双向逆转录病毒整合位点PCR方法和定量数据分析工作流程

摘要

该手稿描述了可以同时分析上游和下游载体 - 宿主连接DNA的双向整合位点测定的实验程序和软件分析。双向PCR产品可用于任何下游测序平台。所得数据对于综合DNA靶标的高通量，定量比较是有用的。

摘要

整合位点（IS）测定是逆转录病毒整合位点研究的关键组成部分及其生物学意义。在最近的逆转录病毒基因治疗研究中，IS测定结合下一代测序已被用作细胞跟踪工具来表征共享相同IS的克隆干细胞群体。为了准确比较不同样品内和跨越不同样品的干细胞克隆，检测灵敏度，数据重现性和高通量能力均为最重要的检测标准之一。这项工作为双向IS分析提供了详细的协议和数据分析工作流程。双向测定可以同时排列上游和下游载体 - 宿主结。与常规单向IS测序方法相比，双向方法显着提高了IS检测率和t两端积分事件的表征他瞄准DNA。这里描述的数据分析流程通过多个比较步骤准确地识别和列举相同的IS序列，将IS序列映射到参考基因组上并确定测序误差。使用优化的测定程序，我们最近在恒河猴猕猴移植后发表了数千个造血干细胞（HSC）克隆的详细重新填充模式，首次证实了HSC重新增殖的精确时间点和HSC在功能异质性中的功能异质性灵长类动物系统。以下协议描述了准确识别和量化相同的IS序列的逐步实验过程和数据分析工作流程。

引言

逆转录病毒将其基因组DNA插入各个位点的宿主基因组。这种独特的性质可能有助于癌症和其他形式的病毒发病机制的发展，具有使这些病毒高度适应细胞工程用于基因治疗和基础生物学研究的讽刺意义。病毒整合位点（IS） - 整合了外来DNA（病毒）的宿主基因组上的位置 - 对整合的病毒和宿主细胞的命运具有重要意义。 IS测定已经用于各种生物和临床研究环境，以研究逆转录病毒整合位点选择和发病机理，癌症发展，干细胞生物学和发育生物学^1,2,3,4 。检测灵敏度低，数据重现性差，交叉污染频繁将IS测定应用限制在当前和计划研究中的关键因素。

已经开发了许多IS分析技术。包括连接介导的（LM）聚合酶链反应（PCR） ⁵ ，逆PCR ⁶和线性扩增介导（LAM）PCR ^7的限制性酶基整合位点测定法是最广泛使用的。然而，使用位点特异性限制性酶在IS的检索期间产生偏倚，仅允许在限制性位点附近恢复^4个整合到宿主基因组内的整合子（集成到宿主基因组中的外来DNA） ⁴ 。最近几年也引入了更综合评估载体IS的分析技术。这些测定采用各种策略，包括Mu转座子介导的PCR ⁸ ，非限制性（nr）-LAM PCR ⁹ ，II型限制性内切酶缓冲消化¹⁰ ，机械剪切¹¹和随机六聚体基因PCR（Re-free PCR） ¹² ，以克隆基因组DNA并扩增IS。目前的技术具有不同程度的检测灵敏度，基因组覆盖率，靶特异性，高通量能力，测定程序的复杂性以及检测目标位点相对频率的偏差。鉴于现有测定的不同质量和可以使用的各种目的，应仔细选择最佳测定方法。

该工作提供了详细的实验程序和双向测定的计算数据分析工作流程，通过同时分析整合的靶DNA的上游和下游IS，显着提高检测率和序列定量准确度（参见图1的测定程序示意图）。这种方法也提供了是表征逆转录病毒整合过程的手段（例如，靶位点重复的保真度和上游和下游插入的基因组序列的变化）。其他双向方法主要用于克隆和测序目标DNA 11,13,14的两端。使用公认的LM-PCR方法和计算分析映射以及用于量化上游和下游连接点，广泛优化用于载体标记克隆的高通量和可重复定量的测定。已经证明使用TaqαI酶的双向分析对于干细胞基因治疗临床前研究中的高通量克隆定量是有用的。本文介绍了一种使用更频繁的切割器（RsaI / CviQI-主题:GTAC）的修改方法，使两倍与基于TaqαI的测定相比，他检测到整合素的机会。描述了使用GTAC基序酶用于慢病毒（NL4.3及其衍生物）和γ-逆转录病毒（pMX载体）载体IS分析的详细实验和数据分析程序。测定中使用的寡核苷酸列于表1中 。用于IS序列分析的内部编程脚本在补充文档中提供。

研究方案

1.生成上游（左） - 和下游（右） - 连接序列库

1. DNA接头制备:
   1. 通过加入2μL100μM的LINKER_A寡核苷酸（最终的20μM），2μL的100μM的LINKER_B寡核苷酸（最终的20μM），2μL的5M的NaCl（最终的1M），加入2μL的10μL的接头DNA溶液PCR管中4μL无核酸酶的水。接头序列见表1 。
   2. 在PCR仪器中将接头DNA溶液在95℃孵育5分钟，停止运行程序，并关闭PCR仪器电源。将接头溶液留在仪器中30分钟以缓慢冷却接头DNA。接头DNA溶液可以在4℃下储存。
2. LTR特异性生物素引物延伸:
   1. 使用UV-Vis分光光度计来确定体内基因组DNA的DNA浓度和260/280 nm值或体外实验。使用无核酸酶的水稀释1-2μg样品基因组DNA至终体积为170μL的基因组DNA溶液。
   2. 通过混合10μMHIV-1特异性生物素引物（ 表1中的 L-BP和R-BP:四种慢病毒特异性引物共10μL），将20μL10X热稳定剂DNA聚合酶缓冲液，4μL10mM dNTPs（最终每个dNTP200μM），3μL2.5U /μL热稳定DNA聚合酶和163μL基因组DNA。
      注意:对于gammaretroviral载体（pMX载体），使用两个10μMpMX特异性生物素引物（L-BP和R-BP:总共为10μL）的5μL，而不是上述四种HIV-1特异性生物素引物。
   3. 将溶液分成四个PCR管（每个50μL），并在以下条件下进行单个延伸循环:94℃5分钟，56℃3分钟，72℃5分钟min和4℃储存。
   4. 将所有四个PCR反应物合并到2 mL微量离心管中，并按照PCR纯化试剂盒的PCR纯化程序进行。用50μL洗脱缓冲液（试剂盒中提供的5倍水稀释洗脱缓冲液）洗脱。立即进行步骤1.3.1或将洗脱的DNA储存在-20℃。
3. RsaI和CviQI消化
   1. 通过加入50μL的DNA（来自步骤1.2.4），10μL的10x缓冲液A和2μL（20U）的RsaI酶，准备100μL的消化反应。在PCR仪中37℃孵育1小时。
   2. 向反应中加入1μL（10U）CviQI酶，并在PCR仪中于25℃温育30分钟。立即进行第1.4.1节
4. 钝的结局:
   1. 制备含有2.5μLDNA聚合酶I大（klenow）片段和2μL10 mM dNTP的4.5μL混合液。转移181;将来自步骤1.3.2的DNA样品的混合物的L。总体积为102μL。通过涡旋混合并在25℃下在PCR仪中孵育1小时。立即进行步骤1.6.1。
5. 链霉亲和素珠的制备:
   1. 简单地涡旋链霉亲和素珠溶液，并将50μL转移到新的2 mL微量离心管中。使用磁性支架取出上清液，用200μL的结合溶液洗涤珠子。
   2. 将珠子悬浮在100μL的结合溶液中，并将管放置在离磁架上。立即进行步骤1.6.1。
6. 链霉抗生物素蛋白珠结合:
   1. 将100μL样品DNA（步骤1.4.1）转移到100μL再悬浮珠粒溶液（步骤1.5.2），并通过移液小心混合，以避免溶液发生任何发泡。在旋转轮或滚筒上，室温孵育3小时。
   2. 使用磁性支架捕获珠子并丢弃上清液。在400μL洗涤溶液中洗涤珠子两次，并在400μL1x T4 DNA连接酶缓冲液（从不含核酸酶的水稀释的10X溶液）中洗涤两次。
   3. 将珠子悬浮于200μL的1×T4 DNA连接酶缓冲液中（使用不含核酸酶的水从10X溶液中稀释），并将其放置在磁性架上。立即继续执行步骤1.7.1。
7. 连接器结扎:
   1. 通过混合0.5μL的DNA接头（步骤1.1.2），10μL的10×T4 DNA连接酶缓冲液，20μL的5X T4 DNA连接酶缓冲液（含有25％的聚乙烯），制备400μL的连接反应溶液于2mL的微量离心管中乙二醇），5μLT4 DNA连接酶，164.5μL无核酸酶的水和200μL再悬浮的珠（步骤1.6.3）。将反应管放在旋转轮上，并在RT（22℃）下孵育3小时（或16°CO / N）。
   2. 用洗涤溶液洗涤珠子两次，并用1X耐热DNA聚合酶缓冲液（使用不含核酸酶的水从10x溶液稀释）使用磁性支架两次。
   3. 将珠子重悬于50μL的1×热稳定DNA聚合酶PCR缓冲液中，并将其放置在离磁架上。立即进行第1.8.1步，或在4℃下储存长达一天。
8. 左和右连接DNA的预扩增:
   1. 通过加入10μL10μM1L引物，10μL10μM1R引物，20μL10μM引物Link1（表1），10μL10X热稳定DNA聚合酶缓冲液，4μL 10mM dNTPs（终体积:每个dNTP为200μM），8μL（20U）热稳定DNA聚合酶和88μL无核酸酶的水加入来自步骤1.7.3的再悬浮珠子（50μL）中。
   2. 将反应混合物等分成4个PCR管（每个50μL1; L）并进行PCR，具有以下条件:94℃孵育2分钟; 94℃20秒，56℃25秒，72℃2分钟25个循环;最后在72℃延伸5分钟。
   3. 将所有4个PCR反应混合到2 mL微量离心管中，并按照PCR纯化试剂盒的PCR纯化程序进行。用50μL洗脱缓冲液洗脱。
   4. 使用UV-Vis分光光度计测定DNA浓度和260/280-nm值; DNA可以保存在-20°C直到准备下一步。继续执行步骤1.9.1 / 1.10.1（可选）或直接执行步骤1.11.1 / 1.12.1。
9. 取出左侧内部DNA扩增子（可选）:
   1. 将高达100ng PCR DNA产物从步骤1.8.4转移到2mL微量离心管中，并使用不含核酸酶的水将体积调节至10μL。
   2. 准备专门针对左侧内部D的限制酶反应NA扩增子。
      注意:反应条件可能因酶的选择而异。例如，当从基于NL4.3的慢病毒载体中除去左侧内部DNA时，加入1μL的pvuII ，2μL的缓冲液B和7μL的无核酸酶的水。在PCR仪中37℃孵育1小时。立即进行步骤1.11.1或存储在-20°C。
10. 取出右侧内部DNA扩增子（可选）:
    1. 继续与步骤1.9.1相同。
    2. 准备特异性靶向右侧内部DNA扩增子的限制酶反应。
       注意:例如，从基于NL4.3的慢病毒载体中取出右侧内部DNA时，加入1μLsfoI ，2μL缓冲液B和7μL无核酸酶的水。在PCR仪中37℃孵育1小时。立即进行步骤1.12.1或储存于-20°C。
11. 剩下结特异性扩增:
    1. 通过混合来自步骤1.8.4（或选自步骤1.9.2）的5μLDNA，5μL10μM2L引物（终体积:1μM），5μL10μM引物Link2，制备50μLPCR反应（最终为1μM），5μL10×耐热DNA聚合酶缓冲液，1μL10mM dNTP（终体积:每个dNTP200μM），2μL（5U）热稳定DNA聚合酶和27μL无核酸酶水。
    2. 进行以下条件的PCR:94℃孵育3分钟; 94℃20s，56℃25s，72℃2分钟8-15个循环;最后在72℃延伸5分钟。
       注:扩增的DNA可以储存在-20°C。 *建议循环次数优化。
    3. 按照PCR纯化试剂盒的PCR纯化程序。用50μL洗脱缓冲液洗脱。确定DNA浓度和260/280 nm值。
12. 右结特异性扩增:
    1. 所有方法与"左结特异性扩增"相同（步骤1.11.1-1.11.3），不同之处在于使用不同的引物;在该步骤中使用右侧特异性引物（2R-引物， 参见表1 ）。
13. PCR扩增子长度变异试验:
    1. 通过进行2％琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析PCR扩增子长度变化（ 图2 ）。
       注意:这是确认完成测定程序并基于PCR带图案粗略评估IS模式的重要步骤。来自步骤1.11.3和1.12.3的纯化的PCR扩增子可用于各种DNA测序平台。继续进行经典链终止（Sanger）测序或下一代测序的适当样品制备程序。 DNA可以保存在-20°;C。

2.计算IS序列分析

1. 数据文件的准备:
   1. 准备三个输入数据文件:fasta格式序列数据文件（补充数据中的Test_data.fa），用于向量和链接器序列的搜索图案的tsv文件（补充数据中的Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv）和限制酶信息的tsv文件（Enzyme.tsv补充资料）。
      注意:这些文件是解复用，修剪向量和链接器序列，以及删除内部向量序列所必需的（ 图3A ）。在补充数据中的README.txt文件中提供了实现计算工作流程的详细分步说明。
2. 计算分析:
   1. 运行解复用和修剪脚本。
      注意:原始序列将被处理用于解复用和trimming的载体，接头和引物序列（见补充README.txt文件中的STEP-1）。
   2. 运行映射命令（参见README.txt文件中的STEP-2），使用类似BLAST的对齐工具（BLAT; www.genome.ucsc.edu）将处理的序列映射到参考基因组上。
   3. 运行定量IS分析脚本（请参阅README.txt文件中的STEP-3）。
      注意:将生成两个输出文件（Initial_count_without_homopolymer_correction.txt和Final_count.txt）。有关映射和序列枚举策略的更多详细信息，请参见"README.txt文件中的补充数据和以前的出版物2,15。

结果

双向IS测定为上游（左）和下游（右）载体宿主结（ 图2 ）产生不同大小的PCR扩增子。 PCR扩增子的大小取决于最后的GTAC基序上游和下游的位置。该测定还产生内部DNA PCR扩增子:分别在左侧和右侧连接PCR期间在多巴胺附近的逆转录病毒序列和引物结合位点同时扩增。通过毛细管或琼脂糖（2％）电泳可以显示PCR扩增子条带。

讨论

双向测定能够同时分析上游（左）和下游（右）载体 - 宿主DNA连接序列，并且可用于许多基因治疗，干细胞和癌症研究应用。与以前的基于TCGA基序的酶（ TaqαI ）为基础的检测2,15和其他方法相比，使用GTAC基序酶（RsaI和CviQI）和双向PCR方法显着提高了检测内含子（或克隆群体）的机会单向LM-PCR方法⁵ 。双向测定改善了IS的分析，特别是在临床或小动物模型研究中经常?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermostable DNA polymerase	Agilent	600424	PicoMaxx Polymerase
Thermostable DNA polymerase buffer	Agilent	600424	PicoMaxx Polymerase buffer
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix	New England Biolabs	N0447L	dNTP solution mix (10 mM each)
PCR tubes	VWR International	53509-304	PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps
2 mL microcentrifuge tube	Molecular Bioproducts	3453	microcentrifuge tubes
PCR purification kit	Qiagen	28106
RsaI	New England Biolabs	R0167L	restriction enzyme
CviQI	New England Biolabs	R0639L	restriction enzyme
Buffer A	New England Biolabs	B7204S	NEB CutSmart buffer
DNA Polymerase I large (klenow) fragment	New England Biolabs	M0210L	Blunting
streptavidin beads solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
Binding Solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
Washing Solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
magnetic stand	ThermoFisher	12321D	DynaMag™-2 Magnet
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202L	T4 DNA ligase
10X T4 DNA ligase buffer	New England Biolabs	B0202S	T4 DNA ligase reaction buffer
5X T4 DNA ligase buffer	Invitrogen	46300-018	T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000
UV-Vis spectrophotometer	Fisher Scientific	S06497	Nanodrop 2000
pvuII	new England Biolabs	R0151L	restriction enzyme
sfoI	new England Biolabs	R0606L	restriction enzyme
Buffer B	new England Biolabs	B7203S	NEB buffer 3.1
Nuclease free water	Integrated DNA Technologies	11-05-01-14
Capillary electrophoresis	Qiagen	9001941	QIAxcel capillary electrophoresis
Veriti 96-well Fast Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4375305	PCR Instrument
Rotating wheel (or Roller)	Eppendorf	M10534004	Cell Culture Roller Drums
DNA size marker	Qiagen	929559	QX size marker (100 - 2,500 bp)
DNA size marker	Qiagen	929554	QX size marker (50 - 1,500 bp)
DNA alignment markers	Qiagen	929524	QX DNA Alignment Marker
genomc DNA	Not Available	Not Available	Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments