavidin-Kügelchen-Lösung kurz vorwirbeln und 50 μl in ein neues 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Den Überstand mit dem Magnetständer entfernen und die Perlen mit 200 μl Bindungslösung waschen.
   2. Die Perlen in 100 & mgr; l Bindungslösung resuspendieren und das Röhrchen von dem Magnetständer wegführen. Sofort mit Schritt 1.6.1 fortfahren.
6. Streptavidin-Perlenbindung:
   1. Übertragen Sie 100 μl Proben-DNA (Schritt 1.4.1) auf die 100 μl re-suspendierte Perllösung (Schritt 1.5.2) und mischen Sie sorgfältig durch Pipettieren, um ein Schäumen der Lösung zu vermeiden. Das Röhrchen bei Raumtemperatur für 3 h auf einem rotierenden Rad oder einer Rolle inkubieren.
   2. Verwenden Sie den Magnetständer, um die Perlen zu fangen und den Überstand zu verwerfen. Waschen Sie die Kügelchen zweimal in 400 & mgr; l Waschlösung und zweimal in 400 & mgr; l 1x T4-DNA-Ligasepuffer (verdünnt aus 10facher Lösung unter Verwendung von nukleasefreiem Wasser).
   3. Die Perlen in 200 & mgr; l 1x T4-DNA-Ligasepuffer (verdünnt aus 10X-Lösung unter Verwendung von nukleasefreiem Wasser) resuspendieren und von dem magnetischen Stand wegführen. Sofort mit Schritt 1.7.1 fortfahren.
7. Linker ligation:
   1. Eine 400 & mgr; l Ligationsreaktionslösung in einem 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen durch Mischen von 0,5 & mgr; l des DNA-Linkers (Schritt 1.1.2), 10 & mgr; l 10 × T4-DNA-Ligasepuffer, 20 & mgr; l 5 × T4-DNA-Ligasepuffer (enthaltend 25% Polyethylen) Glykol), 5 & mgr; l T4-DNA-Ligase, 164,5 & mgr; l nukleasefreies Wasser und 200 & mgr; l der wieder suspendierten Perlen (Schritt 1.6.3). Das Reaktionsrohr auf das rotierende Rad stellen und bei RT (22 ° C) für 3 h (oder 16 ° CO / N) inkubieren. Waschen Sie die Perlen zweimal mit der Waschlösung und zweimal mit 1X thermostabilem DNA-Polymerase-Puffer (verdünnt aus 10x Lösung unter Verwendung von nukleasefreiem Wasser) unter Verwendung des magnetischen Standes.
   2. Die Perlen in 50 μl 1x thermostabilem DNA-Polymerase-PCR-Puffer resuspendieren und vom magnetischen Stand ablegen. Sofort mit Schritt 1.8.1 fortfahren oder bei 4 ° C bis zu einem Tag lagern.
8. Vorverstärkung der linken und rechten Kreuzungs-DNA:
   1. Vorbereitung einer 200 & mgr; l PCR-Reaktion durch Zugabe von 10 & mgr; l 10 & mgr; M 1L-Primer, 10 & mgr; l 10 & mgr; M 1R-Primer, 20 & mgr; l des 10 & mgr; M-Primers Link1 (Tabelle 1), 10 & mgr; l 10X thermostabiler DNA-Polymerase-Puffer, 4 & mgr; l 10 mM dNTPs (endgültig: 200 & mgr; M von jedem dNTP), 8 & mgr; l (20 U) thermostabile DNA-Polymerase und 88 & mgr; l nukleasefreies Wasser zu den wieder suspendierten Perlen (50 & mgr; l) aus Schritt 1.7.3.
   2. Aliquot die Reaktionsmischung in 4 PCR-Röhrchen (jeweils 501; L) und Durchführung der PCR mit der folgenden Bedingung: 94 ° C Inkubation für 2 min; 25 Zyklen von 94 ° C für 20 s, 56 ° C für 25 s und 72 ° C für 2 min; Und eine endgültige Verlängerung bei 72 ° C für 5 min.
   3. Alle 4 PCR-Reaktionen in ein 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen bringen und dem PCR-Reinigungsverfahren des PCR-Reinigungskits folgen. Mit 50 μl Elutionspuffer eluieren
   4. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration und 260/280-nm-Werte mit einem UV-Vis-Spektrophotometer; Die DNA kann bei -20 ° C gelagert werden, bis sie für den nächsten Schritt fertig ist. Fahren Sie mit den Schritten 1.9.1 / 1.10.1 (optional) oder direkt mit den Schritten 1.11.1 / 1.12.1 fort.
9. Entfernen des linken internen DNA-Amplicons (optional):
   1. Übertragen Sie bis zu 100 ng PCR-DNA-Produkt aus Schritt 1.8.4 in ein 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie das Volumen auf 10 μl unter Verwendung von nukleasefreiem Wasser ein.
   2. Bereiten Sie eine Restriktionsenzymreaktion vor, die speziell auf die linke interne D abzieltNA amplicon
      HINWEIS: Die Reaktionsbedingungen können je nach Wahl des Enzyms abweichen. Zum Beispiel, wenn man die linke interne DNA von NL4.3-basierten lentiviralen Vektoren entfernt, fügen Sie 1 & mgr; l PvuII , 2 & mgr; l Puffer B und 7 & mgr; l nukleasefreies Wasser hinzu. Inkubieren bei 37 ° C für 1 h in einem PCR-Instrument. Sofort mit Schritt 1.11.1 oder bei -20 ° C aufbewahren.
10. Entfernen des rechtsseitigen internen DNA-Amplicons (optional):
    1. Gehen Sie wie in Schritt 1.9.1 vor.
    2. Bereiten Sie eine Restriktionsenzymreaktion vor, die speziell auf das rechtsseitige interne DNA-Amplicon abzielt.
       HINWEIS: Zum Beispiel, wenn man die rechtsseitige interne DNA aus NL4.3-basierten lentiviralen Vektoren entfernt, fügen Sie 1 μl sfoI , 2 μl Puffer B und 7 μl nukleasefreies Wasser hinzu. Inkubieren bei 37 ° C für 1 h in einem PCR-Instrument. Sofort mit Schritt 1.12.1 fortfahren oder bei -20 ° C lagern.
11. Links-junction-spezifische Verstärkung:
    1. Eine 50 μl PCR-Reaktion wird durch Mischen von 5 μl DNA aus Schritt 1.8.4 (oder aus dem optionalen Schritt 1.9.2), 5 μl 10 μM 2L-Primer (endgültig: 1 μM), 5 μl 10 μM Primer Link2, hergestellt (Endgültig: 1 μM), 5 μl 10x thermostabiler DNA-Polymerasepuffer, 1 μl 10 mM dNTPs (endgültig: 200 μM von jedem dNTP), 2 μl (5 U) thermostabile DNA-Polymerase und 27 μl nukleasefreies Wasser.
    2. Führen Sie die PCR mit der folgenden Bedingung aus: 94 ° C Inkubation für 3 min; 8-15 Zyklen von 94 ° C für 20 s, 56 ° C für 25 s und 72 ° C für 2 min; Und eine endgültige Verlängerung bei 72 ° C für 5 min.
       HINWEIS: Amplifizierte DNA kann bei -20 ° C gelagert werden. * Zykluszahl-Optimierung wird vorgeschlagen.
    3. Befolgen Sie das PCR-Reinigungsverfahren des PCR-Reinigungskits. Mit 50 μl Elutionspuffer eluieren Bestimmen Sie die DNA-Konzentration und 260/280 nm Werte.
12. rechtsübergangsspezifische verstärkung:
    1. Alle Verfahren sind identisch mit der "Links-Junction-spezifischen Verstärkung" (Schritte 1.11.1-1.11.3), mit Ausnahme der Verwendung verschiedener Primer; Verwenden Sie in diesem Schritt die rechtsverknüpfungsspezifische Primer (2R-Primer, siehe Tabelle 1 ).
13. PCR-Amplikon-Längenvariationstest:
    1. Analysieren Sie die PCR-Amplikon-Längenvariationen, indem Sie 2% Agarose-Gelelektrophorese oder Kapillarelektrophorese durchführen (Abbildung 2 ).
       HINWEIS: Dies ist ein wesentlicher Schritt, um den Abschluss der Assay-Verfahren zu bestätigen und eine grobe Bewertung von IS-Mustern auf der Grundlage der PCR-Bandmuster zu machen. Das gereinigte PCR-Amplicon aus den Schritten 1.11.3 und 1.12.3 kann für verschiedene DNA-Sequenzierungsplattformen verwendet werden. Gehen Sie mit den entsprechenden Probenvorbereitungsverfahren für die klassische Kettenabbruch- (Sanger-) Sequenzierung oder Sequenzierung der nächsten Generation vor. Die DNA kann bei -20 ° gelagert werdenC;

2. Berechnungs-IS-Sequenzanalyse

1. Vorbereitung der Datendateien:
   1. Vorbereiten von drei Eingabedatendateien: eine Fasta-Format-Sequenz-Datendatei (Test_data.fa in ergänzenden Daten), eine tsv-Datei für die Suchmotive für Vektor- und Linkersequenzen (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv in ergänzenden Daten) und eine tsv-Datei für Restriktionsenzyminformationen (Enzym.sv in ergänzenden Daten).
      HINWEIS: Diese Dateien sind zum Demultiplexen, Trimmen von Vektor- und Linkersequenzen und zum Entfernen interner Vektorsequenzen erforderlich (Abbildung 3A ). Detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Implementierung des rechnerischen Workflows finden Sie in der README.txt-Datei in den ergänzenden Daten.
2. Berechnungsanalyse:
   1. Führen Sie Demultiplex- und Trimm-Scripts aus.
      HINWEIS: Die Rohsequenz wird zum Demultiplexen und zum Trimmin verarbeitetG der Vektor-, Linker- und Primersequenzen (siehe STEP-1 in der ergänzenden README.txt-Datei).
   2. Führen Sie den Mapping-Befehl aus (siehe STEP-2 in der README.txt-Datei), um die verarbeiteten Sequenzen mit einem BLAST-ähnlichen Ausrichtungswerkzeug (BLAT; www.genome.ucsc.edu) auf das Referenzgenom abzubilden.
   3. Führen Sie das quantitative IS-Analyse-Skript aus (siehe STEP-3 in der Datei README.txt).
      HINWEIS: Es werden zwei Ausgabedateien (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt und Final_count.txt) erzeugt. Weitere Details zu Mapping- und Sequenz-Enumerationsstrategien finden Sie in der Datei "README.txt" in den ergänzenden Daten und in den vorherigen Publikationen ^{2 , 15} .

Ergebnisse

Der bidirektionale IS-Assay erzeugte verschiedene Größen von PCR-Amplicons sowohl für die stromaufwärts (links) als auch für den stromabwärtigen (rechten) Vektor-Host-Übergang (Abbildung 2 ). Die Größe eines PCR-Amplicons hängt von der Lage des nächsten GTAC-Motivs stromaufwärts und stromabwärts von einem Integrom ab. Der Assay erzeugte auch interne DNA-PCR-Amplifikate: retrovirale Sequenzen in der Nähe des Polypurintrakts und der Primerbindung...

Diskussion

Der bidirektionale Assay ermöglicht die gleichzeitige Analyse sowohl der vorgelagerten (links) als auch der stromabwärtigen (rechten) Vektor-Host-DNA-Junktionssequenzen und ist in einer Anzahl von Gentherapie-, Stammzell- und Krebsforschungsanwendungen nützlich. Die Verwendung von GTAC-Motiv-Enzymen (RsaI und CviQI) und der bidirektionale PCR-Ansatz verbessern signifikant die Chancen, eine Integrome (oder eine klonische Population) im Vergleich zu früheren TCGA-Motiv-Enzymen (TaqαI) -basierten Assays

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermostable DNA polymerase	Agilent	600424	PicoMaxx Polymerase
Thermostable DNA polymerase buffer	Agilent	600424	PicoMaxx Polymerase buffer
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix	New England Biolabs	N0447L	dNTP solution mix (10 mM each)
PCR tubes	VWR International	53509-304	PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps
2 mL microcentrifuge tube	Molecular Bioproducts	3453	microcentrifuge tubes
PCR purification kit	Qiagen	28106
RsaI	New England Biolabs	R0167L	restriction enzyme
CviQI	New England Biolabs	R0639L	restriction enzyme
Buffer A	New England Biolabs	B7204S	NEB CutSmart buffer
DNA Polymerase I large (klenow) fragment	New England Biolabs	M0210L	Blunting
streptavidin beads solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
Binding Solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
Washing Solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
magnetic stand	ThermoFisher	12321D	DynaMag™-2 Magnet
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202L	T4 DNA ligase
10X T4 DNA ligase buffer	New England Biolabs	B0202S	T4 DNA ligase reaction buffer
5X T4 DNA ligase buffer	Invitrogen	46300-018	T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000
UV-Vis spectrophotometer	Fisher Scientific	S06497	Nanodrop 2000
pvuII	new England Biolabs	R0151L	restriction enzyme
sfoI	new England Biolabs	R0606L	restriction enzyme
Buffer B	new England Biolabs	B7203S	NEB buffer 3.1
Nuclease free water	Integrated DNA Technologies	11-05-01-14
Capillary electrophoresis	Qiagen	9001941	QIAxcel capillary electrophoresis
Veriti 96-well Fast Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4375305	PCR Instrument
Rotating wheel (or Roller)	Eppendorf	M10534004	Cell Culture Roller Drums
DNA size marker	Qiagen	929559	QX size marker (100 - 2,500 bp)
DNA size marker	Qiagen	929554	QX size marker (50 - 1,500 bp)
DNA alignment markers	Qiagen	929524	QX DNA Alignment Marker
genomc DNA	Not Available	Not Available	Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments