Site d'intégration bidirectionnel Retroviral Méthodologie PCR et analyse de données quantitatives Workflow

Résumé

Ce manuscrit décrit la procédure expérimentale et l'analyse de logiciel pour un test de site d'intégration bidirectionnelle qui peut analyser simultanément l'ADN de jonction vecteur-hôte en amont et en aval. Les produits de PCR bidirectionnels peuvent être utilisés pour toute plate-forme de séquençage en aval. Les données résultantes sont utiles pour une comparaison quantitative à haut débit des cibles intégrées d'ADN.

Résumé

Les analyses du site d'intégration (IS) sont une composante essentielle de l'étude des sites d'intégration rétroviraux et leur importance biologique. Dans les récentes études de thérapie génique rétrovirale, les tests IS, en combinaison avec le séquençage de la prochaine génération, ont été utilisés comme outil de suivi des cellules pour caractériser les cellules clonales de cellules souches partageant le même IS. Pour la comparaison précise de la réapprovisionnement de clones de cellules souches à l'intérieur et à travers différents échantillons, la sensibilité de détection, la reproductibilité des données et la capacité à haut débit de l'analyse sont parmi les qualités d'analyse les plus importantes. Ce travail fournit un protocole détaillé et un workflow d'analyse de données pour l'analyse IS bidirectionnelle. Le dosage bidirectionnel peut simultanément séquencer les jonctions vecteur-hôte en amont et en aval. Par rapport aux approches de séquençage IS unidirectionnelles conventionnelles, l'approche bidirectionnelle améliore considérablement les taux de détection IS et la caractérisation des événements d'intégration aux deux extrémités de tIl cible l'ADN. Le pipeline d'analyse de données décrit ici identifie et énumère avec précision des séquences IS identiques à travers plusieurs étapes de comparaison qui mettent en place des séquences IS dans le génome de référence et déterminent les erreurs de séquençage. En utilisant une procédure de dosage optimisée, nous avons récemment publié les modèles de repeuplement détaillés de milliers de clones de cellules souches hématopoïétiques (HSC) après transplantation dans des macaques rhésus, démontrant pour la première fois le point précis du repopulation HSC et l'hétérogénéité fonctionnelle des HSC dans le Système de primates. Le protocole suivant décrit la procédure expérimentale étape par étape et le flux de travail d'analyse de données qui identifie et quantifie précisément les séquences IS identiques.

Introduction

Les rétrovirus insèrent leur ADN génomique dans le génome hôte dans différents sites. Cette propriété unique, qui peut contribuer au développement de cancers et d'autres formes de pathogenèse virale, a l'avantage ironique de rendre ces virus hautement accessibles à l'ingénierie cellulaire pour la thérapie génique et la recherche biologique de base. Le site d'intégration virale (IS) - l'emplacement sur le génome hôte où un ADN étranger (virus) est intégré - a des implications importantes pour le sort des virus intégrés et des cellules hôtes. Les tests IS ont été utilisés dans divers contextes de recherche biologique et clinique pour étudier la sélection et la pathogenèse du site d'intégration rétrovirale, le développement du cancer, la biologie des cellules souches et la biologie du développement ^{1 , 2 , 3 , 4} . Une faible sensibilité à la détection, une faible reproductibilité des données et une contamination croisée fréquente sont parmiLes facteurs clés limitant les applications des tests IS aux études actuelles et planifiées.

De nombreuses technologies d'analyse IS ont été développées. Les essais sur le site d'intégration à base d'enzyme à restriction, y compris la réaction en chaîne par polymérase (PCR) ⁵ , la PCR inverse ⁶ et la PCR ⁷ à médiation par amplification linéaire (LAM), sont les plus utilisés. L'utilisation d'enzymes de restriction spécifiques au site, cependant, génère un biais lors de la récupération de l'IS, permettant seulement un sous-ensemble d'intégres (un ADN étranger intégré dans le génome de l'hôte) au voisinage du site de restriction à récupérer ⁴ . Des technologies d'analyse qui permettent d'évaluer plus largement le vecteur IS ont également été introduites ces dernières années. Ces essais utilisent diverses stratégies, y compris la PCR ⁸ à médiation par transposon de Mu, non restrictive (nr) -LAM PCR ⁹ , enzyme de restriction de type II-mLa digestion éditée ¹⁰ , le cisaillement mécanique ¹¹ et la PCR à l'hexamère aléatoire (Re-free PCR) ¹² , pour fragmenter les ADN génomiques et amplifier l'IS. Les technologies actuelles ont différents niveaux de sensibilité à la détection, la couverture du génome, la spécificité cible, la capacité à haut débit, la complexité des procédures d'analyse et les biais dans la détection des fréquences relatives des sites cibles. Étant donné les différentes qualités des analyses existantes et la variété des buts pour lesquels elles peuvent être utilisées, l'approche d'analyse optimale doit être soigneusement sélectionnée.

Ce travail fournit des procédures expérimentales détaillées et un flux de travail d'analyse de données de calcul pour un test bidirectionnel qui améliore de manière significative les taux de détection et la précision de la quantification des séquences en analysant simultanément l'IS en amont et en aval de l'ADN cible intégré (voir la figure 1 pour une vue schématique des procédures de dosage ). Cette approche fournit égalementS le moyen de caractériser le processus d'intégration rétrovirale (par exemple, la fidélité à la duplication du site cible et les variations dans les séquences génomiques des insertions en amont et en aval). D'autres méthodes bidirectionnelles ont été utilisées principalement pour le clonage et le séquençage des deux extrémités de l'ADN cible ^{11 , 13 , 14} . Ce test est largement optimisé pour la quantification à haut débit et reproductible des clones vectorisés, en utilisant la méthode LM-PCR et la cartographie de l'analyse calculée, ainsi que pour la quantification des jonctions amont et aval. L'analyse bidirectionnelle avec l'enzyme TaqαI s'est révélée utile pour la quantification clonale à haut débit dans les études précliniques de thérapie génique de cellules souches ^{2 , 15} . Cet article décrit une méthode modifiée utilisant un coupeur plus fréquent (RsaI / CviQI - motif: GTAC) qui doubleIl existe des chances de détecter des globules par rapport à un dosage basé sur TaqαI . Des procédures détaillées d'analyse expérimentale et de données qui utilisent des enzymes de motifs GTAC pour les lentiviraux (NL4.3 et ses dérivés) et les analyses gamma-rétrovirales (vecteurs pMX) IS sont décrites. Les oligonucleotides utilisés dans le dosage sont listés dans le tableau 1 . Un script de programmation interne pour l'analyse de séquence IS est fourni dans le document complémentaire.

Protocole

1. Génération des bibliothèques de séquences en amont (à gauche) et en aval (droite)

1. Préparation ADN linker:
   1. Préparez une solution d'ADN de liaison de 10 μL en ajoutant 2 μL d'oligos LINKER_A 100 μM (finale: 20 μM), 2 μL d'oligos LINKER_B 100 μM (finale: 20 μM), 2 μL de NaCl 5 M (finale: 1 M) et 4 μl d'eau exempte de nuclease dans un tube PCR. Voir le tableau 1 pour les séquences de liaison.
   2. Incuber la solution d'ADN linker à 95 ° C pendant 5 minutes dans un instrument de PCR, arrêter le programme de course et éteindre l'instrument de PCR. Laissez la solution de liaison dans l'instrument pendant 30 minutes pour refroidir lentement l'ADN du lieur. La solution d'ADN de liaison peut être stockée à 4 ° C.
2. Extension de biotine-amorce spécifique au LTR:
   1. Utiliser un spectrophotomètre UV-Vis pour déterminer la concentration d'ADN et les valeurs 260/280 nm de l'ADN génomique in vivoOu des expériences in vitro . Diluer 1-2 μg d'échantillon d'ADN génomique à un volume final de 170 μL de solution d'ADN génomique en utilisant de l'eau exempte de nuclease.
   2. Préparer une réaction de PCR de 200 μl en mélangeant 2,5 μL chacun des amorces de biotine spécifiques au VIH-1 10 μM (L-BP et R-BP dans le tableau 1 : total de 10 μL pour quatre amorces spécifiques au lentivirus), 20 μL de 10X thermostable Le tampon ADN polymérase, 4 μL de dNTP 10 mM (final: 200 μM de chaque dNTP), 3 μL d'ADN polymerase thermostable 2,5 U / μL et 163 μL d'ADN génomique.
      NOTE: Pour les vecteurs gammarérovirales (vecteurs pMX), utiliser 5 μL chacun des deux amorces de biotine spécifiques à la pMX 10 μM (L-BP et R-BP: total de 10 μL) au lieu des quatre amorces de biotine spécifiques au VIH-1 ci-dessus.
   3. Divisez la solution en quatre tubes de PCR (chaque 50 μL) et effectuez un seul cycle d'extension dans les conditions suivantes: 94 ° C pendant 5 min, 56 ° C pendant 3 min, 72 ° C pour 5Min, et 4 ° C pour le stockage.
   4. Collez les quatre réactions de PCR dans un tube de microcentrifugeuse de 2 mL et suivez la procédure de purification par PCR du kit de purification par PCR. Eluir avec 50 μL de tampon d'élution (tampon d'élution 5 fois dilué à l'eau fourni dans le kit). Commencez immédiatement avec l'étape 1.3.1 ou stockez l'ADN élue à -20 ° C.
3. RsaI et CviQI digestion
   1. Préparer une réaction de digestion de 100 μl en ajoutant 50 μL d'ADN (à partir de l'étape 1.2.4), 10 μL de 10x tampon A et 2 μl (20 U) d'enzyme RsaI. Incuber à 37 ° C pendant 1 h dans un instrument de PCR.
   2. Ajouter 1 μL (10 U) d'enzyme CviQI à la réaction et incuber à 25 ° C pendant 30 minutes dans un instrument de PCR. Commencez immédiatement avec l'étape 1.4.1
4. Blunt ending:
   1. Préparez un mélange de 4,5 μL contenant 2,5 μL de fragment d'ADN Polymerase I large (klenow) et 2 μL de dNTP 10 mM. Transfert 181; L du mélange à l'échantillon d'ADN de l'étape 1.3.2. Le volume total sera de 102 μL. Bien mélanger en vortex et incuber à 25 ° C pendant 1 h dans un instrument de PCR. Commencez immédiatement avec l'étape 1.6.1.
5. Préparation des perles de streptavidine:
   1. En bref, tourbillonner la solution de talle de streptavidine et transférer 50 μL à un nouveau tube de microcentrifugeuse de 2 mL. Retirer le surnageant à l'aide du support magnétique et laver les perles avec 200 μL de solution de liaison.
   2. Remettre en suspension les perles dans 100 μl de solution de liaison et déposer le tube hors du support magnétique. Commencez immédiatement avec l'étape 1.6.1.
6. Reliure des talons de streptavidine:
   1. Transférer 100 μL d'échantillon d'ADN (étape 1.4.1) à la solution de bourrage ré-suspendue de 100 μl (étape 1.5.2) et mélanger soigneusement par pipettage pour éviter tout moussage de la solution. Incuber le tube à température ambiante pendant 3 h sur une roue rotative ou un rouleau.
   2. Utilisez le support magnétique pour capturer les perles et jeter le surnageant. Laver les billes deux fois dans 400 μl de solution de lavage et deux fois dans 400 μL de 1x T4 ADN ligase tampon (dilué à partir de solution 10X en utilisant de l'eau libre de nuclease).
   3. Remettre en suspension les perles dans 200 μl de tampon T4 ADN ligase (dilué à partir de la solution 10X en utilisant de l'eau exempte de nuclease) et l'éloigner du support magnétique. Commencez immédiatement avec l'étape 1.7.1.
7. Ligature du lieur:
   1. Préparer une solution de réaction de ligation de 400 μl dans un tube de microcentrifugeuse de 2 mL en mélangeant 0,5 μL du lieur d'ADN (étape 1.1.2), 10 μl de 10x T4 DNA Ligase, 20 μL de 5X T4 ADN ligase tampon (contenant 25% de polyéthylène Glycol), 5 μL d'ADN ligase T4, 164,5 μL d'eau libre de nuclease et 200 μL des billes ré-suspendues (étape 1.6.3). Placer le tube de réaction sur la roue rotative et incuber à la température ambiante (22 ° C) pendant 3 h (ou 16 ° CO / N).
   2. Laver les billes deux fois avec la solution de lavage et deux fois avec du tampon ADN polymerase thermostable 1X (dilué à partir de la solution 10x en utilisant de l'eau exempte de nuclease) en utilisant le support magnétique.
   3. Remettre en suspension les perles dans 50 μl de tampon de PCR d'ADN polymérase 1x thermostable et l'éloigner du support magnétique. Commencez immédiatement avec l'étape 1.8.1 ou conservez à 4 ° C pendant un jour.
8. Préamplification de l'ADN de la jonction gauche et droite:
   1. Préparer une réaction de PCR de 200 μl en ajoutant 10 μL d'amorce 1L 10 μM, 10 μl d'amorce 1R 10 μM, 20 μL de couche 1 d'amorce 10 μM (Tableau 1), 10 μl de tampon ADN polymérase 10X thermostable, 4 μL de DNTP 10 mM (finale: 200 μM de chaque dNTP), 8 μL (20 U) d'ADN polymérase thermostable, et 88 μL d'eau libre de nuclease aux billes ré-suspendues (50 μL) de l'étape 1.7.3.
   2. Aliquotez le mélange réactionnel en 4 tubes PCR (chacun 501; L) et effectuer la PCR avec la condition suivante: 94 ° C d'incubation pendant 2 min; 25 cycles de 94 ° C pendant 20 s, 56 ° C pendant 25 s et 72 ° C pendant 2 min; Et une extension finale à 72 ° C pendant 5 min.
   3. Collez les 4 réactions de PCR dans un tube de microcentrifugeuse de 2 mL et suivez la procédure de purification par PCR du kit de purification par PCR. Appliquer avec 50 μL de tampon d'élution.
   4. Déterminer la concentration d'ADN et les valeurs de 260/280 nm en utilisant un spectrophotomètre UV-Vis; L'ADN peut être stocké à -20 ° C jusqu'à ce qu'il soit prêt pour l'étape suivante. Procédez aux étapes 1.9.1 / 1.10.1 (facultatif) ou directement avec les étapes 1.11.1 / 1.12.1.
9. Retrait de l'amplicon d'ADN interne côté gauche (facultatif):
   1. Transférer jusqu'à 100 ng de produit d'ADN PCR de l'étape 1.8.4 à un tube de microcentrifugeuse de 2 mL et ajuster le volume à 10 μL en utilisant de l'eau exempte de nuclease.
   2. Préparez une réaction enzymatique de restriction ciblant spécifiquement le D intérieur interne gaucheNA amplicon.
      NOTE: L'état de la réaction peut varier en fonction du choix de l'enzyme. Par exemple, lors de l'élimination de l'ADN interne côté gauche des vecteurs lentiviraux à base de NL4.3, ajouter 1 μl de pvuII , 2 μL de tampon B et 7 μl d'eau exempte de nuclease. Incuber à 37 ° C pendant 1 h dans un instrument de PCR. Commencez immédiatement avec l'étape 1.11.1 ou conservez à -20 ° C.
10. Retrait de l'amplicon d'ADN interne côté droit (facultatif):
    1. Procédez de la même manière qu'à l'étape 1.9.1.
    2. Préparez une réaction enzymatique de restriction ciblant spécifiquement l'amplicon d'ADN interne côté droit.
       NOTE: Par exemple, lors de l'élimination de l'ADN interne du côté droit des vecteurs lentiviraux basés sur NL4.3, ajouter 1 μL de sfoI , 2 μL de tampon B et 7 μL d'eau exempte de nuclease. Incuber à 37 ° C pendant 1 h dans un instrument de PCR. Commencez immédiatement avec l'étape 1.12.1 ou conservez-la à -20 ° C.
11. La gaucheAmplification spécifique à la jonction:
    1. Préparer une réaction de PCR de 50 μl en mélangeant 5 μL d'ADN à partir de l'étape 1.8.4 (ou de l'étape facultative 1.9.2), 5 μL d'amorce 2L 10 μM (finale: 1 μM), 5 μL d'amorce μ μm μ2 (Finale: 1 uM), 5 μL de tampon ADN polymérase thermostable 10x, 1 μL de dNTP 10 mM (finale: 200 μM de chaque dNTP), 2 μL (5 U) d'ADN polymérase thermostable et 27 μL de nuclease-libre eau.
    2. Effectuer la PCR avec la condition suivante: 94 ° C d'incubation pendant 3 min; 8-15 cycles de 94 ° C pendant 20 s, 56 ° C pendant 25 s et 72 ° C pendant 2 min; Et une extension finale à 72 ° C pendant 5 min.
       NOTE: L'ADN amplifié peut être conservé à -20 ° C. * L'optimisation du nombre de cycles est suggérée.
    3. Suivre la procédure de purification par PCR du kit de purification par PCR. Appliquer avec 50 μL de tampon d'élution. Déterminer la concentration d'ADN et les valeurs de 260/280 nm.
12. Amplification spécifique de la jonction droite:
    1. Toutes les procédures sont identiques à "amplification spécifique à la jonction gauche" (étapes 1.11.1-1.11.3), à l'exception de l'utilisation de différentes amorces; Utiliser l'amorce spécifique à la jonction droite (2R-primer, voir tableau 1 ) dans cette étape.
13. Test de variation de longueur d'amplicon PCR:
    1. Analyser les variations de longueur d'amplicon de PCR en effectuant une électrophorèse sur gel d'agarose à 2% ou une électrophorèse capillaire ( Figure 2 ).
       NOTE: Il s'agit d'une étape essentielle pour confirmer l'achèvement des procédures d'analyse et pour une évaluation approximative des modèles IS en fonction des modèles de bande PCR. L'amplicon de PCR purifié à partir des étapes 1.11.3 et 1.12.3 peut être utilisé pour diverses plates-formes de séquençage d'ADN. Procédez avec les procédures de préparation d'échantillon appropriées pour le séquençage classique de la terminaison de la chaîne (Sanger) ou le séquençage de la prochaine génération. L'ADN peut être stocké à -20 °; C.

2. Analyse de séquence informatique IS

1. Préparation des fichiers de données:
   1. Préparez trois fichiers de données d'entrée: un fichier de données de séquence de format fasta (Test_data.fa dans des données supplémentaires), un fichier tsv pour les motifs de recherche pour les séquences vectorielles et de liaison (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv dans des données supplémentaires) et un fichier tsv pour l'information sur les enzymes de restriction (Enzyme.tsv dans les données supplémentaires).
      REMARQUE: ces fichiers sont nécessaires pour le démultiplexage, la coupe des séquences vectorielles et des liens, et la suppression des séquences vectorielles internes ( Figure 3A ). Des instructions détaillées étape par étape pour la mise en œuvre du flux de travail de calcul sont fournies dans le fichier README.txt dans les données supplémentaires.
2. Analyse computationnelle:
   1. Exécutez des scripts de démultiplexage et de recadrage.
      REMARQUE: la séquence brute sera traitée pour le démultiplexage et pour la coupeG du vecteur, du lieur et des séquences d'amorces (voir STEP-1 dans le fichier README.txt supplémentaire).
   2. Exécutez la commande de mappage (voir STEP-2 dans le fichier README.txt) pour mapper les séquences traitées sur le génome de référence à l'aide d'un outil d'alignement BLAST-like (BLAT; www.genome.ucsc.edu).
   3. Exécutez le script d'analyse IS quantitatif (voir STEP-3 dans le fichier README.txt).
      REMARQUE: Deux fichiers de sortie (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt et Final_count.txt) seront générés. Vous trouverez plus de détails sur la cartographie et les stratégies d'énumération des séquences dans le fichier README.txt dans les données supplémentaires et dans les publications précédentes ^{2 , 15} .

Résultats

L'essai IS bidirectionnel a généré différentes tailles d'amplicons de PCR pour les jonctions d'hôte vecteur amont (gauche) et aval (droite) ( Figure 2 ). La taille d'un amplicon de PCR dépend de l'emplacement du motif GTAC le plus proche en amont et en aval d'un integrome. L'essai a également produit des amplicons internes de PCR d'ADN: des séquences rétrovirales proches du tube de polypurine et le site de liaison de ...

Discussion

L'essai bidirectionnel permet d'analyser simultanément les séquences de jonction d'ADN vecteur-hôte amont (gauche) et aval (droite) et est utile dans plusieurs applications de thérapie génique, de cellules souches et de recherche sur le cancer. L'utilisation d'enzymes de motif GTAC (RsaI et CviQI) et l'approche PCR bidirectionnelle améliore considérablement les chances de détection d'un integrome (ou d'une population clonale) par rapport aux dosages à base d'enzymes motifs TC...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermostable DNA polymerase	Agilent	600424	PicoMaxx Polymerase
Thermostable DNA polymerase buffer	Agilent	600424	PicoMaxx Polymerase buffer
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix	New England Biolabs	N0447L	dNTP solution mix (10 mM each)
PCR tubes	VWR International	53509-304	PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps
2 mL microcentrifuge tube	Molecular Bioproducts	3453	microcentrifuge tubes
PCR purification kit	Qiagen	28106
RsaI	New England Biolabs	R0167L	restriction enzyme
CviQI	New England Biolabs	R0639L	restriction enzyme
Buffer A	New England Biolabs	B7204S	NEB CutSmart buffer
DNA Polymerase I large (klenow) fragment	New England Biolabs	M0210L	Blunting
streptavidin beads solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
Binding Solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
Washing Solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
magnetic stand	ThermoFisher	12321D	DynaMag™-2 Magnet
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202L	T4 DNA ligase
10X T4 DNA ligase buffer	New England Biolabs	B0202S	T4 DNA ligase reaction buffer
5X T4 DNA ligase buffer	Invitrogen	46300-018	T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000
UV-Vis spectrophotometer	Fisher Scientific	S06497	Nanodrop 2000
pvuII	new England Biolabs	R0151L	restriction enzyme
sfoI	new England Biolabs	R0606L	restriction enzyme
Buffer B	new England Biolabs	B7203S	NEB buffer 3.1
Nuclease free water	Integrated DNA Technologies	11-05-01-14
Capillary electrophoresis	Qiagen	9001941	QIAxcel capillary electrophoresis
Veriti 96-well Fast Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4375305	PCR Instrument
Rotating wheel (or Roller)	Eppendorf	M10534004	Cell Culture Roller Drums
DNA size marker	Qiagen	929559	QX size marker (100 - 2,500 bp)
DNA size marker	Qiagen	929554	QX size marker (50 - 1,500 bp)
DNA alignment markers	Qiagen	929524	QX DNA Alignment Marker
genomc DNA	Not Available	Not Available	Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments